שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

המטרה הכוללת של שיטות אלה היא להשיג תובנה נוספת לגבי השפעות הטיפול על ההדבקה או השלמות של קפסיד הנורו-וירוס האנושי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההשבתה הנגיפית ללא מעטפת. כמו למשל מה קורה ליכולתו של הקפסיד הנגיפי להדביק תא לאחר טיפול נתון.

היתרון העיקרי של שיטות אלו הוא שהן יכולות לספק תובנה מכניסטית נוספת לגבי פעולתו של כל טיפול נתון בנגיף. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אסטרטגיות השבתת נורו-וירוס אנושיות, יש לה גם פוטנציאל להיות מיושם על נגיפים אחרים שאינם עטופים כגון רינו-וירוס או הפטיטיס A.To להתחיל, לדלל חלבון קפסיד נורו-וירוס אנושי מטוהר המורכב בקפסידים ל-50 מיקרוגרם למיליליטר בתמיסת מלח 1X פוספט. השתמש בנפח מרבי של 15 מיקרוליטר בצינורות ה-PCR המכוסים הבודדים.

ודא שהצינור מכיל לפחות 600 ננוגרם של קפסיד ושיש 600 ננוגרם של קפסיד לכל שילוב ליגנד טיפול. לאחר מכן, מחממים את התרמו-סייקלר לטיפול בחום הרצוי. לאחר מכן, מחממים תרמו-סייקלר נוסף לארבע מעלות צלזיוס לקירור מיידי.

הוסף את הצינורות עם תמיסת הקפסיד לתרמו-סייקלר למשך הזמן הרצוי. לאחר החימום, העבירו מיד את הצינורות למחזור ארבע מעלות צלזיוס מקורר מראש למשך חמש דקות. סובב בקצרה את הצינורות בצנטריפוגה כדי להביא את כל הטיפות לתחתית הצינור.

לדלל את תמיסות הקפסיד המטופלות ואת PBS לשלושה מיקרוגרם למיליליטר. ודא שיש לפחות 200 מיקרוליטר של קפסיד מטופל מדולל. לאחר מכן, יש למרוח 100 מיקרוליטר של תמיסת קפסיד על כל באר ולוודא שיש לפחות שתי בארות לכל טיפול.

בנוסף, כלול שתי בארות בקרה עם 100 מיקרוליטר PBS לכל ליגנד. זה מספק את ספיגת הרקע של הבדיקה. מכסים את הצלחת במכסה ואוטמים את הקצוות בסרט פרפין כדי להפחית את האידוי.

השאירו את הצלחת למשך הלילה על אינקובטור רועד בארבע מעלות צלזיוס או למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר את תמיסות הקפסיד המטופלות מהצלחת. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר לכל באר של מאגר חסימה.

דוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או אטומים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. בינתיים, יש לדלל את האפטמר הביוטיני למיקרוטולר אחד במים נטולי נוקלאז. ודא שיש מספיק תמיסה ל-200 מיקרוליטר בסך הכל לכל טיפול.

כמו כן, יש לדלל את ה-HPGA הביוטינילי שנבחר ל-30 מיקרוליטר למיליליטר במאגר החסימה. שוב, ודא שיש מספיק פתרון לנפח כולל של 200 מיקרוליטר לכל טיפול. לאחר הדגירה, הסר את המאגר החוסם ושטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר לבאר PBST.

טפחו על הצלחת הפוכה על מגבות נייר סטריליות כדי לייבש את שאריות הלחות. לאחר מכן, ב-100 מיקרוליטר לבאר של תמיסות קשירת הליגנד המבטיחות שיש שתי בארות לכל שילוב ליגנד לטיפול בחום, דגרו את הצלחת המכוסה על שייקר אורביטלי בכ-60 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הבארות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של 0.2 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטווידין, חזרת, פרוקסידאז ו- PBS.

יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין על שייקר אורביטלי לפני שטיפת הבארות שוב. לאחר מכן, לאחר שטיפה נוספת, הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של מצע TMB ואפשר לצבע להתפתח במשך חמש עד 15 דקות. שימו לב לבארות לצבע.

