גישה פשוטה כדי לגרום לדלקת בעצה חיסון ניסיוני בעכברים C57BL/6 עבור הערכות Neuropathological פונקציונלי
9 בנובמבר 2017
דו ח זה מתווה גישה פשוטה לזירוז בהצלחה ניסוי חיסון לדלקת בעצה (EAN) באמצעות חלבון המיאלין אפס פפטיד180-199 (P0) בשילוב עם אדג'וונט מלאה של פרוינד, הרעלן שעלת. אנו מציגים פרדיגמה מתוחכם המסוגל להעריך במדויק את היקף הגירעונות פונקציונלי, neuropathology המתרחשים EAN הזה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום בהצלחה לדלקת עצבים אוטואימונית ניסיונית או EAN במודל עכבר לניתוח תפקודי ופתולוגי של תהליך המחלה. ניתן להשתמש במודל EAN כדי לענות על שאלות מפתח הנוגעות לנוירופתיה היקפית. זהו גם מודל נפלא לחקור את יעילותם של חומרים טיפוליים חדשים.
היתרון העיקרי של גישה זו הוא שהיא מספקת פרדיגמת בדיקה פונקציונלית פשוטה ואובייקטיבית שניתן ליישם בעת שימוש במודל EAN בעכבר. מי שמדגים את ההליך היום הוא סאנג וון יו, סטודנט לתואר ראשון במעבדה לביולוגיה של נוירוטרופין ומיאלין באוניברסיטת מלבורן. שלושה ימים לפני השראת המחלה, הפעל את מנגנון הערכת התפקוד המוטורי והפעל את כפתור האור.
הרם את העכבר והורד אותו על מיכל של צבע מאכל אדום. הכנס את העכבר לתא ההליכה והגדר את מהירות ההליכון ל-15 סנטימטרים לשנייה. הפעל את ההליכון ולחץ על הקלטה כדי להשתמש במערכת ההדמיה של פונקציית ההליכה כדי ללכוד את תנועת הריצה של העכבר למשך 36 שניות.
לאחר 36 שניות, הפסק את ההקלטה ואת ההליכון ושמור את קובץ הווידאו של הפעלת התרגול בתיקייה המיועדת. יום אחד לפני החיסון הראשון, השתמש במזרק של 0.5 מיליליטר המצויד במחט בגודל 30-1/2 כדי לתת 1.6 מיקרוגרם למיליליטר של רעלן שעלת ב-250 מיקרוליטר של PBS IP איזוטוני של עכבר לעכברי C57BL/6 זכרים מורדמים בני שישה עד שמונה שבועות. לאחר מכן, דרגו את העכברים עבור סימנים קליניים של EAN בסולם מאפס עד ארבע לפי הטבלה ובצעו הערכת תפקוד מוטורי כפי שהודגם זה עתה.
למחרת, שלבו כמויות שוות של תמיסות טריות של פפטיד ב-0.9% מלח ו-20 מיליגרם למיליליטר של Mycobacterium tuberculosis בהשלמת האדג'ובנט של פרוינד בחרוז חרוזים וערבבו את התמיסות במהירות המקסימלית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. טען מזרק המצויד במחט 23 עם החיסון והפוך ונער את המזרק לפני פינוי אוויר בתוך פיר המזרק. לפני מתן החיסון, הסר את השיער רק לרוחב קו האמצע בין עצם השכמה וחטא את העור החשוף עם אתנול 70%.
לאחר מכן, השתמש בזוג מלקחיים של Adson כדי לתפוס את העור ולהעביר 50 מיקרוליטר מהתמיסה לעכבר המוזרק לרעלן השעלת באמצעות הזרקה תת עורית. למחרת בבוקר, יש לספק 1.2 מיקרוגרם למיליליטר של רעלן שעלת ב-250 מיקרוליטר של PBS IP כפי שהודגם זה עתה ואחריו הזרקה נוספת של 1.2 מיקרוגרם למיליליטר של רעלן שעלת IP 48 שעות לאחר מכן. שלושה ימים לאחר הזרקת השעלת השלישית, יש לתת עוד 50 מיקרוליטר של חיסון טרי שהוכן באותו מקום הזרקה כמו קודם ולעקוב אחר הציון הקליני והתפקוד המוטורי של בעלי החיים פעמיים בשבוע עד לסיום הניסוי.
