Name: חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: חקור אינטראקציות חלבון-חלבון בתוך תאים חיים באמצעות פפטידים חודרי תא מוביוטינילים. השיטה משתמשת במערכת pull-down ביוטין-אבידין כדי לחשוף דינמיקת אותות תאית בגידולי G166 glioma stem cells.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מ מוראלס ובראבו ג'יי על עזרתם עם העיצוב של CPPs, ג'יי Arévalo על עזרתו עם פרוטוקול נפתחים. . אנחנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של טי del Rey. עבודה זו נתמכה על ידי y Ministerio de Economía Competitividad, ספרד; פדר BFU2015-70040-R, דה חונטה Castilla y לאון, ספרד; SA026U16 פדר, Fundación רמון Areces. מ Jaraíz-רודריגס א גונזלס-Sánchez מקבלי מלגת, דה חונטה Castilla y León ו הקרן החברתית האירופאית בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד.

כל ההליכים ניסיוני בוצעו על הכתב לאוניברסיטת סלמנקה לבחינה.
1. תאים
<ol>
	<li>יומיים לפני תחילת ההליך, צלחת התאים-צפיפות נדרש להיות confluent היום של הניסוי. צלחת התאים מבחנות או צלחות. עם זאת, החילוץ חלבון יהיה קל יותר של צלחות. זה נוח להכין לפחות ארבע פלטות של 78 ס מ2 או 2 בקבוקונים של 150 ס"מ2 לכל תנאי לכל ניסוי, כדי להיות בטוח כי התוצאות אינן עקביות.</li>
	<li>במחקר זה, צלחת GSCs G166 האנושי ב- 4 מבחנות של 150 ס מ2, תרבותי במדיום תאי גזע RHB-A בתוספת 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL EGF ו b-FGF כפי שתואר על ידי פולארד et al.22. תהליך כאשר הנהרות הושג. למשל, כאשר 5 x 106 G166 תאים מצופים בבקבוקון2 150 ס מ, הם עובדו 2 ימים לאחר ציפוי.</li>
</ol>
2. Biotinylated CPPs
<ol>
	<li>לסובב את הבקבוקונים המכיל את biotinylated lyophilized CPPs (BCPPs) ב 8200 x g ב-30 s, כדי להימנע כמה האבקה שנותרה על המכסה. כוללות פקד BCPP כדי לוודא האינטראקציות נמצאו הספציפיים של הרצף היעד. במחקר זה, הפקד BCPP היה טאט-ביוטין (TAT-B), הטיפול BCPP טאט-Cx43266-283- בי פקדים אחרים יכול לשמש, כגון ערבות שברי מאוחה מקושקשות או מוטציה TAT ביוטין.</li>
	<li>להמיס את BCPPs במדיום תרבות המתאימים לפתרון מניות שציין היצרן; למשל, כדי להשיג פתרון מניות של 2 מ"ג/מ"ל BCPP לטיפול GSCs להוסיף 0.5 מיליליטר GSC תרבות בינוני בקבוקון אחד המכיל 1 מ ג של BCPP. מערבולת ולוודא פפטיד טוב התפרקה.</li>
</ol>
3. צינורות
הערה: להכין לפחות 12 1.5 mL צינורות לכל תנאי הנדרש בסעיף 7.
<ol>
	<li>סמן את צינורות הראשון 3 לכל תנאי. יהיה להם את הנפח הכולל של lysates הסלולר שהושג בשלב 6.4.</li>
	<li>סימון A 3 צינורות לכל תנאי. הצינורות האלה יש את supernatants הראשון שהושג לאחר lysing, ספינינג lysates הסלולר, צעד 7.2.</li>
	<li>סימון a B 3 צינורות לכל תנאי. צינורות אלה יהיו aliquot קטן של supernatants הראשון. Lysates אלה ישמש הדגימות תספיג בשלב 7.3.</li>
	<li>סמן סי 3 צינורות לכל תנאי. הצינורות האלה יש את supernatants שהושג לאחר נפתחים עם NeutrAvidin, שלב 7.7. הערה: זה חשוב במקרה תספיג הראה שאין אותות עבור חלבונים, כלומר החלבונים היו לא הוריד או אבדו בשלב כלשהו של ההליך. אם זה היה המצב, חזור על התהליך כדי להוריד את החלבונים.</li>
</ol>
4. הסלולר טיפול עם BCPPs
<ol>
	<li>האחות המדיום תרבות.</li>
	<li>החלף את האחסון המתאימים בינוני טריים נדרשים דגירה של BCPPs אפשרי בהיקף בינוני לפי הזמנים הדגירה הקטן ביותר. חשוב מאוד כי בכל מקרה, המדיום מכסה לחלוטין פני הבקבוק/הצלחת כך התאים לא יתייבש, למשל, 6 מ לכל 150 ס"מ2 עבור דגירה 30 דקות.</li>
	<li>הוסף את עוצמת הקול של הפתרון מניות של BCPP תרביות תאים כדי להגיע ריכוז זה הוכח כיעיל. בזה מחקר 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- B הוכח כדי לצמצם את התפשטות GSC.
	<ol>
		<li>לכן, הוספת 92.8 µL של 2 מ"ג/מ"ל טאט-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) לכל מיליליטר תרבות בינוני בריכוז הסופי של 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- בי אם אמצעי האחסון שיתווספו שונה עבור פקד פפטידים, להשלים עם תרבות בינוני עד גמר באותו אמצעי אחסון. למשל, 49.1 µL טאט-B (MW = 1914.31 g/mol) ובנוסף 43.7 µL GSC בינוני נוספו לכל מיליליטר תרבות בינוני בריכוז הסופי של 50 מיקרומטר טאט-בי</li>
	</ol>
	</li>
	<li>מקם את התאים בחממה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות לוודא מתקיימים יחסי גומלין של BCPP ושותפיה תאיים. אם האינטראקציה לוקח יותר זמן, דגירה משכי זמן ארוכים יותר או להתאים פעמים במקרה הניסוי כללה זמן-קורס. בנוסף, האינטראקציה עניין יכול להיות קידום או למניעה על ידי גירוי שונים תאיים איתות המסלולים.</li>
</ol>
5. מאגרי ופתרונות.
<ol>
	<li>להכין PBS pH 7.4: 136 מ"מ NaCl; 2.7 מ"מ אשלגן כלורי; 7.8 מ מ נה2HPO4·2H2O; 1.7 מ"מ ח'2PO4.</li>
	<li>להכין מאגר פירוק חלבון: 20 מ מ טריס-HCl (pH 8.0), 137 מ מ NaCl, 1% IGEPAL, לפני השימוש, להוסיף את הדברים הבאים: 1/100 (v/v) פרוטאז מעכב קוקטייל, 1 מ"מ נתרן פלואוריד, 1 מ Phenylmethanesulfonyl פלואוריד (PMSF), orthovanadate נתרן 0.1 מ מ.</li>
	<li>הכנת מאגר Laemmli: (4 x: מ' טריס-HCl 0.18 pH 6.8; 5 מ' גליצרול; מרחביות 3.7% (p/v); 0.6 מטר β-mercaptoethanol או 9 מ מ DTT; bromophenol 0.04% (v/v) כחול (BB)).</li>
</ol>
6. חלבון החילוץ
הערה: חלבון החילוץ בוצע כפי שתואר לעיל20,23. לבצע שכל האזור הזה של ההליך ב 4 º C.
<ol>
	<li>תשאף המדיום תרבות לחלוטין.</li>
	<li>שטיפת 3 x 10 מ עם פוספט כקרח buffered תמיסת מלח (PBS) לכל 150 ס"מ2 היטב כדי למנוע ניתוק התא.</li>
	<li>כדי להשיג את התא lysate, להוסיף 3 מ"ל של פירוק מאגר לכל 150 ס מ2 , ביסודיות לגרד את פני השטח באמצעות המגרד של התא. הטיית הצלחת/שתייה צידניות כדי כ-45 מעלות יקל לאסוף את lysates תא לתוך הצינורות המתאימים שלהם.</li>
	<li>יוצקים 1 מ"ל של הטלפון הסלולרי lysate למחזור שלושה צינורות 1.5 mL. צינורות אלה יסומנו עם התנאי, של שכפול כפי שמצוין בשלב 3.1.</li>
</ol>
7. נפתחים
<ol>
	<li>Centrifuge צינורות 1.5 mL ב 11,000 x g 10 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>להעביר את supernatants צינורות חדשים (א).</li>
	<li>קח את aliquot של זו תגובת שיקוע לכל תנאי צינורות שונים (B), דהיינו 50 µL למחזור. להוסיף מאגר x Laemmli 4 (16.6 µL עבור 50 µL של lysate) ומקפיאים ב-20 ° C. Lysates אלה ישמש כרגיל תספיג דגימות.</li>
	<li>Homogenize היטב את NeutrAvidin Agarose על ידי טלטול עדין. חותכים את הקצוות של הקצוות פיפטה כדי להגדיל את הקוטר שלהם ולשפר את pipetting של החרוזים.</li></ol>להוסיף 50 µL של NeutrAvidin Agarose לכל מיליליטר תא lysate את החצוצרות שלה (א).
	<li>דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם טלטול עדין מאוד כדי לאפשר NeutrAvidin לקיים אינטראקציה עם BCPPs קשור זוגם תאיים.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 3000 x g עבור 1 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את המתחם של NeutrAvidin עם חלבונים.</li>
	<li>בזהירות להסיר את supernatants ומעבירים אותם אל צינורות נקיים (C). למנוע מהם להשתמש בהם במקרה נפתחים אינו מוצלח.</li>
	<li>שטיפת מדרגות: להוסיף מאגר פירוק טריים כדורי (צינורות A), resuspend על-ידי היפוך, חזור על השלבים 7.6) ו- 7.7) עבור 5 פעמים יותר. כל supernatants האלה יכולים להיות מושלך.</li>
	<li>להסיר את supernatants ומוסיפים 2 x Laemmli מאגר האחסון הסופי הרצוי (40 µL למחזור 1.5 mL עבור כדורי המתקבל 150 ס"מ2 בקבוקונים של תאים confluent).</li>
	<li>Elute ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מביצועם של אינטראקציות בין חלבונים צנטריפוגה ב-30 s ב x 8,200 g כדי הצניפה NeutrAvidin חרוזים.</li>
	<li>קח את supernatants, המכיל את החלבונים dissociated, עם טיפים נימי צינורות חדשים (D). ניתן לשמור את החרוזים למקרה לחזור על השלבים • תנאי נדרש. הערה: supernatants (צינורות D) אתה מוכן להיות טעון ב תספיג או להקפיא ב-20 ° C.</li>

