ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להעריך כמותית את המיקום וההפצה של תאי אב הלב במהלך אורגנוגנזה של הלב. שיטה זו יכולה לעזור לענות על תשובות מפתח בתחום התפתחות הלב בכך שהיא מאפשרת לנו לצפות בלוקליזציה של אוכלוסיות אבות לב במהלך התפתחות עוברית תקינה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהתמונות הנפחיות יכולות להניב מידע כמותי על דינמיקה ברמת הרקמה וכי ניתן להפוך את צינור הניתוח לאוטומטי לשיפור יכולת השחזור.

למרות ששיטה זו מספקת מידע על אורגנוגנזה לבבית מוקדמת, ניתן ליישם אותה גם למחקר כללי של אמבריוגנזה מוקדמת או למורפוגנזה של איברים מעניינים אחרים. בבוקר היום השמיני העוברי, יש לחטא את בטן העכברה ההרה באתנול 70% ולבצע חתך בבטן הן דרך העור והן דרך דופן הגוף. החל מעל צינור ביצית אחד, נתח בזהירות את השומן לאורך צד הרחם עד צוואר הרחם.

בצע חתך דרך צוואר הרחם והמשיך לקצה העליון של חיתוך הביצית השני כדי לשחרר את כל הרחם. שוטפים את עודפי הדם מהרחם בכלי בגודל 10 ס"מ המכיל PBS טרי וחותכים את המזומטריום בין כל פשרון. העבירו את העוברים לצלחת של שישה סנטימטרים המכילה PBS טרי תחת מיקרוסקופ מנתח והשתמשו במלקחיים עדינים מספר חמש כדי להסיר את רקמת הרחם מהרקמה העשרונית.

לאחר מכן, פורסים בזהירות את קצה החצי העוברי של הנשיר כדי לחשוף את העוברים, צובטים את הנשיר כדי לדחוף ולשלוף בזהירות את העובר הראשון החוצה. נתחו כמה שיותר רקמה עוברית נוספת מבלי לפגוע במורפולוגיה של החיה והשתמשו בפיפטה כדי למקם את העובר בצינור של 1.5 מיליליטר המכיל PBS טרי על קרח. לאחר שכל העוברים נקצרו, יש לשאוב את ה-PBS מכל צינור ולשטוף את העוברים ב-PBS טרי.

לאחר שאיבה יסודית של ה-PBS מכל צינור, יש לתקן את העוברים ב-4% פרפורמלדהיד למשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם PBS טרי, ואז לאחסן את העוברים בארבע מעלות צלזיוס. התחל בהחלפת ה-PBS במיליליטר אחד של מאגר חוסם לדגירה של ארבע שעות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, החלף את המאגר החוסם בתערובת הנוגדנים הראשונית המתאימה ובמאגר חוסם מדולל לדגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, שאפו את עודפי הנוגדנים ושטפו את העוברים שלוש פעמים במשך שעה אחת בכל שטיפה ב-0.1% טריטון ב-PBS. לאחר השטיפה השלישית, הוסיפו את תערובת הנוגדנים המשנית המתאימה לעוברים לדגירה של שלוש שעות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, יש לצבוע את העוברים עם DAPI ב-PBS למשך 10 דקות ולאחר מכן שתי שטיפות של חמש דקות, ולאחר מכן להשהות לאט את העוברים במדיום הרכבה נגד דהייה המאפשר לעוברים להתייצב לפחות שעה אחת עם תנועה עדינה תקופתית כדי לעזור לדגימות ליפול לתמיסה.

לפני הרכבת העוברים, הכינו שתי ערימות מקבילות של חמש עד שש שכבות של סרט דבק כפול במרחק של 15 עד 20 מילימטרים זו מזו על שקופית מיקרוסקופ אחת לכל עובר והניחו טיפה של 15 מיקרוליטר של מדיום נגד דהייה על כל שקופית בין ערימות הסרטים. העבירו בזהירות עובר אחד לכל טיפה והשתמשו במיקרוסקופ דיסקציה ובמלקחיים עדינים כדי למקם את העוברים כשהצדדים הקדמיים שלהם פונים הרחק מהמגלשה ועם ציר הגוף שלהם בקו אחד עם הציר הארוך של המגלשות. כדי למקם את הכיסויים, הנח תחילה צד אחד של הזכוכית על ערימה אחת של סרט דבק כפול והשתמש במלקחיים כדי להוריד בעדינות את הכיסוי עד שהוא נוגע בערימת הסרטים השנייה.