P0 180-199 EAN המושרה על ידי פפטיד בעכברי C57BL/6 מוביל למחלה מונופאזית עם ציון קליני שמתחיל שישה ימים לאחר החיסון הראשון וחומרת ציון מקסימלית 25 יום לאחר החיסון הראשון, ואחריו שיפור מסוים בציון הקליני 40 יום לאחר החיסון הראשון. העכברים מתחילים להיכשל במשימת ריצה פשוטה כבר שישה ימים לאחר החיסון הראשון עם יכולת מועטה להשלים משימת ריצה פשוטה על הליכון עד 35 יום לאחר החיסון שאינה משתפרת ביכולת הריצה 55 ימים לאחר החיסון הראשון. הבדיקה של קטעים דקים למחצה של העצבים הסיאטיים של עכברי EAN המושרים על ידי פפטיד חושפת אזורים של דה-מיאלינציה בהשוואה לעצבים סיאטיים מבקרות בריאות תואמות גיל.
תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של העברת הספק גבוה מאפשרות זיהוי של מאפיינים נוירופתולוגיים ספציפיים כגון דה-מיאלינציה, נזק ללמלה המיאלין וסימנים של מתח אקסוני כגון נפיחות מיטוכונדריאלית. בעלי חיים אלה מציגים גם נזק אקסונלי חריף כפי שמעיד ביטוי חלבון מבשר בטא-עמילואיד מוגבר באופן טראומטי בעצבים הסיאטיים שאינו נצפה ברקמות בקרה בריאות תואמות גיל. נצפתה גם התרחבות של הצמתים והפרעה לפרנודות .
לאחר השליטה, ניתן לבצע את הזריקות התת עוריות תוך כחמש עד 10 דקות לכל עכבר עם סיכוי מינימלי לטעות בהזרקה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד להתבונן באתר ההזרקה כדי לוודא שכל החיסון נשאר בתוך מקום ההזרקה ושאף אחד ממנו לא דולף החוצה. לכידת וידאו של הליכה בהליכון היא נהדרת מכיוון שהיא מאפשרת לחשב פרמטרים אחרים כגון שלב נדנדה או אורך צעד ומדדים אלה עשויים להיות חשובים בעת בדיקת היעילות של טיפולים חדשים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגרום ל-EAN בעכברים זכרים C57BL/6. בנוסף, אתה צריך להיות בעל הבנה ממש טובה כיצד לבצע זריקות תת עוריות בצורה בטוחה ומדויקת באמת להבטיח שאין טעות בהזרקה. אל תשכח שבעבודה עם מחטים וחיסון, יש סיכוי לפציעה במיוחד בעת שימוש בחדים.
לכן, כדי למנוע כל סיכוי לפציעה, זה רעיון ממש טוב להשתמש תמיד במלקחיים ולעולם לא לתפוס עור או רקמה ביד וגם להשתמש במזרקים חד פעמיים, לעולם לא לכסות מחדש בתהליך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מתודולוגיה להשראה של נויריטיס אוטואימונית ניסויית (EAN) במודל עכבר, תוך שימוש בפפטיד 180-199 של חלבון המיאלין zero (P0) יחד עם עזר קידום (adjuvant) מלא של פרוינד ורעלים של השעלת (pertussis toxin). המטרה היא לאפשר ניתוח תפקודי ופתולוגי של נוירופתיה פריפרית, ובכך לספק תובנות לגבי תהליך המחלה וטיפולים פוטנציאליים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- הפרעות אוטואימוניות
- נוירופתיה פריפרית
רקע
- נויריטיס אוטואימונית ניסויית (EAN) היא מודל לחקר נוירופתיה פריפרית.