8. תספיג חלבון
הערה: סופג המערבית בוצעה כפי שתואר לעיל24.
<ol>
	<li>לטעון את נפח המקבילה של כל מדגם לכל ליין ב- Bis-טריס (4-12%) midigels מערכת אלקטרופורזה Midi-Cell.</li>
	<li>חלבונים Transblot באמצעות מערכת blotting יבש לתוך ערימה ניטרוצלולוזה רגיל.</li>
	<li>כתם הקרום עם 10% צבע מאכל פונסו למשך 10 דקות.</li>
	<li>לשטוף את הקרומים 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS.</li>
	<li>לחסום את הקרומים עם חלב 7% ב- TTBS עבור 1 h עם טלטול עדין צינורות או קופסאות קטנות. ודא שאמצעי האחסון המשמש מספיק כדי לכסות את הקרומים כי הם לא לייבש, כלומר 40 מ"ל לכל midi כל ממברנה.</li>
	<li>רחץ 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS.</li>
	<li>דגירה בין לילה ב 4 ° C עם נוגדן ראשוני נגד החלבון עניין ברעידות עדין.</li>
	<li>רחץ 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS.</li>
	<li>דגירה הקרום בטמפרטורת החדר עם כתב מצומדת peroxidase משני הנוגדן ב- TTBS לשעה.</li>
	<li>רחץ 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS.</li>
	<li>לפתח עם מצע chemiluminescent במערכת chemiluminescence.</li>
</ol>
9. ופתרון בעיות.
<ol>
	<li>אם לאחר פיתוח המערב למחוק כל הדגימות הראה שאין אותות בכלל עבור חלבונים, בדוק את צבע מאכל פונסו. הערה: הקרום, צבע מאכל פונסו צריך להראות לא מוגדר ונטענת להקות רבות לאורך המסלולים. אם הרצועות אינן מורגש מאוד, בכמות החלבונים טעון לא בטוח שיהיה מספיק או אולי נעלם העברה שגוי. שקול חוזר את תספיג חלבון.</li>
	<li>אם הכתם אין בכלל בתוך הקרומית צבע מאכל פונסו במסלול כלשהו, חזור על כל התהליך מהשלב 7.4 את החצוצרות שלה (C).</li>
	<li>אם לאחר לפתח את תספיג חלבון אות חלש מאוד, אך צבע מאכל פונסו הראה חלבונים, תקופת דגירה שוב הקרום עם נוגדן ראשוני של זמן רב יותר. אם האות עדיין די חלשה, דגירה שוב בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>
10. אחרים בשימוש בטכניקות במאמר זה
<ol>
	<li>Immunocytochemistry של BCPPs
	<ol>
		<li>לתקן תאים paraformaldehyde 4% (0.2 מ"ל לכל ס מ2) במשך 20 דקות.</li>
		<li>רחץ 3 x 5 דקות עם PBS (0.2 מ"ל לכל ס מ2).</li>
		<li>להחיל את הנוגדן המתאים (לפחות 0.15 מ"ל לכל ס מ2) מדולל בפתרון נוגדן-ריכוז המצוין של היצרן נגד חלבון שלך עניין בן לילה ב 4 º C.</li>
		<li>דגירה עם fluorophore מצומדת משני נוגדנים (0.15 מ"ל לכל ס מ2) עבור 2 h בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>חזור על צעדים 10.1.2-10.1.4 עם אחרים נוגדנים נגד החלבונים את עניין. יש להיזהר שלא להשתמש מאותו זן שונה נוגדנים הראשי או fluorophores באותו אורך גל של נוגדנים משניים.</li>
		<li>הר התאים באמצעות הכימית antifade (0.005 מ"ל לכל ס מ2).</li>
		<li>לנתח על מיקרוסקופ פלורסצנטיות מחובר מצלמה דיגיטלית.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTT assay
	<ol>
		<li>התרבות התאים ב- 37 מעלות צלזיוס. ובכן 24 צלחות.</li>
		<li>דגירה התאים בחושך למשך 75 דקות 0.15 מ של תרבות בינוני לכל ס מ2 המכילה 0.5 מ"ג/מ"ל MTT.</li>
		<li>האחות של המדיום, דגירה התאים 10 דקות בחושך עם דימתיל סולפוקסיד (0.25 mL לכל ס מ2) ברעידות מתון.</li>
		<li>למדוד את ספיגת באורך-גל של 570 nm באמצעות קורא microplate.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Wilchek, M., Bayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+avidin-biotin+technology%3A+literature+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Applications of avidin-biotin technology: literature survey.</a> Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).</li>
<li>Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+molecular+mechanism+for+the+cellular+uptake+of+guanidinium-rich+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules.</a> J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).</li>
<li>Ramsey, J. D., Flynn, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides+transport+therapeutics+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells.</a> Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).</li>
<li>Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+stabilize+cell+penetrating+peptides+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Deliv%22%5BJournal%5D)">Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications.</a> Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).</li>
<li>Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+HIV-1+Tat+protein+basic+domain+rapidly+translocates+through+the+plasma+membrane+and+accumulates+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus.</a> J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).</li>
<li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+peptide-mediated+cellular+delivery%3A+back+to+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).</li>
<li>Cuesto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-3-kinase+activation+controls+synaptogenesis+and+spinogenesis+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).</li>
<li>Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine-rich+cell-penetrating+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Arginine-rich cell-penetrating peptides.</a> FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).</li>
<li>Sorgen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+carboxyl+terminus+of+the+gap+junction+protein+connexin43+indicates+signaling+between+binding+domains+for+c-Src+and+zonula+occludens-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1.</a> J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).</li>
<li>Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+c-Src+with+gap+junction+protein+connexin-43.+Role+in+the+regulation+of+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication.</a> J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).</li>
<li>Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+connexin43-Src+interaction+in+astrocytomas%3A+A+molecular+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle.</a> Neuroscience. 323, 183-194 (2016).</li>
<li>Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+networks%3A+a+step+further+in+neuroglial+and+gliovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).</li>
<li>Shinoura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+messenger+RNA+expression+of+connexin43+in+astrocytomas%3A+implications+in+brain+tumor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy.</a> J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).</li>
<li>Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+expression+of+connexin-43+and+functional+gap+junction+coupling+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas.</a> Glia. 33, 107-117 (2001).</li>
<li>Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+Cx43+in+astrocytic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurol+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors.</a> Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).</li>
<li>Crespin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+gap+junction+protein%2C+connexin43%2C+in+a+large+panel+of+human+gliomas%3A+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights.</a> Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).</li>
<li>Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-penetrating+peptide+based+on+the+interaction+between+c-Src+and+connexin43+reverses+glioma+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death & Disease. 5, (2014).</li>
<li>Gonzalez-Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+recruits+PTEN+and+Csk+to+inhibit+c-Src+activity+in+glioma+cells+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes.</a> Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).</li>
