כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח כראוי ניצני פרחים, פרחים וסיליקיות צעירות. וקרחת ההרכבה השלמה שלאחר מכן לטכניקות צביעה ותצפית מגוונות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ייצור הצמחים המיניים.

כגון ניתוח מוטנטי קבוע או כל כשל סביבתי וניסויי בהתפתחות ותפקוד הפרחים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לאפשר סינון קל ומהיר של שלבי התפתחות רבים בו זמנית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי דיסקציה של איברי פרחים מכיוון שהם דורשים ידע מוקדם באנטומיה של פרחים ומיומנויות דיסקציה.

כדי להתחיל, השתמש במספריים קטנים כדי להסיר פרחים מצמחים מסונכרנים. והניחו אותם מיד בצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים, המכילים קיבוע מתאים. לאחר מכן, הסר את הקיבוע והוסף מספיק אתנול של 70% כדי לכסות לחלוטין את הדגימות.

החזר את הדגימות לארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. לאחר מכן מלאו את השען באתנול 70% טרי והניחו אותה בצלחת פטרי קטנה לתמיכה. לאחר מכן הנח את התפרחת בכוס של השען וודא שהיא מכוסה לחלוטין באתנול.

בעזרת מלקחיים ומזרק המצויד במחט, נתחו את הפרח מתחת למיקרוסקופ הסטריאו על ידי קריעת הגביעים, עלי הכותרת והאבקנים. לאחר מכן הניחו את השען בצד והשתמשו בשקופית זכוכית לניתוח הסופי. העבר את הדגימה להחלקה והוסף 10 מיקרוליטר של אתנול 70% טרי.

ערוך חתכים מכל צד של כף היד, וסובב אותו לפי הצורך. לאחר מכן הסר בעדינות את השסתומים כדי לחשוף את הביציות. בצע חתך קטן וחד כדי לנתק מחצית מהרקמה המשדרת מכלי הקיבול והשתמש במלקחיים ובמחט כדי לקרוע את שני החצאים.

הסר את סגנון הסטיגמה ואת הפדונקל עם חתכים חדים. בעזרת המלקחיים והמחט הופכים בעדינות ומסדרים את הביציות שעדיין מחוברות לקבלת שתי שורות מקבילות. השתמש בפיסת נייר סופג קטנה כדי להסיר אתנול מהדגימה על שקופית הזכוכית.

לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת ניקוי לשקופית. בעזרת זוג מזרקים עם מחטים היפודרמיות, מקם את הדגימות והסר את כל בועות האוויר שנותרו. לאחר מכן, הנח בעדינות פתק כיסוי על המגלשה והמתן עד שתמיסת הניקוי תמלא את החלל בין החלקה לדוגמא.

הנח את השקופית במחזיק שקופיות והשאיר אותה מתחת למכסה האדים. אז בואו נבנה ניצני פרחים טריים שנקטפו שעומדים להיפתח עם אנתרים שאינם מתפרקים. לאחר מכן הכינו צלחת 96 באר עם מספיק תמיסת אלכסנדר כדי להטביע את ניצני הפרחים במלואם.

הסר את עלי הגביע ועלי הכותרת כדי לחשוף את האנתרים ולטבול אותם בתמיסת אלכסנדר. הניחו לצלחת לשבת מתחת למכסה האדים למשך שעה עד שלוש שעות. לאחר מכן החליפו את תמיסת אלכסנדר בתמיסת ארבע וחצי של הר ודגרו על הצלחת מתחת למכסה האדים למשך הלילה.

למחרת השתמש במלקחיים כדי להעביר בזהירות את הניצנים שנוקו למגלשה חדשה. לאחר מכן, נתחו את האבקנים והוציאו את כל שאר הרקמות מהדגימות. לאחר מכן המשיכו עם ניקוי על בסיס כלורל הידרט וצביעת ניקוי משולבת באמצעות תמיסת ארבע וחצי של הר.

ראשית העבירו את הפרח מכוס השען למגלשה והשתמשו בנייר סופג כדי להסיר עודפי אתנול. הוסף חמישה עד 10 מיקרוליטר של תמיסת DAPI. בעזרת שני מזרקים עם מחטים תת-עוריות, נתחו את האבקנים והסירו את כל שאר איברי הפרח.

