גישה פשוטה כדי לגרום לדלקת בעצה חיסון ניסיוני בעכברים C57BL/6 עבור הערכות Neuropathological פונקציונלי

דו ח זה מתווה גישה פשוטה לזירוז בהצלחה ניסוי חיסון לדלקת בעצה (EAN) באמצעות חלבון המיאלין אפס פפטיד_180-199 (P0) בשילוב עם אדג'וונט מלאה של פרוינד, הרעלן שעלת. אנו מציגים פרדיגמה מתוחכם המסוגל להעריך במדויק את היקף הגירעונות פונקציונלי, neuropathology המתרחשים EAN הזה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום בהצלחה לדלקת עצבים אוטואימונית ניסיונית או EAN במודל עכבר לניתוח תפקודי ופתולוגי של תהליך המחלה. ניתן להשתמש במודל EAN כדי לענות על שאלות מפתח הנוגעות לנוירופתיה היקפית. זהו גם מודל נפלא לחקור את יעילותם של חומרים טיפוליים חדשים.

היתרון העיקרי של גישה זו הוא שהיא מספקת פרדיגמת בדיקה פונקציונלית פשוטה ואובייקטיבית שניתן ליישם בעת שימוש במודל EAN בעכבר. מי שמדגים את ההליך היום הוא סאנג וון יו, סטודנט לתואר ראשון במעבדה לביולוגיה של נוירוטרופין ומיאלין באוניברסיטת מלבורן. שלושה ימים לפני השראת המחלה, הפעל את מנגנון הערכת התפקוד המוטורי והפעל את כפתור האור.

הרם את העכבר והורד אותו על מיכל של צבע מאכל אדום. הכנס את העכבר לתא ההליכה והגדר את מהירות ההליכון ל-15 סנטימטרים לשנייה. הפעל את ההליכון ולחץ על הקלטה כדי להשתמש במערכת ההדמיה של פונקציית ההליכה כדי ללכוד את תנועת הריצה של העכבר למשך 36 שניות.

לאחר 36 שניות, הפסק את ההקלטה ואת ההליכון ושמור את קובץ הווידאו של הפעלת התרגול בתיקייה המיועדת. יום אחד לפני החיסון הראשון, השתמש במזרק של 0.5 מיליליטר המצויד במחט בגודל 30-1/2 כדי לתת 1.6 מיקרוגרם למיליליטר של רעלן שעלת ב-250 מיקרוליטר של PBS IP איזוטוני של עכבר לעכברי C57BL/6 זכרים מורדמים בני שישה עד שמונה שבועות. לאחר מכן, דרגו את העכברים עבור סימנים קליניים של EAN בסולם מאפס עד ארבע לפי הטבלה ובצעו הערכת תפקוד מוטורי כפי שהודגם זה עתה.

למחרת, שלבו כמויות שוות של תמיסות טריות של פפטיד ב-0.9% מלח ו-20 מיליגרם למיליליטר של Mycobacterium tuberculosis בהשלמת האדג'ובנט של פרוינד בחרוז חרוזים וערבבו את התמיסות במהירות המקסימלית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. טען מזרק המצויד במחט 23 עם החיסון והפוך ונער את המזרק לפני פינוי אוויר בתוך פיר המזרק. לפני מתן החיסון, הסר את השיער רק לרוחב קו האמצע בין עצם השכמה וחטא את העור החשוף עם אתנול 70%.

לאחר מכן, השתמש בזוג מלקחיים של Adson כדי לתפוס את העור ולהעביר 50 מיקרוליטר מהתמיסה לעכבר המוזרק לרעלן השעלת באמצעות הזרקה תת עורית. למחרת בבוקר, יש לספק 1.2 מיקרוגרם למיליליטר של רעלן שעלת ב-250 מיקרוליטר של PBS IP כפי שהודגם זה עתה ואחריו הזרקה נוספת של 1.2 מיקרוגרם למיליליטר של רעלן שעלת IP 48 שעות לאחר מכן. שלושה ימים לאחר הזרקת השעלת השלישית, יש לתת עוד 50 מיקרוליטר של חיסון טרי שהוכן באותו מקום הזרקה כמו קודם ולעקוב אחר הציון הקליני והתפקוד המוטורי של בעלי החיים פעמיים בשבוע עד לסיום הניסוי.

P0 180-199 EAN המושרה על ידי פפטיד בעכברי C57BL/6 מוביל למחלה מונופאזית עם ציון קליני שמתחיל שישה ימים לאחר החיסון הראשון וחומרת ציון מקסימלית 25 יום לאחר החיסון הראשון, ואחריו שיפור מסוים בציון הקליני 40 יום לאחר החיסון הראשון. העכברים מתחילים להיכשל במשימת ריצה פשוטה כבר שישה ימים לאחר החיסון הראשון עם יכולת מועטה להשלים משימת ריצה פשוטה על הליכון עד 35 יום לאחר החיסון שאינה משתפרת ביכולת הריצה 55 ימים לאחר החיסון הראשון. הבדיקה של קטעים דקים למחצה של העצבים הסיאטיים של עכברי EAN המושרים על ידי פפטיד חושפת אזורים של דה-מיאלינציה בהשוואה לעצבים סיאטיים מבקרות בריאות תואמות גיל.

תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של העברת הספק גבוה מאפשרות זיהוי של מאפיינים נוירופתולוגיים ספציפיים כגון דה-מיאלינציה, נזק ללמלה המיאלין וסימנים של מתח אקסוני כגון נפיחות מיטוכונדריאלית. בעלי חיים אלה מציגים גם נזק אקסונלי חריף כפי שמעיד ביטוי חלבון מבשר בטא-עמילואיד מוגבר באופן טראומטי בעצבים הסיאטיים שאינו נצפה ברקמות בקרה בריאות תואמות גיל. נצפתה גם התרחבות של הצמתים והפרעה לפרנודות .

לאחר השליטה, ניתן לבצע את הזריקות התת עוריות תוך כחמש עד 10 דקות לכל עכבר עם סיכוי מינימלי לטעות בהזרקה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד להתבונן באתר ההזרקה כדי לוודא שכל החיסון נשאר בתוך מקום ההזרקה ושאף אחד ממנו לא דולף החוצה. לכידת וידאו של הליכה בהליכון היא נהדרת מכיוון שהיא מאפשרת לחשב פרמטרים אחרים כגון שלב נדנדה או אורך צעד ומדדים אלה עשויים להיות חשובים בעת בדיקת היעילות של טיפולים חדשים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגרום ל-EAN בעכברים זכרים C57BL/6. בנוסף, אתה צריך להיות בעל הבנה ממש טובה כיצד לבצע זריקות תת עוריות בצורה בטוחה ומדויקת באמת להבטיח שאין טעות בהזרקה. אל תשכח שבעבודה עם מחטים וחיסון, יש סיכוי לפציעה במיוחד בעת שימוש בחדים.

לכן, כדי למנוע כל סיכוי לפציעה, זה רעיון ממש טוב להשתמש תמיד במלקחיים ולעולם לא לתפוס עור או רקמה ביד וגם להשתמש במזרקים חד פעמיים, לעולם לא לכסות מחדש בתהליך.