- המודל הוא מעשי להערכת חומרים טיפוליים חדשים.
- בדיקות תפקודיות במהלך המחקר מסייעות בהערכה אובייקטיבית.
- הערכות התנהגות מרכזיות כוללות תפקוד מוטורי ודירוג קליני.
מטרת המחקר
- השראה יעילה של EAN בעכברי C57BL/6 למטרות מחקר.
- ניתוח היקף הליקויים התפקודיים והנוירופתולוגיה.
- ביסוס פרוטוקול הניתן לשחזור למחקרים עתידיים על נוירופתיה פריפרית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה כוללת שימוש בהליכון ובמערכת דימוי של תפקוד ההליכה לצורך הערכות תפקודיות.
- המודל מתמקד בעכברי C57BL/6 זכרים לצורך תהליך השראת ה-EAN.
- במחקר לא הוזכרו תהליכי עבודה של מולטי-אומיקה (multiomics).
- הפרוטוקול כולל הזרקות תת-עוריות שונות במרווחי זמן מוגדרים לאחר החיסון.
- הערכות של התפקוד המוטורי מבוצעות מספר פעמים במהלך המחקר כדי לנטר את התקדמות המחלה.
תוצאות עיקריות
- המחקר מאשש מהלך מחלה מונופזי עם שיא של תסמינים קליניים 25 ימים לאחר החיסון.
- נצפו ירידות תפקודיות משמעותיות בביצוע משימות מוטוריות מהיום השישי ועד היום ה-35.
- ניתוח נוירופתולוגי מראה דמיאלינציה ונזק אקסונלי בעכברים המטופלים בהשוואה לקבוצת הביקורת.
- ביטוי מוגבר של beta-amyloid precursor protein מעיד על פגיעה אקסונלית חריפה.
מסקנות
- מחקר זה מספק פרוטוקול ברור ויעיל להשראת EAN, המקל על הבנת הנוירופתולוגיה.
- תובנות לגבי תהליך המחלה תומכות במחקרים עתידיים על טיפולים פוטנציאליים לנוירופתיה פריפרית.
- ממצאים אלו משפרים את ההבנה של מנגנונים אוטואימוניים המשפיעים על מערכת העצבים הפריפרית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר השראה של נוריטיס אוטואימונית ניסויית בעכברי C57BL/6, זן עם זמינות נרחבת של כלים גנטיים, התומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים של מועמדים טיפוליים המכוונים לדמיאלינציה פריפרית. המודל מספק מדדים פונקציונליים ונוירופתולוגיים כמותיים המגבירים את הביטחון החזוי בהערכה פריקלינית של תיקון מיאלין ואסטרטגיות נוירופרוטקטיביות. השחזוריות שלו והתאימות לגישות טרנסגניות ממקמים אותו ככלי תרגומי לתיקוף מטרות במחקר של נוירופתיה פריפרית אוטואימונית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנונים פתוגניים בנוירופתיה פריפרית אוטואימונית באמצעות הפעלה חיסונית הניתנת להשראה ומונעת על ידי פפטידים במארח שניתן לטיפול גנטי.
- ערך תפעולי: משתמש ברקע C57BL/6, מה שמאפשר שילוב עם מודלים של knockout, knock-in ומודלי דגישה (reporter) לצורך הפחתת סיכונים של מטרות סיבתיות.
- ערך ניבוי: תומך בבדיקת השערות על נתיבי פגיעה עצבית ממקור חיסוני, ומסייע בקבלת החלטות מוקדמות של go/no-go עבור מועמדים לאימונומודולציה או לרמיאלינציה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר ירידה תפקודית מדידה באמצעות ניתוח הליכה על מסוע, מה שמאפשר ניטור ארוך טווח של גירעונות מוטוריים כסמן ביומטרי פרמקודנמי.
- ערך תפעולי: דירוג קליני סטנדרטי (סולם 0–4) וחיסונים מתוזמנים תומכים בהשראה שחזורית של המחלה בין קבוצות מחקר.