<li>Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).</li>
<li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).</li>
<li>Yu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regulation+of+NGF-mediated+functions+by+Nedd4-2+ubiquitination+of+TrkA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA.</a> J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).</li>
<li>Herrero-Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+inhibits+the+oncogenic+activity+of+c-Src+in+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells.</a> Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).</li>
<li>Cooper, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooper%2C+GM+%22The+Cell%3A+A+Molecular+Approach%22">The Cell: A Molecular Approach</a>. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).</li>
<li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+lipid+rafts+mediate+caveolar+endocytosis+of+HIV-1+Tat+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).</li>
<li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells%3A+the+cancer+stem+cell+hypothesis+writ+large%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large.</a> Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).</li>
<li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nbt/journal/v6/n10/abs/nbt1088-1204.html">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Benard, V., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Cdc42%2C+Rac%2C+and+Rho+GTPase+activation+by+affinity+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods.</a> Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).</li>
<li>Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Penetrating+Peptides%3A+From+Basic+Research+to+Clinics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+therapy+using+tumor+homing+and+penetrating+peptide-functionalized+PEG-PLA+nanoparticles+loaded+with+paclitaxel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel.</a> Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).</li>
<li>Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+disordered+proteins%3A+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsically disordered proteins: regulation and disease.</a> Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).</li>
<li>Anthis, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+integrin+tyrosine+phosphorylation+is+a+conserved+mechanism+for+regulating+talin-induced+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation.</a> J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ישנן שיטות רבות ללמוד אינטראקציות חלבון חלבון. השיטה שהוצגו במחקר זה מבוסס על מערכת נפתחים ביוטין-אבידין בשימוש נרחב שבו מודגרת פיתיון biotinylated עם תא lysates כדי לאפשר הקמת אינטראקציות. השינוי הציגה מחקר זה כולל השילוב של טכניקה זו עם רצפי חודר לתא. אנו מציעים עיצוב פיתיונות חודר לתא יכול להיות מודגרות עם תאים חיים במקום תא lysates, ולכן האינטראקציות נמצאו ישקף אלו שהתרחשו בתוך ההקשר הסלולר.
כאן נשתמש TAT כמו רצף חודר לתא, ביוטין התג נפתחים, האזור של Cx43 מורכבת בין חומצות אמינו 266-283 היעד נמצא אינטראקציות תאיים GSCs האנושית. הבסיס המבני של האינטראקציה בין Cx43 לבין c-Src הוא ידוע11,12. הסיבה לכך היא אינטראקציה חשוב זה מעכב את הפעילות oncogenic של c-Src glioma תאים24,13. למעשה, CPPs המכיל אזור זה (TAT-Cx43266-283) לחקות את המאפיינים antioncogenic של Cx43 על glioma תאים19,20,21. בתאים C6 glioma עכברוש, המנגנון שבאמצעותו טאט-Cx43266-283 מעכב c-Src כולל הגיוס של c-Src יחד עם מעכבי אנדוגני צסק א שלה PTEN20. יצוין, כי GSCs הם מאוד מעניין כמטרה בטיפול glioma, כי הם מהווים subpopulation עמידים לטיפולים קונבנציונליים, ולכן אחראי הישנות זה גידולים ממאירים במוח27. יתר על כן, הם תאים קשה-עד-transfect, ולכן חקר אינטראקציות תאיים הופך קשה יותר. CPPs הם במהירות וביעילות הפנימו GSCs19 להעדיף את השימוש בהם לצורך המחקר של אינטראקציות תאיים. זה לומדים, באמצעות CPPs דבוקה ביוטין נאשר את האינטראקציה של הרצף266-283 Cx43 עם c-Src יחד עם מעכבי אנדוגני שלה צסק א ו PTEN ב GSCs האנושית.
שיטה זו היא רבת עוצמה כדי לחקור את המנגנון תאיים של תרכובות ביו. עם זאת, חשוב מאוד לוודא כי ההשפעה הביולוגית של הפיתיון חדירה של תאים biotinylated אינה שונה מזה שהושג עם הלא-biotinylated אחד. צעד זה נדרש כדי לשייך את האינטראקציות נמצאו עם האפקט של המתחם ביו. בנוסף, היציבות של המתחם, והשפלות שלו אפשרי על ידי פרוטאזות, כמו גם שלה רעילות אפשרי, צריך להיות בזהירות נבדקה והוכחה לקחת בחשבון לפני תכנון הניסוי. בדוגמה שהוצגו, כבר השפעת אנטי-proliferative טאט-Cx43266-283 על G166 GSCs האנושית תועדו בעבר20. במחקר זה, נוכל לאמת את זה אפקט אנטי-המקדימות של טאט-Cx43266-283- B של טאט-Cx43266-283 הוא מאוד דומה. בנוסף, ניתוח הנתונים הסלולרית מורפולוגיה של גילה את α-טובולין, התפלגות F-אקטין דומה מאוד GSCs G166 שטופלו טאט-Cx43266-283- B או עם קעקוע-Cx43266-283. בסך הכל, תוצאות אלה מצביעות על ההכללה של ביוטין-c-הסופית של טאט-Cx43266-283 לא לשנות את ההשפעות של מתחם זה על האדם GSCs. עם זאת, אם ביוטין לשנות את ההשפעות של המולקולה ביו, תגים נוספים לטיהור חלבון יכול להיבדק, כגון הדגל octapeptide (DYKDDDDK)28, שפעת אנושית נגזר hemagglutinin התג HA (YPYDVPDYA) או גלוטתיון S-טרנספראז (GST)29. באופן דומה, אם TAT כיעד האוכלוסייה תא עניין, השני תא רצפים חודר, כגון penetratin, MPG (לסקירה, ראה30) או רצפים ספציפיים התא יכול להיות בשימוש31.
בנוסף חלבונים לימוד המקיימים אינטראקציה באופן ספציפי עם הרצף היעד, באופן אידיאלי, נוכחותם של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם הפקד והן היעד רצף וחלבונים המקיימים אינטראקציה לא איתם, כפקדי חיוביים ושליליים, צריך להיות התייחס. במובן זה, אנו נמצא קו-1 בפקד, התייחס למצב, רומז כי היה מעורב caveolae המנגנון של הפנמה, כמו בעבר הוכח26. יתר על כן, המשיכו, אשר מקיים אינטראקציה עם c-Src אבל אמורה לא להיות במגע עם c-הטרמינל Cx43, נעדר הן השליטה והן המצב שטופלו. תוצאות אלו מחזקות יחודיות של האינטראקציה בין טאט-Cx43266-283- B, c-Src, צסק א ו PTEN. כדי לאשר את התוצאות שהושגו עם פרוטוקול זה, מיקרוסקופיה קונפוקלית ניתן להמחיש את ההפצה של החלבונים שמעצבת וכדי ללמוד לוקליזציה משותפת שלהם. לפיכך, מצאנו טאט-Cx43266-283- B ו- c-Src שהתערוכה הזו התפלגות תאיים דומה עם כמה נקודות של שיתוף לוקליזציה המאשרת את התוצאות שהושגו עם הניסויים נפתחים. למעשה, TAT-Cx43266-283- B מופץ קרוב קרום פלזמה רומז כי המטען, במחקר זה Cx43266-283, מנחה את המולקולה לעמיתיו תאיים.
אחת המגבלות של השיטה המוצעת היא כי המולקולה לשמש פיתיון עלול לגרום לכשל לקפל כמו שצריך ואת ההשפעות הצפויות לא יימצאו. במצב זה, האינטראקציות נמצאו אין אפשרות לשייך על אפקט. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מעניין במיוחד עבור האינטראקציות מעורב האות התמרה חושית מסלולים כי הם מתבצעים בדרך כלל על-ידי אזורים ממהותם המתוסבכים32 , ולכן הם אינם דורשים של קיפול מסודרות. בנוסף, אחד היתרונות של השיטה המוצעת היא כי מסלול הזמן של האינטראקציה ניתן בעקבות, אשר רלוונטי במיוחד עבור אינטראקציות ארעית. יתר על כן, הרלוונטיות של כל השאריות על האינטראקציה שניתן בקלות ללמוד. אכן, זה אפשרי ללמוד את הרלוונטיות של שינויים posttranslational על אינטראקציית חלבון-חלבון, למשל, על ידי החלפת phosphomimetic גלוטמט על סרין או תריאונין ברצף. באופן דומה, החלפה של סרין או תראונין עבור אלנין או טירוזין ל פנילאלנין מאפשר בדיקת ההשפעה של סרין phosphorylatable, תראונין או טירוזין.כדי לחקות פוספו-טירוזין, הדרך המדויקת ביותר היא ההחלפה של טיר עבור p-טיר33.
לבסוף, הטווח של פרוטוקול זה הוא הרבה מעבר אינטראקציית חלבון כי מערכת זו ניתן להחיל על מטענים ביואקטיביות אחרים כגון ה-RNA רצפים, חלקיקים, וירוסים או מולקולות אחרות אשר יכול להיות דבוקה ביוטין, transduced עם CPP ללמוד מנגנון תאיים שלהם הפעולה.

