שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

המטרה הכוללת של שיטות אלו היא להשיג תובנות נוספות לגבי השפעות הטיפול על הזיהומיות או על השלמות של הקפסיד של נורו-וירוס אנושי. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום של השבתה של נגיפים שאינם מעטפתים, כגון מה קורה ליכולתו של קפסיד הנגיף להדביק תא לאחר טיפול נתון.

היתרון העיקרי של שיטות אלה הוא שהן יכולות לספק תובנה מכניסטית נוספת לגבי פעולתו של טיפול נתון על הנגיף. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אסטרטגיות להשבתה של norovirus אנושי, קיים לה פוטנציאל ליישום גם בנגיפים לא מעטופים אחרים, כגון rhinovirus או hepatitis A.

כדי להתחיל, יש לדלל חלבון קפסיד עיקרי מטוהר של נורו-וירוס אנושי, המורכב לקפסידים, לריכוז של 50 micrograms per milliliter ב-1X phosphate buffered saline. השתמשו בנפח מקסימלי של 15 microliters בתוך מבחנות PCR בודדות בעלות מכסה.

יש לוודא שהמבחנה מכילה לפחות 600 nanograms של capsid ושישנם 600 nanograms של capsid לכל שילוב של ליגנד לטיפול. לאחר מכן, חממו מראש את הטרמוסייקלר לטיפול החום הרצוי. לאחר מכן, חממו מראש טרמוסייקלר נוסף ל-4 °C לצורך קירור מיידי.

העבירו את המבחנות עם תמיסת הקפסיד לתרמוסייקלר למשך הזמן הרצוי. לאחר החימום, העבירו מיד את המבחנות לסייקלר שקולל מראש ל-4 °C למשך חמש דקות. סובבו את המבחנות קצרות בצנטריפוגה כדי להוריד את כל הטיפות לתחתית המבחנה.

דללו את תמיסות הקפסידים המטופלות ואת ה-PBS לריכוז של 3 µg/mL. ודאו כי ישנם לפחות 200 µL של קפסיד מטופל מדולל. לאחר מכן, העבירו 100 µL מתמיסת הקפסיד לכל באער, תוך וידוא של לפחות שני באערים לכל טיפול. בנוסף, כללו שני באערי ביקורת עם 100 µL של PBS עבור כל ליגנד; הדבר מספק את בליעת הרקע של הבדיקה. כסו את הפלטה במכסה ואטמו את הקצוות בסרט פאראפין כדי להפחית התאיידות. השאירו את הפלטה למשך הלילה באינקובטור רועש בטמפרטורה של 4 °C, או למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, הוצא את תמיסות הקפסיד המטופלות מהפלטה. לאחר מכן, הוסף 200 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) לכל באער. הדגר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או במצב אטום ב-4 °C למשך הלילה.

בינתיים, דללו את האפטמר הביוטינילי לריכוז של one micromolar במים נקיים מנוקלאז (nuclease-free water). ודאו שיש מספיק תמיסה לנפח כולל של 200 microliters עבור כל טיפול.

בנוסף, יש לדלל את ה-HPGA הביוטינילי שהנבחר לריכוז של 30 microliters per milliliter בתוך תמיסת החסימה. שוב, ודאו כי יש מספיק תמיסה לנפח כולל של 200 microliters עבור כל טיפול.

לאחר האינקובציה, הסר את תמיסת החסימה (blocking buffer) ושטוף את הפלטה שלוש פעמים עם 200 µL של PBST לכל באר. ייבש את שאריות הנוזלים על ידי הטרקה של הפלטה כשהיא הפוכה על מגבות נייר סטריליות. לאחר מכן, הוסף 100 µL לכל באר של תמיסות קישור הליגנד, תוך הבטחה כי קיימות שתי בארות לכל שילוב של טיפול בחום וליגנד, והדגר את הפלטה המכוסה על שייקר אורביטלי במהירות של כ-60 RPM למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר שטיפת הבארים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוסף 100 µL לבאר של streptavidin horseradish peroxidase בריכוז 0.2 µg/mL ב-PBS.

דגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר תוך ניעור עדין במנער אורביטלי לפני שטיפת הבארים שוב. לאחר מכן, לאחר שטיפה נוספת, הוסיפו 100 µL של מצע TMB לכל באר והמתינו להתפתחות הצבע במשך חמש עד 15 דקות. עקבו אחר הופעת הצבע בבארים.

