שיטה נוחה עבור חילוץ וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה של נוירוטרנסמיטורים קטכולאמין מטבוליטים שלהם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע שלושה נוירוטרנסמיטורים מונואמין ושניים מהמטבוליטים שלהם בשתן של תינוקות בו זמנית באמצעות מיצוי נוח של פאזה מוצקה יחד עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם זיהוי אלקטרוכימי. שיטה זו יכולה לחזות ולקבוע תרכובות מטרה לא יציבות בדגימה שלמה עם הפעלה קלה בזמן קצר. ניתן לנקות מראש את הדוגמאות שלך בקלות על ידי מניין פנים מוצק צר עמוס בסיבים, וניתן להעשיר, להמיס ולזהות בקלות את האנליטים בדגימה במערכת גילוי אלקטרוכימית.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר הבנו שמיצוי וניתוח של נוירוטרנסמיטורים קטכולאמין בנוזלים ביולוגיים הוא קריטי להערכת התפקוד העמיד והמחלות הנלוות. אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש להימנע מחשיפה לאור, וזמן הטיפול צריך להיות קצר ככל האפשר. כדי להדגים את ההליך, יש לנו את Lanlan Wei ו-Qing Han, שני דוקטורנטים מהמעבדה שלנו.

כדי להתחיל, הכינו שני מיליגרם לתמיסת מלאי מיליליטר של תמיסת DPBA על ידי המסת שני מיליגרם מהתרכובת למיליליטר אחד של מים מזוקקים. אחסן את התמיסה בחושך בארבע מעלות צלזיוס. בעת הכנת מרחיבי האנליטים יש לזכור שהמבנה הכימי ותכונותיהם של קטכולאמינים אינם יציבים, ומכיוון שהם מתפרקים בקלות, מרחיבי תהליך ההכנה חייבים להיות מהירים מאוד, ויש להימנע מחשיפה לאור שמש דק.

שקלו 1.0 מיליגרם של נוראדרנלין, אפינפרין, דופמין, MHPG, DOPAC ו-DHBA סטנדרטי פנימי בצינורות מיקרו-צנטריפוגה נפרדים של 1.5 מיליליטר. הוסף 1.0 מיליליטר מים מזוקקים כדי להמיס כל אחת מהתרכובות, למעט אפינפרין, אותו יש להמיס בתמיסת חומצה הידרוכלורית של 0.01 שומות לליטר. מתנודדים את התקנים המוכנים בחושך במהירות גבוהה עד שהאנליטים מתמוססים לחלוטין.

אלו הם המלאים העיקריים, וניתן לאחסן אותם בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד מספר שבועות. כדי להכין את מלאי האנליטים המשניים של נוראדרנלין, אפינפרין, דופמין, DOPAC ו-MHPG, העבירו חמישה מיקרוליטרים מכל מלאי אנליט ראשוני ל-4,975 מיקרוליטר של מים מזוקקים בצינורות צנטריפוגות נפרדים של חמישה מיליליטר. הכינו את התמיסות הללו טריות מדי יום, ואחסנו את התמיסות בחושך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש.

עבור DHBA, העבירו חמישה מיקרוליטרים של מלאי ראשוני ל-4,995 מיקרוליטר של מים מזוקקים בצינור צנטריפוגה של חמישה מיליליטר, ואחסנו אותם בחושך בנפרד בארבע מעלות צלזיוס. בצע דילולים נוספים עם מלאי האנליט המשני כדי ליצור עקומה סטנדרטית. אחסן את התמיסות בחושך בארבע מעלות צלזיוס, והכן טרי מדי יום.

לאחר מכן, בדוק את המתח האופטימלי של גלאי ה-ECD, באמצעות המלאי הסטנדרטי עם הריכוז המתאים. שנה את המתח כדי למצוא ערך שבו לאנליטים יש את מראה השיא הטוב ביותר. להכנת 10 מיליליטר ממס נוזלי, השתמש ב -5.5 מיליליטר מים מזוקקים, ואז הוסף 1.5 מיליליטר אצטוניטריל ושלושה מיליליטר חומצה זרחתית, טיפה אחר טיפה, למים.

כדי להכין את השלב הנייד, מדוד את הרכיבים המפורטים בפרוטוקול הטקסט לבקבוק נקי של ליטר אחד. הוסף 40 מיליליטר אצטוניטריל ומים מזוקקים ל -1,000 מיליליטר. מערבבים ורוטטים באולטרסאונד למשך 15 דקות עד שהחומר בתמיסה מומס כולו.

בעזרת מד pH עם אלקטרודת זכוכית, התאם את ערך ה- pH של השלב הנייד ל -4.21 עם תמיסת נתרן-הידרוקסיד רוויה. סנן את השלב הנייד עם ממברנה מיקרופורית פוליווינילידן פלואוריד 0.45 מיקרון ומכשיר יניקת ואקום להסרת זיהומים. השתמש ברטט קולי למשך 15 דקות כדי להסיר את השלב הנייד בכל פעם לפני השימוש.

לאחר מכן, מערבולת וצנטריפוגה את דגימות השתן ב-1, 510 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את רוב הפרעות החלקיקים. אספו את הסופרנטנטים, והשליכו את המשקעים לניסויים נוספים. כדי לחלץ אנליטים ביעילות, המשך למיצוי שלב מוצק של סיבים ארוזים, או טיפול מקדים PFSPE, מיד לאחר הצנטריפוגה.

כדי להפעיל את הננו-סיבים, לחץ 100 מיקרוליטר מתנול ו-100 מיקרוליטר מים ברצף דרך עמודת ה-PFSPE באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר בצורה איטית מבחינת טיפה. יש לערבב את דגימת השתן עם תמיסת DPPA כדי לשפר את ההידרופוביות שלה ולעזור לקטכולאמינים ולמטבוליטים להיספג על הסיבים. יש להוסיף פתרון DHBA גם כסטנדרט פנימי.