אינטראקציות חלבון-חלבון חיוניים עבור מגוון גדול של תהליכים תאיים. להבין תהליכים אלה, נדרשות שיטות לזיהוי אינטראקציות חלבון בתוך הסביבה תאיים מורכבים. באחת השיטות בשימוש כדי לזהות אינטראקציה עם שותפים של חלבון היא להשתמש את הפרוטאין או פפטיד מימטי של חלק את הפרוטאין כפיתיון בניסויים משיכה זיקה ואחריו זיהוי מחייב חלבונים. מערכת אבידין-ביוטין משמש לעתים קרובות בשל זיקה גבוהה, ירידה לפרטים יציב האינטראקציה בין אבידין ו ביוטין1,2. בדרך כלל, ביוטין מאוגד covalently הפיתיון (חלבון או פפטיד), לאחר תקופת דגירה עם lysates התא כדי לאפשר הקמת אינטראקציות, הפיתיון biotinylated מאוגדים לעמיתיו תאיים מורד אבידין או אבידין נגזרים מצומדת עם תמיכה חרוזים. לאחר מכן, פיתיון חלבונים מזוהים אחרי כביסה, • תנאי ו ניתוח מאת denaturing אלקטרופורזה ואחריו תספיג חלבון. אחת הבעיות של טכניקה זו היא כי האינטראקציות בין החלבון עניין ושותפיה תאיים מתקיימים מחוץ להקשר הסלולר. זה חשוב במיוחד עבור האינטראקציות מעורב האות התמרה חושית מסלולים כי הן מתרחשות במקומות תאיים ספציפיים, הם ארעיים, הם מתבצעים בדרך כלל על ידי חלבונים לא שופע. לכן, בתוך lysates תא אינטראקציות אלה יכול להיות רעולי פנים על-ידי אחרים חלבונים בשפע רב יותר או חלבונים אשר בדרך כלל אינם בסמיכות.
פפטידים חודר לתא (CPPs) הם קצרים פפטידים (חומצות אמינו ≤40), מורכב בעיקר על ידי חומצות אמינו cationic המסוגלים להעביר מגוון רחב של מולקולות אל תוך התא כמעט כל3. מטענים כגון חלבונים, דנ א פלסמיד, siRNA, וירוסים, סוכני דימות חלקיקים שונים יש כבר מצומדת CPPs, ביעילות למביטה4,5. בגלל יכולת קיבול זו הם הידוע גם חלבון התמרה חושית תחומים (PTDs), קרום רצפים translocating (MTSs) ופפטידים טרויאני. בקרב CPPs, פפטיד בלשכת המידע לתיירים של החלבון transactivator HIV TAT6 כבר אחת נרחב ביותר למד 7,8,9. TAT היא nonapeptide מכיל ארגינין 6, 2 ומשקעים ליזין, כתוצאה מכך הוא cationic מאוד. החלפת מחקרים הראו כי המטען החיובי נטו של תאת הכרחי עבור אלקטרוסטאטיות עם פלזמה הממברנות של התאים האיקריוטים ו שלה הפנמה עוקבות10. באופן דומה על CPPs אחרים, TAT מפרוטונים שמטענם חריפה נקשר electrostatically-אניון המינים השונים נוכח פני השטח חוץ-תאי של קרום התא, כולל קבוצות ראש השומנים, glycoproteins ו- proteoglycans3 , 10. מטעני ביואקטיביות לליברה TAT שיתפנה מיד ב ציטוזול להגיע זוגם תאיים.
כאן אנו מציגים שיטה המשלבת את CPP בלשכת המידע לתיירים עם ביוטין ללמוד אינטראקציות תאיים. המטרה היא לעצב פיתיונות חודר לתא על ידי מיזוג של biomolecule היעד TAT, ביוטין. היתרון העיקרי של הצעה זו היא כי האינטראקציות בין הפיתיון ושותפיה יתקיים בתוך ההקשר הסלולר שלה. כדי להציג את היעילות של שיטה זו השתמשנו כפיתיון רצף קטן של החלבון Cx43 שדווחו לתקשר intracellularly עם12,1311,c-Src proto-oncogene. Cx43 הוא חלבון ממברנלי אינטגרלי מתבטאת נרחב האסטרוציטים14והוא למטה מוסדר ב gliomas בדרגה גבוהה, גידול ממאיר הנפוצות ביותר מערכת העצבים המרכזית15,16,17 ,18. . זה היה בעבר הראו כי האזור Cx43 המקיים אינטראקציה עם c-Src (חומצות אמינו 266-283 Cx43 האנושי; Pubmed: P17302) התמזגו כדי תאת (TAT-Cx43266-283) מעכב את הפעילות oncogenic של תאים glioma c-Srcin ו glioma גזע תאים (GSCs)19,20,21. כדי לעצב את הפיתיון תאיים, Cx43266-283 יש כבר התמזגו טאט-קצה אמיני (TAT-Cx43266-283), ביוטין-קצה קרבוקסילי (TAT-Cx43266-283- B). אסטרטגיה זו כבר בהצלחה בשימוש של glioma עכברוש קו תא C6 לזהות c-Src, c-מסוף Src קינאז (צסק א) ופוספטאז, tensin homolog (PTEN) כשותפים תאיים של אזור זה של Cx4320. כאן, אנו מתארים שיטה זו בדיקות יעילותה GSCs האנושי, אשר מאוד רלוונטי לטיפול glioma אבל הרבה יותר transfect מאשר glioma הלא-גזע תאים.