- מוכנות הבדיקה: תואם להערכה נוירופתולוגית בסמיות, כולל חיתוך שכבות דקות למחצה ומיקרוסקופיה אלקטרונית, כדי לתקף את המעורבות של תרכובות נוירו-פרוטקטיביות במטרה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: משחזר מאפיינים נוירופתולוגיים מרכזיים של דמיאלינציה פריפריאלית בבני אדם, כולל נזק אקסונלי המהווה ראיה על ידי רמות מוגברות של beta-amyloid precursor protein, ובכך תומך ברלוונטיות המכניסטית.
- המשכיות תרגומית: מאפשר הערכה של מועמדים טיפוליים לאורך שלבי המחלה, מההתחלה (יום 6) לשיא (יום 25) ועד להחלמה (יום 40), ובכך מסייע באופטימיזציה של המינון והעיתוי.
- קידום מותאם סיכונים: מקל על הערכת היעילות של תיקון המיאלין ושל נוירופרוטקציה, ובכך מפחית את אי-הוודאות הביולוגית לפני מחקרים המאפשרים הגשת IND.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, במיוחד עבור תכשירים ביולוגיים או מולקולות קטנות שנועדו לווסת תגובות אוטואימוניות או לקדם את שלמות האקסונים בנוירופתיה פריפרית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להשראה מבוקרת של אוטו-אימוניות ספציפית למערכת העצבים ההיקפית (PNS), במטרה לתקף מטרות המעורבות באינטראקציות בין מערכת החיסון לעצבים.
- סריקה: מספקת פלטפורמה סטנדרטית להערכת השפעות של תרכובות על התפקוד המוטורי ועל פתולוגיה עצבית, עם פלטים המתאימים לדימות בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ולדירוג.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים תפקודיים אורךים (פרמטרי הליכה, אורך צעד, שלב התנופה) ומדדי היסטופתולוגיה של נקודת סיום לצורך ניתוח השוואתי בין קבוצות טיפול.
- מחקר טרנסלציונלי: עולה בקנה אחד עם תיקוף פרה-קליני על ידי מידול מאפיינים כרוניים-הסתננים ופתולוגיה אקסונלית הרלוונטית לנוירופתיות היקפיות בבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-שימוש של אימונולוגיה-נוירוביולוגיה לבדיקה איטרטיבית של היפותזות טיפוליות לאורך מספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במודלים של נוירופתיה פריפרית על ידי הפיכת ההשראה של דמיאלינציה ותסרועת אקסונלית המתווכת על ידי מערכת החיסון למדויקת וניתנת לשחזור.
- ערך תפעולי: לוח זמנים מוגדר לחיסון ולחיסון דחף, בשילוב עם בדיקות תפקודיות סטנדרטיות, משפר את השחזור בין מעבדות ומפחית שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת ראיות כמותיות מוקדמות ל modulates של המטרה במערכת רלוונטית למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של מועמדים המראים השפעות הן על תוצאים תפקודיים והן על נקודות קצה נוירופתולוגיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעכברים, בטכניקות של הזרקה תת-עורית ובקיבוע באמצעות פרפוזיה לצורך אנליזה נוירופתולוגית.
- תלוי בגישה למערכות דימוי של הליכה על מסוע ולציוד לחיתוך שכבות דקות-חלקית ולמיקרוסקופיה אלקטרונית.
- מחייב הכשרה סטנדרטית לדירוג קליני והערכה עיוורת כדי להבטיח עקביות של הנתונים בין המבצעים השונים.
- דורש התאמה של ריכוז הפפטיד ושל פורמולציית העזר (adjuvant) בעת העברה לזני עכברים אחרים, בשל תגובתיות חיסונית משתנה.
- מוגבל למהלך מחלה מונופאזי; עשוי שלא לדגם צורות של נוירופתיה פריפרית עם התהלקויות והסגות (relapsing-remitting) או צורות פרוגרסיביות כרוניות ללא שינוי בפרוטוקול.