מערבבים 100 מיקרוליטר של דגימת שתן עם 100 מיקרוליטר של שני מיליגרם לתמיסת DPBA של מיליליטר ו-30 מיקרוליטר של 100 ננוגרם למיליליטר של תמיסה פנימית סטנדרטית של DHBA בשפופרת אפנדורף של 0.5 מיליליטר. לאחר מכן לחץ על תמיסת הדגימה המעורבת דרך עמודת ה-PFSPE עם מזרק פלסטיק מסוג גז של חמישה מיליליטר תוך שימוש בכוח לחץ האוויר. שטפו את העמוד שלוש פעמים באמצעות מזרק פלסטיק מסוג גז בנפח חמישה מיליליטר כדי להעמיס 100 מיקרוליטר מתמיסת DPBA לתוך עמודת ה-SPE, ודחפו את התמיסה לאט דרך המחסנית בלחץ אוויר.

שלב שטיפה זה הכרחי מכיוון שתמיסת ה-DPBA יכולה להסיר את הזיהומים בזמן שהאנליטים נשמרים, ובכך לשפר את הרגישות והסלקטיביות של האנליטים. לאחר מכן, טען 50 מיקרוליטר של חומר הנוזל על עמוד ה-PFSPE, ודחף אותו דרך העמודה, ואסף את הנוזל בעזרת צינור אפנדורף של 0.5 מיליליטר. הפעל את מסיר הגז HPLC כדי לנקות את האוויר במערכת.

לפני ניתוחי הדגימה, המערכת צריכה לפעול יותר מ-0.5 שעות עם השלב הנייד כדי לאזן ולהפחית את רעש הבסיס. דגימת 20 מיקרוליטר של הפליטה באמצעות דגימה אוטומטית, ולאחר מכן הזריקה אותה למערכת HPLC ECD. לאחר השלמת הריצות, כבה את תא הגלאי באמצעות ממשק הגלאי.

אל תכבה את התא עם המתג בחלק האחורי של הגלאי, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק למכשיר. שנה ידנית את הרכב השלב הנייד ל-10% מתנול ו-90% מים. לאחר ריצה של 30 דקות לפחות, שנה ידנית את השלב הנייד למתנול בדרגת HPLC.

הפעל את המערכת למשך כ-15 דקות כדי להגן עליה במתנול. אי הפעלת שלב זה לאחר זמן הריצה המומלץ עלולה לגרום לנזק לעמודה ולגלאי. כבה את הזרימה ולאחר מכן כבה את מסיר הגזים.

המשך לניתוח קטכולאמין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכרומטוגרמה של דגימת מים עם המטרות והתקן הפנימי מוצגת ללא מיצוי. בתנאי HPLC בפרוטוקול, חמשת פסגות היעד של שיטת PFSPE מופרדות היטב וגבוהות משמעותית מאלו המופקות על ידי מחסנית מסחרית של חומצה פנילבורונית.

כמו כן, שיא ה-DOPAC לא הופיע בתוצאת חילוץ מחסנית ה-PBA, מה שמצביע על כך שעמודת ה-PBA לא הייתה מסוגלת לחלץ DOPAC. כאשר דגימת השתן חולצה, שיטת PFSPE יכלה לא רק לחלץ את המטרות עם זיהוי שיא טוב, אלא גם יכלה להיפטר מרוב ההפרעות בשתן. עקומות כיול נבנו עבור כל תרכובת על ידי התוויית היחס בין שטח השיא, המראה ליניאריות טובה עם ריכוז נמוך.

לצורך אימות עם דגימות שתן אמיתיות, נבדקו דגימות שתן של 28 תינוקות בסיכון גבוה ו-22 תינוקות בריאים. בעוד שחלק מהקטכולאמינים לא היו שונים באופן משמעותי בין הקבוצות בסיכון גבוה לקבוצות הבריאות, לתינוקות בסיכון גבוה היו כמויות גבוהות יותר של מטבוליט MHPG מאשר לקבוצת הביקורת. לכן, רמת MHPG בשתן עשויה להוות סמן פוטנציאלי לזיהוי מוקדם של תינוקות בסיכון גבוה.

לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך דקות. בזמן ניסיון ההליך, חשוב לזכור להכין סינדרים טריים, לפעול במהירות ולמנוע חשיפה לאור שמש ישיר. תוספת תמיסת חומצה דיפנילבוראט בשלבי הספיגה והשטיפה היא גם קריטית.

בעקבות הליך זה, כמודד חוסר סיום של קטכולאמינים ומטבוליטים בפלזמה או בנוזל השדרה. ניתן לבצע Alsliver על מנת לקבוע את האוניברסליות של פרוטוקול זה בבדיקת הנוזלים הביולוגיים האחרים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור את הקשר בין ליקויים נוירו-התפתחותיים לרמת הקטכולאמינים בשתן בדגימות ילדים.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את שיטת מיצוי הפאזה המוצקה עם דמויות nair ומכשיר פשוט, פיבול האוויר PCE PS DPBA פסולת תאגידית יכול לעזור לנקות את הנוירוטרנסמיטורים הקטכולאמין בדגימות השתן. טכניקה זו נמשכת לקראת אבחון מוקדם של קסיס בסיכון לנזק מוחי בתינוקות. מכיוון שניתוח השוואתי חשף הבדלים חריגים ב-MHPG אונרי של ילדים אוטיסטים, מה שמצביע על כך שמטבוליטים של קטכולאמין עשויים להיות סמן מועמד חשוב.