<table><tbody><tr><td>קו G166 GSC</td><td>BioRep</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RHB-A מדיום תאי גזע</td><td>Takara</td><td>Y40001</td><td></td></tr><tr><td>חלבון עכבר למינין</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>10 ומיקרו; גר'/מ"ל</td></tr><tr><td>B-27 תוסף תזונה ללא סרום (50X)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>2%</td></tr> <tr><td>N-2 תוסף (100x)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>1%</td></tr> <tr><td>רקומביננטי אנושי EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>20 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>20 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4: במים נטולי יונים, 136 מ"מ NaCl; 2.7 מ"מ KCl; 7.8 מ"מ Na2HPO4&middot; 2H2O ; 1.7 מ"מ KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10 מדיום שימור הקפאה</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>TAT</td><td>GenScript-Custom</td><td></td> <td>made</td></tr><tr><td>TAT-B</td><td>GenScript-Custom</td><td></td> <td>made</td>TAT-Cx43</tr><tr><td>266-283</td><td>GenScript-Custom</td><td></td> <td>made</td></tr><tr><td>TAT-Cx43266-283-B</td><td>GenScript-Custom</td><td></td> <td>made</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A1275737</td><td>1/20</td></tr><tr><td>נוגדן עכבר חד-שבטי ואלפא;-טובולין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1/500</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>בדיקות מולקולריות, טכנולוגיות חיים, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>1.25 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>Pierce&trade; NeutrAvidin&סחר; Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה של חלבון: 5 מ"מ Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 מ"מ EDTA, 2 מ"מ</td> מעכב פרוטאז EGTA <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סט קוקטייל III. Calbiochem ללא EDTA</td><td>, Bionova</td><td>539134</td><td>1/100 (v/v)</td></tr> <tr><td>נתרן פלואוריד</td><td>PanReac AppliChem</td><td>141675</td><td>1 מ"מ</td></tr><tr><td>פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>1 מ"מ</td></tr><tr><td>נתרן אורתובנאדאט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td>0.1 מ"מ</td></tr><tr><td>חוצץ Laemmli: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M גליצרול; 3.7% (w/v) SDS; 0.6 M & בטא;-מרקפטואתנול או 9 מ"מ DTT; 0.04% (v/v) ברומופנול כחול (BB).</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12%</td> <td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WG1402box</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS מאגר ריצה (20X)</td> <td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td>1X</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer 20x</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0006</td><td>1X</td></tr><tr><td>דיוק פלוס חלבון צבע כפול תקן</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 NC ערימות רגילות (ממברנות ניטרוצלולוזה)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Dry Blotting System - מכשיר העברת ג'ל</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) ב-5% חומצה אצטית (v/v)) במים</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>FAK polyclonal rabbit antibody</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>AHO0502</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Src polyclonal rabbit</td><td>antibody Signalling Cell Signalling (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Csk polyclonal rabbit</td><td>antibody Signalling Cell Signalling (WERFEN)</td><td>4980</td><td>1/500</td></tr><tr><td>PTEN נוגדן עכבר פוליקלונלי</td><td>איתות תאים (WERFEN)</td><td>9552</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Caveolin-1 נוגדן ארנב פוליקלונלי</td><td>Abcam</td><td>ab2910</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>נוגדן עיזים נגד עכבר IgG-HRP</td><td>Quimigen, סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>Sc-2005</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>נוגדן עיזים נגד ארנב IgG-HRP</td><td>Quimigen, סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-2030</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagent</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>Src נוגדן ארנב פוליקלונלי</td><td>איתות תאים (WERFEN)</td> <td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>תמיסת נוגדנים: PBS, 10% FBS, 0.1 M ליזין, 0.02% נתרן אזיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>סטרפטווידין מצומד Cy2</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-220-089</td><td>1/500</td></tr><tr><td>MicroChemi מערכת זוהר</td> מערכות <td></td><td></td><td>הדמיה ביולוגית</td></tr><tr><td>DNA ערכת אפופטוזיס של תאים מתים עם Annexin V Alexa Fluor&reg; 488 & Propidium Iodide (PI)</td> <td>בדיקות מולקולריות, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>V13241</td><td>1/500</td></tr><tr><td>SlowFade Gold antifade Reagent</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד לספקטרוסקופיה UV, >=99.8% (GC)</td> <td>Honeywell</td><td>41641-1L</td><td></td></tr><tr><td>Appliskan 2001</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חודר biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