לאחר מכן שחרר את גרגרי האבקה לתמיסת DAPI. הסר את כל הפסולת מהאבקן מהמגלשה וודא שרק גרגרי האבקה יישארו על המגלשה. הסרת כל שאריות האבקנים מהמגלשה היא השלב הקריטי ביותר להסרת אקסין.

יש להשאיר רק גרגרי אבקה בין השקופית להחלקת הכיסוי. לאחר מכן, הנח פתק כיסוי על שקופית מיסב הדגימה והוסף את הכמות המינימלית של תמיסת DAPI הדרושה למילוי החלל בין המגלשה להחלקת הכיסוי. הנח אצבע מורה בעדינות על החלקת הכיסוי ובצע תנועת החלקה קצרה ומהירה.

הנח את השקופית בקופסה אנושית בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. לאחר מכן התבונן במגלשה תחת פלורסנט שדה רחב או מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך 24 שעות. העבירו את הדגימה המנותחת מהזכוכית של השען לצלחת זכוכית עם חללים מלאים ב-1% SDS ותמיסת נתרן הידרוקסיד 0.2.

דוגרים לילה בטמפרטורת החדר. תמיסת הנתרן הידרוקסיד SDS תנקה במהירות את הדגימות, ותגרום להן להיראות שקופות תוך מספר דקות. שטפו בזהירות את הדגימה במים והניחו אותה על שקופית נקייה.

לאחר מכן הוסף לשקופית 20 עד 40 מיקרוליטר של תמיסת מכתים. בהתאם לאיבר הפרחי שיש לנתח ולכישורי החוקר, טיפול DS זה יכול להתבצע לפני, עבור חוקרים מנוסים או לאחר שלב הדיסקציה עבור חוקרים פחות מנוסים. לאחר מכן, הניחו תלוש כיסוי על המגלשה והקפידו לא לרסק את התכשיר.

לאחר מכן מניחים את כל השקופיות המוכנות לקופסה אנושית מכוסה בנייר אלומיניום ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. לבסוף, התבונן בדגימה תחת תפרחת שדה רחב או מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר הליך הדיסקציה, המתואר בפרוטוקול, מסירים רקמות מיותרות שעלולות להפריע לתצפיות ומתקבלות תמונות מפורטות יותר.

בהתאם למטרה, ניתן להשתמש בצביעת כלורל הידראט כדי לאפיין התפתחות מוקדמת של פרחים ברמת ניצני הפרח השלמה, מיוזה ויצירת מיקרו-גומדליה באנתר, התפתחות ביצית מוקדמת ואפיון תא האם של המגה-נבגים, התפתחות נקבית של גו-מד, או אפילו פלישת צינור האבקה לרשת המרכזית. שילוב של צביעת אלכסנדר וניקוי ארבע וחצי של הר, מאפשר להעריך הפלות אבקה בתוך לוקול נתון או אנתר בכללותו. בעוד שגרגרי אבקה ברי קיימא מראים ציטופלזמה אדומה, אלה שהופלו מראים ציטופלזמה ריקה ובסופו של דבר הם בעלי צורה לא סדירה ומרוסקים לחלוטין.

הסרת האקסין מביאה לעוצמת צביעה מוגברת של גרעינים ופרטים גבוהים יותר של ארגון הכרומטין. שימוש וניקוי נתרן הידרוקסיד SDS לפני הצביעה הפך את התפרחת לשקופה. והביא לצביעה גבוהה יותר של קלוז ברקמות הפרחים.

זה חשף בדרך כלל הצטברות קלוז שקשה לראות. כמו שכבת הקלוז המפרידה בין התא הגנרטיבי לתא הצומח. גם כאשר גרגרי האבקה עדיין היו כלולים בתוך האנתר.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקות אלה תוך פחות מ-48 שעות, אם הן מבוצעות כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהתוצאות תלויות במידה רבה בהכנת דגימה טובה, כגון שימוש בקיבוע המתאים, ביצוע הדיסקציה כראוי ובידוד הרקמה המעניינת בשקופית.