באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

המטרה הכוללת של בדיקת הנקודות היא להעריך את הפנוטיפ הנודד של יריעות תאים מלוכדות מחוברות בתגובה לרמזים מיקרו-סביבתיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן, כגון כיצד ציטוקינים או גורמי גדילה משנים את תנועתיות תאי הגידול. היתרון העיקרי של בדיקת הנקודות הוא שהיא מבוצעת בקלות ומשמשת לתוצאות הניתנות לשחזור.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תנועתיות התאים, היא מתאימה גם למגוון בדיקות עוקבות, כגון צביעת תאים להערכת מורפולוגיה של מושבת גדילה ופיזור תאים, צביעה חיסונית, ניתוח חלבון ו-DNA או RNA, או הזרקת תאים לבעלי חיים. כדי להתחיל, יש להפשיר קולגן עכבר ארבע על קרח, ולדלל אותו ב-50 מיקרו-טוחנות HCL להכנת שלושה מיליליטר של תמיסת קולגן ארבע של 10 מיקרוגרם למיליליטר. הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת קולגן ארבע לבארות של צלחות תחתית זכוכית עם 12 בארות, והנח אותן בקופסת פלסטיק בגודל מתאים וסגורה היטב.

הניחו מגבת נייר רטובה מעל ומסביב לצלחות כדי ליצור תא לח, וסגרו את הקופסה. לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, כדי להזיז קולגן וחוצץ שאינם נספגים, השתמשו במים נטולי יונים כדי לשטוף את הצלחות פעמיים, ולכוון את המים היטב לקצה הצלחת, במקום לקצה שנוצר על ידי תחתית הקצה והחלקת הכיסוי.

יבש את הצלחות באוויר בקולט אדים למינארי, והשתמש בהן מיד או אחסן אותן בארבע מעלות צלזיוס עד חמישה ימים. להכנת תרחיף תאים, השתמש בתאים שגודלו בצלחת תרבית רקמה של 60 מילימטר במדיום DMEMF12, בתוספת סרום סוס של 5% עד מפגש של 80%. השתמש ב-DPBS נטול סידן ומגנזיום כדי לשטוף את התאים פעם אחת, ולאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של טריפסין EDTA בטמפרטורת החדר, ודגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 באטמוספירה לחה למשך שלוש עד חמש דקות.

השעו את התאים המנותקים ב-4.5 מיליליטר של מדיום תרבית כדי לעצור את פעילות הטריפסין, והשתמשו בהמוציטומטר כדי לספור 20 מיקרוליטר של תרחיף התאים. משוך את התאים הנותרים בצינור חרוטי של 50 מיליליטר על ידי צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 200 למשך שלוש דקות. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים במדיום תרבית לשלוש פעמים 10 לששת התאים למיליליטר.

כדי לצלחת את התאים במרכז כל כיסוי של צלחת הקולגן המצופה 12 בארות זכוכית, הנח טיפה של 10 מיקרוליטר של מתלה תאים, הקפד לא לגעת או לשרוט את הציפוי. ציפוי של טיפה לא עגולה לא יניב יריעת תאים עגולה, ואם נוגעים בציפוי או נשרטים, זה ימנע מהתאים להיצמד היטב. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה למשך 30 דקות, כדי לאפשר לתאים להתחבר.

לאחר מכן, בדוק אם יש חיבור תחת מיקרוסקופ הפוך. עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית, יש לשטוף בעדינות את הבארות פעמיים, כדי להסיר תאים שאינם מחוברים, ואז להוסיף מיליליטר אחד של מדיום תרבית לכל באר. בדוק תחת מיקרוסקופ הפוך שלא נותרו תאים צפים, אחרת שטוף שוב את הבארות.

דגרו על התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 באטמוספירה לחה כדי לקבל יריעות תאים מוגדרות היטב. בעזרת מיקרוסקופ הפוך, בדוק את כל הבארות כדי לוודא שמושבות התאים גדלו כראוי. במידת הצורך, סמן בארות לא מתאימות ואל תשתמש בהן.

סמן כל באר בצלחת כראוי לכל מצב שנחקר. הפעל כל תנאי בשכפול או משולש. שנה את המדיום כדי להרעיב את התאים DMEMF12 המכיל סרום של 0.1% סוס, שלוש שעות לפני גירוי התאים.

