חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון בהקשר תוך-תאי. זה מושג באמצעות מערכת משיכה של ביוטין-אבידין בשילוב עם רצפים חודרים עצמיים, המאפשרים דגירה ברצף המטרה עם תאים חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום איתות התא כגון האינטראקציות המהירות והדינמיות בין ביומולקולות כדי לקבל אותות ספציפיים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהאינטראקציות המולקולריות מתרחשות בהקשר תוך-תאי. במחקר זה, צלחת תאי גזע גליומה G166 אנושיים או GSCs בארבע צלוחיות של 150 סנטימטרים רבועים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עבד את התאים כאשר מגיעים למפגש.

כאשר חמישה מיליון תאי G166 מצופים בבקבוק של 150 סנטימטר מרובע, הם מעובדים יומיים לאחר הציפוי. סובב את הבקבוקונים המכילים את הפפטידים החודרים לתאים ביוטיניליים ב-8, 200 פעמים גרם למשך 30 שניות כדי למנוע חלק מהאבקה להישאר על המכסה. כלול BCPP מבוקר כדי לוודא שהאינטראקציות שנמצאו הן ספציפיות לרצף היעד.

לאחר מכן, ממיסים את ה- BCPPs במדיום התרבות המתאים לתמיסת המלאי שצוינה על ידי היצרן. כדי להשיג תמיסת מלאי של שני מיליגרם למיליליטר BCPP לטיפול ב-GSC, הוסף 0.5 מיליליטר של מדיום תרבית GSC לבקבוקון אחד המכיל מיליגרם אחד של BCPP. מערבל את הבקבוקונים וודא שהפפטיד מומס היטב.

הכן לפחות 12 צינורות של 1.5 מיליליטר לכל מצב בבדיקה הנפתחת לביצוע. סמן את שלושת הצינורות הראשונים לכל מצב. יהיה להם הנפח הכולל של ליזטים סלולריים.

לאחר מכן, סמן A על שלושה צינורות לכל מצב. בצינורות אלה יהיו הסופרנטנטים הראשונים המתקבלים לאחר ליזה וסיבוב הליזטים התאיים. לאחר מכן, סמנו B על שלושה צינורות לכל מצב.

בצינורות אלה יהיה מאגר קטן של הסופרנטנטים הראשונים לדגימות כתמים מערביים. לבסוף, סמן C על שלושה צינורות לכל תנאי. צינורות אלה יכילו את הסופרנטנטים המתקבלים לאחר המשיכה עם NeutrAvidin.

לאחר שאיבת מדיום התרבות מהתאים, החלף בנפח המתאים של המדיום הטרי הנדרש לדגירת ה- BCPPs בנפח המדיום הקטן ביותר האפשרי בהתאם לזמני הדגירה. חשוב מאוד שבכל מקרה המדיום יכסה לחלוטין את כל שטח הבקבוק. הוסף את נפח תמיסת המלאי של BCPP לתרביות התאים כדי להגיע לריכוז שהוכח כיעיל.

לכן, הוסף 92.8 מיקרוליטר של שני מיליגרם למיליליטר של TAT-connexin 43 266-283 ביוטין למיליליטר של מדיום תרבית. הניחו את התאים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות כדי לוודא שהאינטראקציות בין ה-BCPP לשותפיו התוך-תאיים מתרחשות. כדי לבצע את מיצוי החלבון, שאפו תחילה את מדיום התרבות לחלוטין, ואז שטפו את התאים ב-10 מיליליטר של מי מלח פוספט קרים כקרח לכל 150 סנטימטרים בזהירות רבה כדי למנוע ניתוק עצמי.

כדי להשיג את ליזאט התא, הוסף שלושה מיליליטר של מאגר ליזה לכל בקבוק של 150 סנטימטר מרובע וגרד היטב את פני השטח באמצעות מגרד תאים. הטיית הבקבוק לכ- 45 מעלות תקל על איסוף הליזטים של התאים לצינורות המתאימים להם. יוצקים מיליליטר אחד של הליזאט הסלולרי לכל שפופרת לשלושה צינורות של 1.5 מיליליטר המסומנים לפי מצב.

לצורך המשיכה, צנטריפוגה את צינורות ה-1.5 מיליליטר ב-11,000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים המסומנים A.העבירו מנה של הסופרנטנט לכל מצב לצינורות שונים המסומנים B.לאחר מכן, הוסיפו 16.6 מיקרוליטר של מאגר 4x Laemmli עבור 50 מיקרוליטר ליזאט והקפיאו במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הומוגניזציה של אגרוז NeutrAvidin היטב על ידי ניעור עדין.