חשוב במיוחד למקם ולהרכיב בזהירות את העוברים. עוברים שאינם ממוקמים נכון יהיו הרבה יותר קשים להדמיה ועשויים לדרוש עיבוד נוסף כדי לקבל נתונים טובים הניתנים לכימות. השתמש בפיפטה כדי להוסיף מדיום נוסף נגד דהייה בין השקופית לכיסוי כדי למנוע מהדגימה להתייבש במהלך ההדמיה ובחר את מטרת ההגדלה הגבוהה ביותר הזמינה המאפשרת ללכוד את כל אזור סהר הלב בשדה ראייה אחד.

לאחר מכן הגדר את פרמטרי ההדמיה תוך שימוש בשיטות הדמיה מומלצות סטנדרטיות והשתמש בשיעורי הדגימה של Nyquist כדי לקבוע את ממדי הווקסל XYZ של כל עובר. כדי לנתח את תמונות העוברים, טען את מערכי נתוני התמונה הגולמית לתוכנת ניתוח התמונות המתאימה ופתח את הקובץ הראשון בתצוגת העלייה. הנתונים ייטענו בתצוגה תלת מימדית במצב הקרנה בעוצמה מרבית.

פתח את חלון התאמת התצוגה ובחר את ערוץ הייחוס בלבד. התאימו את סף התמונה בהתאם לצורך. אם יחס האות לרעש נמוך מדי לפילוח, כוונן את הגמא.

ביצוע שיטות עבודה מומלצות במהלך רכישת תמונה הוא קריטי להשגת נתונים מתאימים ויהיה תלוי בהגדרת המיקרוסקופיה הספציפית בה נעשה שימוש. אם יש צורך בהתאמות לגמא, אין להשתמש בתמונות אלה להשוואת עוצמות הקרינה. השתמש בתיבת הדו-שיח של אלגוריתם פני השטח כדי ליצור משטח חדש עבור ערוץ הייחוס וסמן את התיבה מקור העניין של הפלח בלבד.

התאימו את אזור התיבה התוחמת כך שיכלול את אזור העניין כפי שהוא מסומן בצבע ההתייחסות, ובחרו בערוץ ההתייחסות מהתפריט הנפתח של ערוץ המקור. הגדר את ההחלקה למחצית מגודל הווקסל Z והשתמש במחווני הסף כדי להתאים את הגבול התחתון לעוצמתו המוחלטת כדי להבטיח שהמשטח לא יתרחב מעבר לאות הערוץ. סנן את האובייקטים לפי מספר ווקסל או עוצמת קול ודחה את כל אובייקטי הרקע שהאלגוריתם יצר וסיים את האלגוריתם.

לאחר מכן, בחר את המשטח החדש שנוצר ובחר את פונקציית ערכת המסכות מחלון העריכה. בחר את הערוץ הניסיוני המעניין תוך הקפדה על סימון הערוץ המשוכפל לפני החלת המסיכה ובחר את ערוץ המסיכה רק בחלון התאמת התצוגה. לאחר מכן צור משטח חדש כפי שהודגם זה עתה.

כדי להשיג את הנתונים הנפחיים עם כל משטח שנבחר, פתח את לשונית המשנה פירוט בכרטיסייה סטטיסטיקה ובחר ערכים ממוצעים מהתפריט הנפתח. הנפח הכולל של המשטח יימצא בעמודת הסכום של הטבלה שנוצרה. כאן, מוצג עובר עכבר ביום 8.25 עם תאי אב קרדיווסקולריים חדריים חיוביים ל-GFP המסומנים בנוגדנים נגד סהר לב כפי שהודגם זה עתה.

לאחר בחירת ערוץ הייחוס לרקמה המוכתמת, העוצמה והגמא מותאמים לפני תחילת אלגוריתם יצירת המשטחים. אזור העניין נבחר ונבחרת רמת פירוט פני השטח. המשטח ההתחלתי סף כך שיכלול את כל האות האמיתי על פני השטח.

לאחר מכן מתבצע סינון כדי להסיר שברי רקע קטנים כדי להפיק משטח ייחוס סופי. על-ידי בחירת משטח ההתייחסות, ניתן לשכפל את ערוץ ההשוואה ולהסוות אותו. העוצמה והגמא של ערוץ זה מותאמים לפני יצירת משטח שני באותו רצף שלבים.

הנפח הכולל עבור כל משטח מחושב לאחר מכן באופן אוטומטי וניתן להשוות אותו הן כמותית והן חזותית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות העוברים המנותחים, יעילות הנוגדנים, כיוון ההרכבה ומערך ההדמיה משפיעים כולם על איכות הנתונים הסופיים. בנוסף לצינור ניתוח כמותי זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון דה-קונבולוציה כדי להניב נתונים איכותיים נוספים.

לאחר פיתוחה, טכנולוגיה זו סללה את הדרך לחוקרים בהתפתחות הלב לחקור את הדינמיקה של אוכלוסיות אבות לב חדשות במהלך אמבריוגנזה מוקדמת.