כאן אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים המבוססים על מערכת נפתחים ביוטין-אבידין בשימוש נרחב. השינוי הציג כוללת השילוב של טכניקה זו עם רצפי חודר לתא. אנו מציעים עיצוב פיתיונות חודר לתא יכול להיות מודגרות עם תאים חיים במקום תא lysates, ולכן האינטראקציות נמצאו ישקף אלה המתרחשות בתוך ההקשר תאיים. Connexin43 (Cx43), חלבון המהווה gap junction ערוצים ו- hemichannels הוא למטה מוסדר ב gliomas בדרגה גבוהה. האזור Cx43 הכוללת חומצות אמינו 266-283 אחראי על עיכוב הפעילות oncogenic של c-Src glioma תאים. כאן אנו משתמשים תאת. כמו רצף חודר לתא, ביוטין התג נפתחים, האזור של Cx43 מורכבת בין חומצות אמינו 266-283 היעד נמצא אינטראקציות תאיים תאי גזע glioma אנושי קשה-עד-transfect אחת המגבלות של השיטה המוצעת היא כי מולקולת לשמש פיתיון עלול לגרום לכשל לקפל כראוי, וכתוצאה מכך, האינטראקציות נמצאו אין אפשרות לשייך עם האפקט. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מעניין במיוחד עבור האינטראקציות מעורב האות התמרה חושית מסלולים כי הם מתבצעים בדרך כלל לפי אזורים המתוסבכים ממהותם, לכן, הם אינם דורשים של קיפול מסודרות. בנוסף, אחד היתרונות של השיטה המוצעת היא כי ניתן יהיה ללמוד בקלות הרלוונטיות של כל השאריות על האינטראקציה. זוהי מערכת מודולרית; לכן, רצפים אחרים חודר לתא תגים אחרים, מטרות תאיים אחרים יכול להיות מועסק. לבסוף, הטווח של פרוטוקול זה הוא הרבה מעבר אינטראקציית חלבון כי מערכת זו ניתן להחיל על מטענים ביואקטיביות אחרים כגון ה-RNA רצפים, חלקיקים, וירוסים או כל מולקולה זה יכול להיות transduced עם רצפי חודר תא ו התמזגו לתגים נפתחים ללמוד שלהם מנגנון פעולה תאיים.