הקפד לפתח באופן עקבי באותו זמן בין לוחות משוכפלים ולהיות מודע לטווח הספיגה של קורא הלוחות בו נעשה שימוש. עצור את התפתחות התגובה עם 100 מיקרוליטר לבאר של חומצה זרחתית טוחנת אחת. קרא מיד את הצלחת ב -450 ננומטר.

צור נוהל הפעלה סטנדרטי בגודל חדש בתוכנת מכשיר DLS כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, בחר את חץ ההפעלה הירוק בתוך התוכנה ותן שם לדוגמא. לדלל את החלקיקים דמויי הנגיף שטופלו בחום או VLPs אחד עד 10 ב-1X PBS לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר.

לאחר מכן, סנן את הדגימה בגודל נקבוביות מיקרון אחד כדי להסיר חלקיקי אבק. DLS רגיש מאוד לאבק, מכיוון שחלקיקים גדולים פיזרו הרבה יותר אור מחלקיקים קטנים. העבירו 50 מיקרוליטר של ה-VLPs המדוללים לקובטה חד פעמית בנפח קטן.

הכנס את הקובט לתא הדגימה של המכשיר. התחל את הריצה והשתמש בכרטיסיות התאמה מצטברת של קורלוגרמה וייעוץ מומחה כדי להעריך את איכות הנתונים. במהלך הריצה, בדוק שפיזור הפולי של ערך האינדקס קטן מ-0.3 המייצג מדידת איכות.

בכרטיסייה multiview, ודא שמקדם המתאם קבוע וקרוב אך לא יותר מאחד בזמן קצר ויורד בחדות לאפס בזמן מאוחר יותר, האופייני לגודל החלקיקים. השתמש בכרטיסיית ייעוץ מומחה לקבלת משוב על איכות הנתונים במהלך המדידות. לאחר השלמת המדידה, בדוק שוב בפיזור הפולי של ערך האינדקס קטן מ-0.3.

ודא שקו ההתאמה המצטבר עוקב מקרוב אחר נקודות הנתונים בכרטיסיה התאמה מצטברת. צור נוהל הפעלה סטנדרטי בגודל חדש בתוכנת מכשיר DLS כמפורט בפרוטוקול הטקסט. בחר את חץ ההפעלה בתוך התוכנה כדי לפתוח ולתת שם לדגימה חדשה ולאפשר למכשיר להגיע לשיווי המשקל בטמפרטורה.

העבירו את מתלה ה-VLP לקובט קוורץ בנפח קטן הימנעו מבועות ופיפטה לאט על דופן הקובטה. לאחר שהמכשיר הגיע לשיווי משקל בטמפרטורה, הכנס את הקובט לתא הדגימה. לאחר המתנה של 10 שניות עד שטמפרטורת הדגימה תתאזן, התחל את הריצה והפעל בו זמנית טיימר.

עצור את הטיימר בסוף המדידה הראשונה. קחו את הזמן הזה כנקודת הזמן הראשונה. השג נקודות זמן עוקבות מזמני המדידה שנרשמו על ידי התוכנה.

בצע טיפול בחום כמו קודם למעט החלפת PBS בערימות של 10 מילימולריות, pH 7.4 ואל תדלל עוד יותר את הקפסידים לאחר הטיפול. לאחר מכן, פיפטה את כל טיפת 15 המיקרוליטר של תמיסת הקפסיד המטופלת על סרט פרפין. תפסו את קצה הרשת בפינצטה ואפשרו להם להיסגר בקצה כדי להחזיק את הרשת ולהניח את צד הפחמן כלפי מטה על גבי טיפת התמיסה המטופלת.

הניחו לרשת לדגור במשך 10 דקות כדי לאפשר לקפסיד להיצמד לרשת. בהתאם לטוהר הכנת הקפסיד, הוסף שטיפות של תמיסת הערימה בצורה של 10 עד 15 טיפות מיקרוליטר המונחות בתור לאחר טיפת הקפסיד המטופלת. לאחר 10 דקות, הרם את הרשת עם הטיפה.

הנח את הרשת כמעט בניצב לפיסת נייר סינון כדי לנדף את הטיפה. לאחר מכן, השתמש ברשת כדי להרים את הטיפה של 10 עד 15 מיקרוליטר ערימות מאגר והחזק אותה למשך 30 שניות. לאחר 30 שניות של זמן הכביסה יש להניף עם פיסת נייר פילטר נוספת.