לאחר מכן, עורר את התאים על ידי הוספת EGF או מתווכים רצויים אחרים. השתמש בצינור מיקרוליטר אחד, או סובב את הצלחת בעדינות כדי לערבב את המדיום. דגרו את הצלחת למשך יום עד ארבעה ימים כדי להתבונן בתזוזה של הקצה ובקווי המתאר של הקצה.

כדי לבצע את צביעת H ו- E, יש לשטוף את התאים עם PBS פעמיים ולתקן אותם למשך כשתי דקות. הוסף המטוקסילין למשך כשתי דקות כדי להכתים את הגרעינים. שטפו את התאים במי ברז במשך חמש עד 10 דקות, עד שהגרעינים כחולים.

לאחר מכן, צבעו את הציטופלזמה באאוזין למשך שתי דקות לפני שטיפת התאים במים נטולי יונים. יבש את הצלחת באוויר, ואז הפוך אותה והשתמש בסרגל כדי למדוד את קוטר הנקודה. לחלופין, צלם תמונות של הלוח עם מצלמה, והשתמש ב-ImageJ כדי לנתח את קוטר הנקודה.

כדי לבצע מיקרוסקופ זמן-lapse, הפעל את מיקרוסקופ החממה והתאם את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס. מלאו את מכשיר האדים ב-DH2O, ולאחר מכן כוונו את ה-CO2 ל-5% וודאו שתא החממה לח, ושהשלב הממונע יכול לנוע בחופשיות. לאחר מכן, סגור את תא החממה ואפשר למיקרוסקופ להסתגל ל-37 מעלות צלזיוס.

הניחו את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ החממה והגדירו את רשימת השלבים, ואז דמיינו שני קצוות מנוגדים ואת המרכז של כל נקודה בתא. באמצעות מטרה של פי 10, צלם תמונות כל שלוש דקות למשך 15 עד 24 שעות. הורד את הנתונים והמשך בניתוח תמונות בתוכנה לבחירתך כגון Matlab.

בתחילה, הדמיית ניגודיות פאזה של נקודות תאים גילתה שתאי סרטן שד פולשניים היוצרים מושבת ריאות שומרים על פנוטיפ מזנכימלי לאחר גירוי עם EGF. עם זאת, תאים בודדים שעוזבים את היריעה נצפים בתדירות גבוהה יותר בנקודות תאים מגורים על ידי EGF. התגובה של תאי סרטן השד היוצרים מושבת ריאות ל-EGF הוערכה עוד יותר על ידי צביעת H ו-E של תרביות שעוררו עם EGF במשך ארבעה ימים.

ואכן, גירוי EGF הביא להגדלת קוטר המושבה, מה שמצביע על כך שנדידת תאים מגורים EGF עשויה להשתנות. בבדיקת נקודה זו, תאים בקצוות היריעה צולמו במשך תשע שעות לאחר גירוי של תאי סרטן שד יוצרי מושבה עם EGF. PIV גילה כי EGF הגדיל את מהירות התא ל-0.63 מיקרומטר לדקה מ-0.45 מיקרומטר לדקה בתאי ביקורת.

בנוסף, EGF הפחית את השונות של כיווניות התא, או התפשטות זוויתית, מ-0.95 בתרביות ביקורת ל-0.79 בתרביות מגרות EGF. בנוסף, כפי שנצפה על ידי צביעת H ו-E לאחר ארבעה ימים, EGF הגדיל את התזוזה הרדיאלית של קצה האפיתל במשך תשע שעות, מ-257 מיקרומטר ל-356 מיקרומטר. לאחר השליטה, הזמן המעשי לטכניקה זו הוא כמה שעות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית זמן, צביעה חיסונית וניתוח DNA ו-RNA על מנת לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, ניתן להשתמש בו כדי לנתח אם חלבונים מתבטאים באופן דיפרנציאלי בתאים הנודדים במהירות או באיטיות, או כאשר תאים נודדים לסביבה הסובבת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להגדיר את מבחן הנקודות, ולהשתמש בו כדי להעריך את הפנוטיפ הנודד של יריעות תאים מלוכדות מחוברות בתגובה לרמזים מיקרו-סביבתיים.