חותכים את קצות קצות הפיפטה כדי להגדיל את קוטרם ולשפר את פיפטינג החרוזים. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של NeutrAvidin agarose לכל מיליליטר של ליזאט תאים בצינורות A. דגרו על ליזאטים של התא בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה עם ניעור עדין מאוד כדי לאפשר ל-NeutrAvidin לקיים אינטראקציה עם BCPPs הקשורים לשותפיהם התוך-תאיים.

לאחר מכן, צנטריפוגה ב-3,000 פעמים גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את קומפלקס ה-NeutrAvidin עם חלבונים. הסר בזהירות את הסופרנטנטים והעביר אותם לצינורות נקיים המסומנים C. שמור אותם לשימוש למקרה שהמשיכה לא תצליח. כדי לשטוף את הקומפלקס של NeutrAvidin בחלבונים, הוסף מאגר ליזה טרי לכדורי צינורות A.

השעו מחדש את הגלולה על ידי היפוך וחזרו על הצנטריפוגה. חזור על הכביסה הזו חמש פעמים נוספות. ניתן להשליך את כל הסופרנטנטים הללו.

לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר של 2x Laemmli buffer לכל צינור של 1.5 מיליליטר עבור כדורים המתקבלים מ-150 סנטימטר רבוע של צלוחיות של תאים מתלכדים. לאחר מכן, יש לשטוף ב-100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לנתק את האינטראקציות בין החלבונים. לאחר הפליטה, צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-8, 200 פעמים גרם כדי לגלול חרוזי NeutrAvidin.

העבירו את הסופרנטנטים המכילים את החלבונים המנותקים עם קצות נימיים לצינורות חדשים המסומנים D. סופרנטנטים אלה מוכנים כעת להעמסה בכתם מערבי כמתואר בפרוטוקול הטקסט או שניתן להקפיא אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. מוצגות כאן תמונות אימונוציטוכימיה המראות כי היתוך של ביוטין ל-TAT-connexin 43 266-283 אינו משנה את ההשפעות של הפפטיד החודר לתאים על מורפולוגיה של תאי גזע של גליומה. ניתוח ה-MTT של GSC שטופל ב-BCPP או CPP מראה כי היתוך של ביוטין ל-TAT-connexin 43 266-283 אינו משנה את ההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית של TAT-connexin 43 266-283 על GSC.

תוצאות מייצגות של משיכת BCPP ואחריה כתם מערבי מוצגות כאן. כתם מערבי מראה כי חלבונים המתוארים כמקיימים אינטראקציה עם TAT, למשל, Cav-1, מופיעים בשני המצבים. חלבונים המתוארים כאינטראקציה עם Cx43, למשל, c-Src ו-PTEN, מופיעים מיד לאחר משיכה של TAT-connexin 43 266-283, בעוד שחלבונים שאינם מקיימים אינטראקציה ישירה עם Cx43 או TAT אינם קיימים, למשל, FAK.

תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית מאשרות את האינטראקציות התוך-תאיות שנמצאו עם ה-BCPPs. התמונות מציגות את הקולוקליזציה התוך-תאית של TAT-connexin 43 266-283 עם c-Src קרוב לקרום הפלזמה ב-G166 GSCs. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לאשר את הטמפרטורה של הריאגנטים והצנטריפוגה וכן את מפגש התאים לפני הוספת הפפטידים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון תוך תאיות באמצעות פפטידים חודרי תאים ביוטיניליים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום האיתות התאי לחקור מנגנונים מולקולריים תוך-תאיים ואת המסלולים הספציפיים לקו שלהם בתאי תרבית, תרביות אורגנוטיפיות ואפילו מודלים in vivo.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש במטענים ביו-אקטיביים אחרים כגון רצפי RNA, ננו-חלקיקים, וירוסים או מולקולות אחרות שיכולים לעבור עם פפטידים חודרים לתאים ולהתמזג ל-TATs נשלפים כדי לחקור את מנגנון הפעולה התוך תאי שלהם. למרות שלא כלולים חומרים מסוכנים במיוחד בפרוטוקול זה, אל תשכח ללבוש כפפות וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.