יש להקפיד על זמן פיתוח עקבי בין פלטות חוזרות, ולהיות מודעים לטווח הבליעה של קורא הפלטות שבו נעשה שימוש. יש לעצור את פיתוח התגובה באמצעות 100 µL לבאר של חומצה זריקה בריכוז 1 M. יש לקרוא את הפלטה באופן מיידי באורך גל של 450 nm.

צרו נוהל עבודה סטנדרטי (SOP) חדש לגודל בתוכנת מכשיר ה-DLS כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, בחרו בחץ ההפעלה הירוק בתוך התוכנה ותנו שם לדגימה.

דללו את החלקיקים דמויי-הנגיף (VLPs) שעברו טיפול בחום ביחס של 1 ל-10 ב-1X PBS כדי להגיע לריכוז סופי של 5 µg/mL. לאחר מכן, סננו את הדגימה דרך מסנן בעל גודל נקבים של 1 מיקרון כדי להסיר חלקיקי אבק. שיטת ה-DLS רגישה מאוד לאבק, שכן חלקיקים גדולים מפזרים הרבה יותר אור מחלקיקים קטנים. העבירו 50 µL של ה-VLPs המדוללים לקיווטה חד-פעמית לנפח קטן. הכניסו את הקיווטה לתא הדגימות של המכשיר. הפעילו את המדידה והשתמשו בלשוניות ה-correlogram cumulant fit וה-expert advice כדי להעריך את איכות הנתונים. במהלך המדידה, ודאו כי ערך ה-poly dispersity של האינדקס נמוך מ-0.3, דבר המעיד על מדידה איכותית.

בלשונית ה-Multiview, ודאו שמקדם המתאם קבוע וקרוב לאחד, אך אינו עולה על אחת בפרק זמן קצר, ויורד בחדות לאפס בפרק זמן מאוחר יותר, דבר המאפיין את גודל החלקיקים. השתמשו בלשונית ייעוץ המומחים (expert advice) כדי לקבל משוב על איכות הנתונים במהלך המדידות. עם סיום המדידה, בדקו שוב שערך ה-poly disperse של האינדקס נמוך מ-0.3.

וודאו שקו התאמה של המומנטים (cumulant fit) עוקב מקרוב אחר נקודות הנתונים בלשונית ה-cumulants fit. צרו פרוצדורה סטנדרטית לתפעול (SOP) של גודל חדש בתוכנת מכשיר ה-DLS כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. בחרו בחץ ההפעלה בתוך התוכנה כדי לפתוח ולשיים דגימה חדשה, והמתינו עד שהמכשיר יגיע לשיווי משקל טמפרטורי.

העבירו את תרחיף ה-VLP לקובטה קטנה מקוורץ, תוך הימנעות מיצירת בועות ובעזרת פיפוט איטי כנגד דופן הקובטה. לאחר שהמכשיר הגיע לשיווי משקל תרמי, הכניסו את הקובטה לתא הדגימה. המתינו 10 שניות עד שטמפרטורת הדגימה תתייצב, לאחר מכן התחילו את ההרצה ובמקביל הפעילו טיימר.

עצרו את הטיימר בסיום המדידה הראשונה. הגדירו זמן זה כנקודת הזמן הראשונה. קבלו את נקודות הזמן הבאות מזמני המדידה שנרשמו על ידי התוכנה.

בצע טיפול בחום כפי שנעשה קודם לכן, למעט החלפת ה-PBS ב-10 millimolar HEPES, pH 7.4, ואל תדלל את הקפסידים לאחר הטיפול. לאחר מכן, טפטף באמצעות פיפט את כל טיפת תמיסת הקפסידים המטופלת בנפח 15 microliter על סרט פראפין. אחוז בקצה הרשת בעזרת פינצטה, כך שהפינצטה תיסגר על הקצה כדי להחזיק את הרשת, והנח את הרשת כשהצד הפחמני פונה כלפי מטה על גבי טיפת התמיסה המטופלת.

השאירו את הרשת לדגירה במשך 10 דקות כדי לאפשר לקפסיד להיקשר לרשת. בהתאם לדרגת הניקיון של תכשיר הקפסיד, הוסיפו שטיפות של תמיסת HEPES בצורת טיפות של 10 עד 15 µL המוצבות בשורה לאחר טיפת הקפסיד המטופלת. לאחר 10 דקות, הרימו את הרשת יחד עם הטיפה.

הנח את הרשת כמעט בניצב לחתיכת נייר סינון כדי לספוג את הטיפה. לאחר מכן, השתמש ברשת כדי להרים טיפה של 10 עד 15 µL של HEPES buffer והחזק אותה למשך 30 שניות. לאחר 30 שניות של זמן שטיפה, ספוג את הנוזלים בעזרת חתיכת נייר סינון נוספת.