לפני השימוש BCPPs ללמוד אינטראקציה תאיים, חיוני כדי להשוות את ההשפעות של BCPP לעומת CPP כדי לאמת את התוצאות המתקבלות עם BCPP. כתוצאה מכך, ללמוד אם ההכללה של ביוטין משנה את הפעילות של הרצף היעד, תחילה ניתחנו את השפעת טאט-Cx43266-283- B לעומת טאט-Cx43266-283 -מורפולוגיה G166 GSCs. כדי לעשות זאת, ביצענו כמה ניתוחים immunofluorescence של שני חלבונים cytoskeletal, F-אקטין וα-טובולין לאחר 24 שעות של טיפול. איור 1 מראה כי G166 GSCs בנוכחות TAT-Cx43 50 מיקרומטר266-283 או בלשכת המידע לתיירים-Cx43266-283- B לרכוש צורה מעוגלת יותר בהשוואה מוארך ומורחבת prolongations הסלולר שמוצג הפקדים (TAT או בלשכת המידע לתיירים-B). למעשה, איור 1b מראה כי אקטין חוטים הם בעיקר התאספו כרשתות אקטין כאשר התאים שטופלו טאט-Cx43266-283 או בלשכת המידע לתיירים-Cx43266-283- B ואילו הם יוצרים עוד חבילות אקטין בתאים שליטה (שטופלו בלשכת המידע לתיירים או TAT-B)25. לעומת זאת, α-טובולין ההפצה אינה משתנה בין התנאים שונים. התוצאות הראו כי הנוכחות של ביוטין לא לשנות את ההשפעה של רצף המטרה על המורפולוגיה של G166 GSCs. ב20,הקודם מחקרים21, הראינו כי טאט-Cx43266-283 צמצם התפשטות G166 GSCs. במחקר זה, חקרנו אם טאט-Cx43266-283- B מפעילה אותם אפקטים בבית הגידול כמו TAT-Cx43266-283. כדי לעשות זאת, ניתחנו התפשטות G166 GSCs על ידי MTT assay לאחר 72 שעות של טיפול. וזמינותו MTT הוא ערכי צבע מוחלטים assay להערכת פעילות חילוף החומרים של התא. MTT עובר מטבוליזם על ידי אנזימים oxidoreductase NAD (P) H בתוך המיטוכונדריה המשקף את מספר התאים קיימא הנוכחי. איור 2 מציג כי הקטנת הכדאיות תא G166 GSCs אינה שונה באופן משמעותי כאשר תאים שטופלו 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283 או 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- בי אכן, שניהם פחתה באופן משמעותי G166 GSCs התפשטות לעומת הפקד, TAT או בלשכת המידע לתיירים-בי
ברגע לנו אישר כי ההשפעה של רצף המטרה שלנו ב G166 GSCs (TAT-Cx43266-283) לא שונה על ידי הכללת ביוטין-קצה קרבוקסילי (TAT-Cx43266-283- B), חקרנו השותפים תאיים של הרצף הזה בעקבות הפרוטוקול המתוארים במחקר זה (איור 3). כי caveolae היה מעורב המנגנון של תאת הפנמה26, ניתחנו את הנוכחות של caveolin-1 (קו-1) ב- pull-דאונס. תספיג חלבון ניתוח (איור 4) הראה את תאת-B ו- TAT-Cx43266-283- B אינטראקציה עם קו-1. עם זאת, היכולת של טאט-Cx43266-283- B לגייס c-Src, PTEN ו צסק א הוא חזק יותר מאשר עם TAT-בי מוקד אדהזיה קינאז (המשיכו) הוא מצע של c-Src זה לא הוכח לקיים אינטראקציה עם Cx43. אכן, המשיכו לא הראה כל אינטראקציה משמעותית עם TAT-B או בלשכת המידע לתיירים-Cx43266-283- בי
כדי לאשר את האינטראקציה בין טאט-Cx43266-283- B ו- c-Src, G166 GSCs היו מודגרות עם 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- B במשך 30 דקות ולוקליזציה שלהם היה ואחריו עם פלורסנט streptavidin קונפוקלית (איור 5 ). התוצאות שלנו הראה כי ההתפלגות תאיים של טאט-Cx43266-283- B נמצא קרום פלזמה (מוצג על-ידי phosphatidylserine מכתים), תואמת של c-Src. למעשה, ניתוח ושיתוף לוקליזציה חשף כמה נקודות של שיתוף לוקליזציה (לבן) בין טאט-Cx43266-283- B ו- c-Src בתמונה מיזוג. כתוצאה מכך, מיקרוסקופיה קונפוקלית מחקרים מאשרים את התוצאות שהושגו עם פרוטוקול נפתחים BCPP המתוארים במחקר זה.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig1.jpg"> 
איור 1: ההשפעה של BCPP ו- CPP-GSC מורפולוגיה. G166 GSCs מצופים-צפיפות נמוכה (2 x 104 תאים / ס מ2) לאחר 24 שעות הם היו מתפשט באמצעות מיקרומטר 50 שליטה CPP (TAT), לשלוט BCPP (TAT-B), טיפול CPP (TAT-Cx43266-283) או טיפול BCPP (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-אקטין (אדום), α-טובולין (ירוק), ממוזג + דאפי immunostaining של השדה באותו מראה מורפולוגיה G166 GSCs. ברים = 50 מיקרומטר. b) F-אקטין immunostaining מציג את חלוקה שונה של F-אקטין ב- G166 GSCs לאחר דגירה במשך 24 שעות ביממה עם 50 מיקרומטר לשלוט CPP (TAT) או לשלוט BCPP (TAT-B) לעומת טיפול 50 מיקרומטר CPP (TAT-Cx43266-283) או BCPP (TAT-Cx43 266-283-B). הסורגים = 10 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig2.jpg"> 
איור 2: ההשפעה של BCPP ו- CPP-GSC הכדאיות. G166 GSCs היו מצופים-תאים/cm 55002 ב- 24-multiwell צלחות, מודגרות עם פפטידים שליטה מיקרומטר 50, CPP (TAT) או BCPP (TAT-B), או פפטידים לטיפול מיקרומטר 50, CPP (TAT-Cx43266-283) או BCPP (TAT-Cx43266-283- B). הכדאיות תא נותחו באמצעות assay MTT לאחר 72 h. התוצאות מבוטא MTT absorbances ויש s.e.m. זאת אומרת ± לפחות 3 ניסויים (+ + p˂0.01 לעומת שליטה. * * p˂0.01, * * * p˂0.001 vs בלשכת המידע לתיירים או בלשכת המידע לתיירים-B; חד-כיווני אנובה withTukey שלאחר מבחן). שימו לב כי אין הבדלים משמעותיים בין השפעת CPPs vs BCPPs. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig3.jpg"> 
איור 3: פרוטוקול דיאגרמה. תיאור גרפי שלב אחר שלב של ההליך כמתואר בסעיף "פרוטוקול" מ הדגירה BCPPs עד BCPPs eluted וחלבונים שמעצבת שלהם היו obtained.1) דגירה התרבות תאים עם BCPPs על הריכוז הרצויה עבור הזמן הנדרש. 2) במהלך הדגירה, הם הפנימו את BCPPs, הם לקיים אינטראקציה עם שותפיהם תאיים. 3) לשטוף את התאים שלוש פעמים על הקרח עם PBS קר כקרח. 4) lyse התאים כדי לחלץ חלבונים. 5) העברת תא lysates צינורות.6) ספין-x 11000 g עבור 10 דקות ב 4 º C. 7) להעביר supernatants כדי צינורות חדשים (א) ושמור aliquot קטנים של lysates כדי התהליך כמו מערבי רגיל כתם דוגמאות צינור (B). 8) resuspend את החרוזים NeutrAvidin Agarose ולהוסיף 50 µL כל שפופרת באמצעות טיפ פיפטה לחתוך. 9) דגירה ברעידות בעדינות במשך 12 שעות ב 4 ° C כדי לאפשר את החרוזים agarose NeutrAvidin לקיים אינטראקציה עם BCPPs ובת זוגו. 10) ספין בשביל 1 דקות ב 3000 x g כדי הצניפה החרוזים עם biotinylated פיתיונות, חלבונים שמעצבת שלהם קשורות אליהם. 11) להעביר את supernatants אל צינורות חדשים (ג) ולשמור אותם לשימוש במקרה נפתחים צריך לחזור. 12) לשטוף בגדר חמש פעמים עם מאגר פירוק טריים, resuspend על-ידי היפוך, ספין בשביל 1 דקות ב 3000 x g וזורקים את תגובת שיקוע. 13) להסיר את כל תגובת שיקוע בקפידה. 14) להוסיף האחסון הרצוי של 4 x מאגר Laemmli, elute את החלבונים ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דק 15) ספין-x 8200 g עבור 30 s כדי הצניפה החרוזים. 16) להעביר את החלבונים eluted למצוא את תגובת שיקוע עם טיפים נימי צינורות חדשים (D). 17) להעמיס על ג'לים לניתוח תספיג חלבון. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig4.jpg"> 
איור 4: לימוד של אינטראקציות תאיים של טאט-Cx43266-283- B ב- G166 GSCs על ידי נפתחים ואחריו תספיג חלבון. G166 GSCs היו מודגרות עם 50 מיקרומטר טאט-B או בלשכת המידע לתיירים-Cx43266-283- בי לאחר lysed את התאים היו 30 דקות ו TAT-B או טאט-Cx43266-283- B קשור זוגם תאיים משכו עם חרוזים NeutrAvidin. החלבונים eluted היו טעונים, נותחו על ידי תספיג ללמוד את רמות המשיכו, c-Src, צסק א, PTEN וקו-1. שים לב כי קו-1 אינטראקציה עם שני טאט-B ולתקשר טאט-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN ו צסק א מעדיפים עם TAT-Cx43266-283- B ו המשיכו לא הראה אינטראקציה כלשהי עם TAT-B או בלשכת המידע לתיירים-Cx43266-283-B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig4large.jpg" target="_blank">בבקשה לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig5.jpg"> 
איור 5: אישור טאט-Cx43266-283- B תאיים האינטראקציות G166 GSCs על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. G166 GSCs היו מודגרות עם 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- בי לאחר 30 דקות, היו תאים קבוע, עיבוד כדי להתאים לשפה טאט-Cx43266-283- B עם Cy2-Streptavidin (ירוק), c-Src מאת immunofluorescence (אדום) ו- phosphatidylserine עם annexin V (כחול). שימו לב כמה נקודות של שיתוף לוקליזציה (לבן) בין טאט-Cx43266-283- B ו- c-Src קרוב קרום פלזמה של מיזוג תמונות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