לאחר מכן, הניחו טיפה של 15 מיקרוליטר של תמיסת אורניל אצטט של שני אחוזים על סרט הפרפין באזור ריק. הרם את טיפת האורניל אצטט עם הרשת והחזק אותה למשך 45 שניות. לאחר מכן, נדפו את האורניל אצטט והקפידו להסיר את רוב התמיסה.

הנח את צד הפחמן של הרשת כלפי מעלה על פיסת נייר סינון והקפיד שהרשת לא תידבק ללחות בפינצטה. לאחר מכן, הניחו את נייר הסינון עם הרשת עליו בצלחת פטרי מזכוכית פתוחה. לאחר חזרה על תהליך זה עבור כל הטיפולים, הניחו את חצאי צלחת הפטרי עם הרשתות במייבש למשך הלילה לייבוש לפני התבוננות ב-TEM.

הגרף הבא מציג ירידה ביכולת הקישור של קפסידי נורו-וירוס אנושיים לאורך זמן כאשר הם מטופלים ב-68 מעלות צלזיוס. כפי שניתן לראות, קשירת HPGA היא האות הראשון שנעלם לחלוטין. בשלב זה, ההנחה היא שהרוב הגדול של הקפסידים בתמיסה איבדו את היכולת לקשור HPGA של תא מארח ולכן לא ניתן להפנים אותם בתא.

קשירת אפטמר משקפת את זו של HBGA, אם כי נדרש מעט יותר טיפול בחום כדי להסיר את האות. מוצגת כאן עקומת מקדם מתאם DLS המייצגת נתונים באיכות טובה. בזמן קרוב לאפס, הקורלוגרמה קבועה בערך קרוב ל-1, אך מתחת ל-1.

לאחר מכן הוא יורד בחדות לאפס בזמן האופייני לגודל החלקיקים. סביר להניח שניתן לסמוך על תוצאות הגודל מניסוי זה. לעומת זאת, עקומת מקדם מתאם זו מייצגת נתונים באיכות ירודה.

הקורלוגרמה מתחילה בערך מעל אחד ויורדת בהדרגה לאפס. אין להשתמש בתוצאות מניסוי זה. כאן, נתוני גודל החלקיקים מראים פרופיל צבירה ברור עבור קפסידים שטופלו ב-68 מעלות צלזיוס עם אגרגטים סופר שנוצרו לאחר כ-20 דקות.

הזמן שבו מתרחשת אגרגציית העל אופייני לרגישות של ה-VLPs לטיפול זה. איור זה מדמיין את תוצאות TEM לטיפול בחום בקפסידים של נורו-וירוס אנושי. כאן, הקפסידים טופלו בטמפרטורה של 60 עד 80 מעלות צלזיוס משמאל לימין.

כפי שניתן לראות, מורפולוגיה של קפסידים משתנה בבירור עם הטיפול כאשר הקפסידים מצטברים ומתפרקים. תופעה דומה נצפתה עבור קפסידים שטופלו ב-68 מעלות צלזיוס למשך אפס עד 25 דקות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקות אלה תוך שעה עד 24 שעות אם הן מבוצעות כראוי.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סיפקה דרך נוספת לחוקרים בתחום וירולוגיה של מזון לחקור את המנגנונים וההשפעות של השבתה על הקפסיד של נורו-וירוסים אנושיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו RT-PCR בזמן אמת עם ובלי טיפול מקדים ב-RNase, דף STS של קפסידים נגיפיים ובדיקות פלאק עם וירוסים חלופיים הניתנים לגידולו כדי לקבל תמונה כוללת מלאה יותר של הפחתת הנגיף לאחר טיפול נתון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בקשירת ליגנד, פיזור אור דינמי ומיקרוסקופ אלקטרונים שידור כדי לקבל תובנות מכניסטיות נוספות לגבי ההשפעות של טיפול בהשבתת על קפסיד הנורו-וירוס האנושי.

אל תשכח שעבודה עם חלק מהריאגנטים המשמשים עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי וביצוע שיטות עבודה מומלצות לבטיחות במעבדה בעת ביצוע הליך זה.