בשלב הבא, הניחו טיפה של 15 µL של תמיסת uranyl acetate בריכוז 2% על סרט פראפין באזור ריק. אספו את טיפת ה-uranyl acetate באמצעות הרשת והחזיקו אותה למשך 45 שניות. לאחר מכן, ספגו את ה-uranyl acetate העודף תוך הקפדה להסיר את מרבית התמיסה.

הניחו את הרשת כאשר צד הפחמן פונה כלפי מעלה על פיסת נייר סינון, תוך הקפדה שהרשת לא תידבק ללחות שעל הפינצטה. לאחר מכן, הניחו את נייר הסינון עם הרשת עליו בתוך צלחת פטרי מזכוכית פתוחה. לאחר חזרה על תהליך זה עבור כל הטיפולים, הניחו את חצאי צלחות הפטרי עם הרשתות בתוך דסיקטור למשך לילה כדי לייבשן לפני התצפית ב-TEM.

הגרף הבא מציג את ההפחתה ביכולת הקישור של קפסידים של נורו-וירוס אנושי לאורך זמן כאשר הם מטופלים ב-68 °C. כפי שניתן לראות, הקישור ל-HPGA הוא האות הראשון שנעלם לחלוטין. בנקודה זו, ההנחה היא שרובם המכריע של הקפסידים בתמיסה איבדו את היכולת להיקשר ל-HPGAs של תאי המארח, ולכן אינם יכולים להיספג אל תוך התא.

קישור האפטמר משקף את זה של HBGA, אם כי נדרש טיפול תרמי ממושך מעט יותר כדי להסיר את האות. מוצגת כאן עקומת מקדם מתאם DLS המייצגת נתונים באיכות טובה. בזמן קרוב לאפס, הקורלוגרמה קבועה בערך קרוב לאחד, אך נמוכה ממנו.

לאחר מכן היא צונחת בחדות לאפס בזמן האופייני לגודל החלקיק. ניתן ככל הנראה לסמוך על תוצאות הגודל מניסוי זה. לעומת זאת, עקומת מקדם מתאם זו מייצגת נתונים באיכות נמוכה.

הקורלוגרם מתחיל בערך שמעל אחד ודועך בהדרגה לאפס. אין להשתמש בתוצאות מניסוי זה. כאן, נתוני גודל החלקיקים מראים פרופיל אגרגציה ברור עבור קפסידים שטופלו ב-68 °C, כאשר אגרגטים-על נוצרים לאחר כ-20 דקות.

הזמן שבו מתרחש תהליך הסופר-אגרגציה (super aggregation) מאפיין את הרגישות של ה-VLPs לטיפול זה. איור זה מציג את תוצאות ה-TEM עבור טיפול בחום של קפסידים של נורו-וירוס אנושי. כאן, הקפסידים טופלו בטמפרטורה של 60 עד 80 מעלות צלזיוס, משמאל לימין.

כפי שניתן לראות, מורפולוגיית הקפסיד משתנה בבירור בעקבות הטיפול, כאשר הקפסידים עוברים אגרגציה ודנטורציה. תופעה דומה נצפתה עבור קפסידים שטופלו ב-68 degrees Celsius למשך אפס עד 25 דקות.

ברגע ששולטים בטכניקות אלו, ניתן לבצען בטווח של שעה עד 24 שעות, במידה והן מבוצעות כראוי.

לאחר פיתוחה, סיפקה טכניקה זו נתיב נוסף לחוקרים בתחום הוירולוגיה של מזון לחקור את המנגנונים וההשפעות של אינאקטיבציה על הקפסיד של נורו-וירוסים אנושיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון real-time RT-PCR עם ובלי טיפול מקדים ב-RNase, SDS page של קפסידים ויראליים, ובדיקות פלאק (plaque assays) עם וירוסים חליפיים הניתנים לתרבית, כדי לקבל תמונה כוללת ומלאה יותר של ההפחתה הוויראלית לאחר טיפול נתון. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן שבו ניתן להשתמש בקישור ליגנדים, פיזור אור דינמי (dynamic light scattering) ומיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת (transmission electron microscopy) כדי להשיג תובנות מנגנוניות נוספות לגבי השפעות טיפול האינאקטיבציה על הקפסיד של הנורו-וירוס האנושי.

אל תשכחו כי עבודה עם חלק מהריאגנטים המשמשים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי והקפדה על נהלי הבטיחות המקובלים במעבדה, בעת ביצוע פרוצדורה זו.