זהו פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים המבוסס על מערכת נפתחים ביוטין-אבידין עם החידוש של שילוב רצפים חודר לתא. היתרון העיקרי הוא הרצף היעד מודגרת עם תאים חיים במקום תא lysates, ולכן האינטראקציות תתרחש בתוך ההקשר הסלולר.

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון בהקשר תוך-תאי. זה מושג באמצעות מערכת משיכה של ביוטין-אבידין בשילוב עם רצפים חודרים עצמיים, המאפשרים דגירה ברצף המטרה עם תאים חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום איתות התא כגון האינטראקציות המהירות והדינמיות בין ביומולקולות כדי לקבל אותות ספציפיים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהאינטראקציות המולקולריות מתרחשות בהקשר תוך-תאי. במחקר זה, צלחת תאי גזע גליומה G166 אנושיים או GSCs בארבע צלוחיות של 150 סנטימטרים רבועים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עבד את התאים כאשר מגיעים למפגש.כאשר חמישה מיליון תאי G166 מצופים בבקבוק של 150 סנטימטר מרובע, הם מעובדים יומיים לאחר הציפוי. סובב את הבקבוקונים המכילים את הפפטידים החודרים לתאים ביוטיניליים ב-8, 200 פעמים גרם למשך 30 שניות כדי למנוע חלק מהאבקה להישאר על המכסה. כלול BCPP מבוקר כדי לוודא שהאינטראקציות שנמצאו הן ספציפיות לרצף היעד.לאחר מכן, ממיסים את ה- BCPPs במדיום התרבות המתאים לתמיסת המלאי שצוינה על ידי היצרן. כדי להשיג תמיסת מלאי של שני מיליגרם למיליליטר BCPP לטיפול ב-GSC, הוסף 0.5 מיליליטר של מדיום תרבית GSC לבקבוקון אחד המכיל מיליגרם אחד של BCPP. מערבל את הבקבוקונים וודא שהפפטיד מומס היטב.הכן לפחות 12 צינורות של 1.5 מיליליטר לכל מצב בבדיקה הנפתחת לביצוע. סמן את שלושת הצינורות הראשונים לכל מצב. יהיה להם הנפח הכולל של ליזטים סלולריים.לאחר מכן, סמן A על שלושה צינורות לכל מצב. בצינורות אלה יהיו הסופרנטנטים הראשונים המתקבלים לאחר ליזה וסיבוב הליזטים התאיים. לאחר מכן, סמנו B על שלושה צינורות לכל מצב.בצינורות אלה יהיה מאגר קטן של הסופרנטנטים הראשונים לדגימות כתמים מערביים. לבסוף, סמן C על שלושה צינורות לכל תנאי. צינורות אלה יכילו את הסופרנטנטים המתקבלים לאחר המשיכה עם NeutrAvidin.לאחר שאיבת מדיום התרבות מהתאים, החלף בנפח המתאים של המדיום הטרי הנדרש לדגירת ה- BCPPs בנפח המדיום הקטן ביותר האפשרי בהתאם לזמני הדגירה. חשוב מאוד שבכל מקרה המדיום יכסה לחלוטין את כל שטח הבקבוק. הוסף את נפח תמיסת המלאי של BCPP לתרביות התאים כדי להגיע לריכוז שהוכח כיעיל.לכן, הוסף 92.8 מיקרוליטר של שני מיליגרם למיליליטר של TAT-connexin 43 266-283 ביוטין למיליליטר של מדיום תרבית. הניחו את התאים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות כדי לוודא שהאינטראקציות בין ה-BCPP לשותפיו התוך-תאיים מתרחשות. כדי לבצע את מיצוי החלבון, שאפו תחילה את מדיום התרבות לחלוטין, ואז שטפו את התאים ב-10 מיליליטר של מי מלח פוספט קרים כקרח לכל 150 סנטימטרים בזהירות רבה כדי למנוע ניתוק עצמי.כדי להשיג את ליזאט התא, הוסף שלושה מיליליטר של מאגר ליזה לכל בקבוק של 150 סנטימטר מרובע וגרד היטב את פני השטח באמצעות מגרד תאים. הטיית הבקבוק לכ- 45 מעלות תקל על איסוף הליזטים של התאים לצינורות המתאימים להם. יוצקים מיליליטר אחד של הליזאט הסלולרי לכל שפופרת לשלושה צינורות של 1.5 מיליליטר המסומנים לפי מצב.לצורך המשיכה, צנטריפוגה את צינורות ה-1.5 מיליליטר ב-11,000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים המסומנים A.העבירו מנה של הסופרנטנט לכל מצב לצינורות שונים המסומנים B.לאחר מכן, הוסיפו 16.6 מיקרוליטר של מאגר 4x Laemmli עבור 50 מיקרוליטר ליזאט והקפיאו במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הומוגניזציה של אגרוז NeutrAvidin היטב על ידי ניעור עדין.חותכים את קצות קצות הפיפטה כדי להגדיל את קוטרם ולשפר את פיפטינג החרוזים. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של NeutrAvidin agarose לכל מיליליטר של ליזאט תאים בצינורות A. דגרו על ליזאטים של התא בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה עם ניעור עדין מאוד כדי לאפשר ל-NeutrAvidin לקיים אינטראקציה עם BCPPs הקשורים לשותפיהם התוך-תאיים.לאחר מכן, צנטריפוגה ב-3,000 פעמים גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את קומפלקס ה-NeutrAvidin עם חלבונים. הסר בזהירות את הסופרנטנטים והעביר אותם לצינורות נקיים המסומנים C. שמור אותם לשימוש למקרה שהמשיכה לא תצליח. כדי לשטוף את הקומפלקס של NeutrAvidin בחלבונים, הוסף מאגר ליזה טרי לכדורי צינורות A.השעו מחדש את הגלולה על ידי היפוך וחזרו על הצנטריפוגה. חזור על הכביסה הזו חמש פעמים נוספות. ניתן להשליך את כל הסופרנטנטים הללו.לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר של 2x Laemmli buffer לכל צינור של 1.5 מיליליטר עבור כדורים המתקבלים מ-150 סנטימטר רבוע של צלוחיות של תאים מתלכדים. לאחר מכן, יש לשטוף ב-100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לנתק את האינטראקציות בין החלבונים. לאחר הפליטה, צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-8, 200 פעמים גרם כדי לגלול חרוזי NeutrAvidin.העבירו את הסופרנטנטים המכילים את החלבונים המנותקים עם קצות נימיים לצינורות חדשים המסומנים D. סופרנטנטים אלה מוכנים כעת להעמסה בכתם מערבי כמתואר בפרוטוקול הטקסט או שניתן להקפיא אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. מוצגות כאן תמונות אימונוציטוכימיה המראות כי היתוך של ביוטין ל-TAT-connexin 43 266-283 אינו משנה את ההשפעות של הפפטיד החודר לתאים על מורפולוגיה של תאי גזע של גליומה. ניתוח ה-MTT של GSC שטופל ב-BCPP או CPP מראה כי היתוך של ביוטין ל-TAT-connexin 43 266-283 אינו משנה את ההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית של TAT-connexin 43 266-283 על GSC.תוצאות מייצגות של משיכת BCPP ואחריה כתם מערבי מוצגות כאן. כתם מערבי מראה כי חלבונים המתוארים כמקיימים אינטראקציה עם TAT, למשל, Cav-1, מופיעים בשני המצבים. חלבונים המתוארים כאינטראקציה עם Cx43, למשל, c-Src ו-PTEN, מופיעים מיד לאחר משיכה של TAT-connexin 43 266-283, בעוד שחלבונים שאינם מקיימים אינטראקציה ישירה עם Cx43 או TAT אינם קיימים, למשל, FAK.תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית מאשרות את האינטראקציות התוך-תאיות שנמצאו עם ה-BCPPs. התמונות מציגות את הקולוקליזציה התוך-תאית של TAT-connexin 43 266-283 עם c-Src קרוב לקרום הפלזמה ב-G166 GSCs. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לאשר את הטמפרטורה של הריאגנטים והצנטריפוגה וכן את מפגש התאים לפני הוספת הפפטידים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון תוך תאיות באמצעות פפטידים חודרי תאים ביוטיניליים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום האיתות התאי לחקור מנגנונים מולקולריים תוך-תאיים ואת המסלולים הספציפיים לקו שלהם בתאי תרבית, תרביות אורגנוטיפיות ואפילו מודלים in vivo.בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש במטענים ביו-אקטיביים אחרים כגון רצפי RNA, ננו-חלקיקים, וירוסים או מולקולות אחרות שיכולים לעבור עם פפטידים חודרים לתאים ולהתמזג ל-TATs נשלפים כדי לחקור את מנגנון הפעולה התוך תאי שלהם. למרות שלא כלולים חומרים מסוכנים במיוחד בפרוטוקול זה, אל תשכח ללבוש כפפות וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.

biotinylated-cell-penetrating-peptides-to-study-intracellular-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

סרטון זה מדגים טכניקה המשתמשת בפפטידים חודרי תאים ביוטינילציה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון תוך-תאי. הפפטידים חודרי התא מאפשרים לפפטיד המצומד להיכנס לתא ולהיקשר באופן ספציפי לחלבונים המקיימים אינטראקציה איתו. הביוטין, לאחר קשירה לאבידין, מאפשר טיהור של קומפלקס החלבונים המקיימים אינטראקציה מליזט התא.

בדיקת פפטיד חודר תאים ביוטינילציה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון

בדיקת מערך פפטידים היא בדיקת תפוקה גבוהה לזיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבון לחלבון. זה מאפשר מיפוי אינטראקציות מרובות של חלבון מטרה ויכול לשמש כשיטה לזיהוי אתרים למעכבים המכוונים לחלבון. כאן אנו מתארים פרוטוקול לסינון וניתוח מערכי פפטידים.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

אנו מתארים שיטה ליצירת לוקליזציה וטיהור זיקה (LAP) קווי תאים יציבים הניתנים להשראה לחקירת תפקוד חלבון, לוקליזציה תת-תאית מרחבית-זמנית ורשתות אינטראקציה בין חלבון-חלבון.

LAP-tagged מושרה שורות תאים יציבות על תפקוד החלבון חוקר, Spatiotemporal לוקליזציה רשתות אינטראקציה חלבון

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול לטיהור ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה זיקה (BiCAP). שיטה חדשנית זו מקלה על ספציפיות בידוד ואפיון פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם של כל שני חלבונים אינטראקציה, בעוד למעט האו ם-ומורכבת חלבונים בודדים, כמו גם מתחמי הקים עם שותפים איגוד מתחרות.

ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור פיצול-BioID, שיטת שברי-קומפלמנטציה מבוסס על טכניקת קרבה-תיוג BioID. מופעל על האינטראקציה של שני חלבונים נתונה, היא מאפשרת ניתוח פרוטאומיקס של חלבונים תלויי-ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית. השיטה היא פשוטה, חסכונית ודורש רק ציוד מעבדה סטנדרטיים.

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של חלבונים התאגד כדי אינוזיטול פוספטים או פוספופנוסיידים. היא משתמשת בכרומטוזיקה באמצעות מלחי הביוטיטול או פוספופנוסידים הנמצאים בדרך streptavidin לחרוזים או חרוזי מגנטים. אינוזיטול פוספט או פוספוליזיסיטייז מחייב חלבונים מזוהים על ידי בלוק מערבי או ספקטרומטריה מאסיבית.

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

הפרוטוקול מציג שיטה להצמדה קוולנטית in vivo של ביוטין לחלבונים על סמך קרבתם לביוטין ליגאז המותך לחלבון מעניין. שינוי זה מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים באמצעות חרוזי סטרפטווידין לפי הצורך במחקרי אינטראקציה עם חלבונים.

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

חקור אינטראקציות חלבון-חלבון בתוך תאים חיים באמצעות פפטידים חודרי תא מוביוטינילים. השיטה משתמשת במערכת pull-down ביוטין-אבידין כדי לחשוף דינמיקת אותות תאית בגידולי G166 glioma stem cells.

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

גלה סרטונים נוספים