Name: אינדוקציה והדמיה מיקרו-CT של המוח מומים חלול במודל עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: למדו אינדוקציה והדמיה מיקרו-CT של מומים חלול במוח בעכברים ניאונטליים. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של נטל המחלה ומסייעת בחקר מנגנונים ואפשרויות טיפול במחלות מוח כלי דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים להכיר את המתקנים ואת מדעיים וטכניים בסיוע מיקרוסקופ את סידני &amp; במתקן מחקר Microanalysis (AMMRF) ומרכז אוסטרלי עבור Microanalysis (ACMM) ב אוניברסיטת סידני מיקרוסקופיה. מחקרים אלה נתמכו על ידי הבריאות הלאומית האוסטרלית ולהעניק פרוייקט המועצה למחקר רפואי (NHMRC) 161558 ו- APP1124011 (XZ).

כל אתיקה בעלי חיים והפרוטוקולים אושרו על-ידי סידני המקומי בריאות בעלי חיים רווחה בוועדה המחוזית, טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה (IACUC) מאוניברסיטת טיאנג'ין לרפואה. כל הניסויים נערכו תחת ההנחיות/התקנות של המכון מאה שנה, אוניברסיטת סידני, טיינג'ין הרפואי האוניברסיטאי 1. אינדוקציה של מומים חלול מוחית במודלים של העכבר <ol><li>קרוס Cdh5-CreErt2; Ccm2 חליל/חליל עכברים עם Ccm2 חליל/פל ליצירת המלטות עם Cdh5-CreErt2; Ccm2 חליל/חליל (Ccm2 iECKO) הגורים ופקדים littermate (Ccm2 חליל/חליל). Cdh5-CreErt2 ובעלי Ccm2 חליל/חליל היה שתואר לעיל 19.</li>
	<li>לפזר 4HT 100% אתנול ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס ב aliquots של 30 µL (ריכוז 4HT: 10 מ"ג/מ"ל). יום של שימוש לדלל 4HT aliquoted בשמן תירס (0.5 mg/mL).</li>
	<li>Intragastrically להזריק 50 µL של 4HT (0.5 mg/mL) כדי הגורים neonatal ב P1 לזירוז ניסיוני נגעים CCM באמצעות על מזרק אינסולין.</li>
</ol> 2. לטעום הכנה מיקרו-CT סורק <ol><li>המתת חסד הגורים neonatal-P8 באמצעות פחמן דו-חמצני חנק.</li>
	<li>לבצע זלוף אינטרה-לב על-ידי הוספת מחט 29-מד עם 3 מ"ל של 2% paraformaldehyde ב- PBS מזרק 10 מ"ל לתוך החדר שבלב העכבר. 
	התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת.</li>
	<li>לנתק את הראש מן הגוף באמצעות מספריים. הסר להוריד הראש באמצעות מספריים את כל העור, קילוף הגולגולת באמצעות מלקחיים לנתח את כל המוח.</li>
	<li>לקחת תמונות של המוח עם stereomicroscope-7.82 x הגדלה, 1 x רווח, גמא 0.6, זמן החשיפה 20 ms-</li>
	<li>את המוח ביתור עם 4% paraformaldehyde בתמיסה PBS בן לילה. 
	התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת.</li>
	<li>למחרת, ניתוק hindbrains באמצעות מלקחיים ולשטוף עם פתרון PBS.</li>
	<li>דגירה של hindbrains ב Lugol &#39; s יוד לפתרון ה 48</li>
	<li>בעקבות הדגירה, בקצרה אוויר יבש את hindbrains להסיר את עודף Lugol &#39; s יודיפלור תמיסה.</li>
	<li>לארוז את Lugol &#39; s יוד צבעונית hindbrains ב 0.65 mL microcentrifuge צינורות, חותם לחלוטין עם פרפין פלסטיק הסרט כדי למנוע התכווצות רקמות ( איור 2 א).</li>
	<li>למקם את צינורות microcentrifuge מ ל צינורות פלסטיק עם ספוגים כדי למנוע מהם לזוז במהלך הסריקה ( איור 2 B).</li>
</ol> 3. מיקרו-CT לסרוק של CCM במוח העכבר <ol><li>אנכית לטעון את hindbrain ארוזה בשפופרת בקופסת אלומיניום מערכת מיקרו-CT.</li>
	<li>להגדיר את הפרמטרים סריקה תחזיות 540, זמן החשיפה s 2 מקור תנאי 50 kV ו-10 W כדי לרכוש datasets טומוגרפי (תמונה ברזולוציה 9.5 μm לפיקסל).</li>
	<li>צילומי מהסריקה משוחזרים באופן אוטומטי על ידי הקרנה מבוססת חומרה שחזור התוכנה שסופקה על-ידי מערכת מיקרו-CT, בהפקת סדרות תמונה של 16 סיביות פרוסות צירית (&#34; TXM &#34; קובץ).</li>
</ol> 4. ניתוח של מיקרו-CT Datasets <ol><li>לפתוח את קובץ התמונה המשוחזרת (&#34; TXM &#34; קובץ) בתוכנת ניתוח תלת-ממדי, ולהמחיש את המוח באמצעות &#34; אחסון עיבוד &#34; הפונקציה.</li>
	<li>להפוך את hindbrain הכיוון הרצוי באמצעות &#34; התיבה התוחמת &#34; ו- &#34; המטוס מסיכה &#34; פונקציות.</li>
	<li>לדגום מחדש את התמונה טרנספורמציה במצב מורחב ולשמר את voxel בגודל.</li>
	<li>צור &#34; לערוך שדה תווית חדש &#34; על התמונה טרנספורמציה (4.3) להדגיש רק את hindbrain באמצעות סולם גוני אפור בעוצמה.</li>
	<li>להוסיף את האזורים המסומנים ולהפעיל &#34; תווית ניתוח &#34; כדי לקבל מדידות של hindbrain שלם (כלומר, הנפח הכולל ואזור). ייצוא מדידות בקובץ Excel.</li>
	<li>להמחיש את hindbrain באמצעות &#34; isosurface עיבוד &#34; הפונקציה.</li>
	<li>ליצור עוד &#34; לערוך שדה תווית חדש &#34; על האזורים בתמונה והאר טרנספורמציה עם נגעים באמצעות סולם גוני אפור בעוצמה.</li>
	<li>להוסיף את האזורים המסומנים ולהפעיל &#34; תווית &#34; ניתוח כדי לקבל מדידות של נגעים בתוך hindbrain (קרי, הנפח הכולל ואזור). ייצוא מדידות בקובץ Excel.</li>
	<li>להמחיש נגעים באמצעות &#34; ליצור משטח &#34; ו &#34; משטח התצוגה &#34; פונקציות.</li>
	<li>תמונה התמונות של hindbrain על כיווני הנסיעה או ליצור סרט על ויזואליזציה תלת-ממדי של נגעים.</li>
</ol>

<ol><li>Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations%3A+from+CCM+genes+to+endothelial+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis.</a> Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).</li>
<li>Liquori, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+gene+encoding+a+novel+protein+containing+a+phosphotyrosine-binding+domain+cause+type+2+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).</li>
<li>Laberge-le Couteulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+mutations+in+CCM1%2C+encoding+KRIT1%2C+cause+hereditary+cavernous+angiomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas.</a> Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).</li>
<li>Sahoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+gene+encoding+KRIT1%2C+a+Krev-1%2Frap1a+binding+protein%2C+cause+cerebral+cavernous+malformations+%28CCM1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1).</a> Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).</li>
<li>Denier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+MGC4607+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).</li>
<li>Bergametti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+programmed+cell+death+10+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).</li>
<li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+cerebral+cavernous+malformations+based+on+the+two-hit+mutation+hypothesis+recapitulates+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease.</a> Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).</li>
<li>Boulday, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+timing+of+CCM2+loss+influences+cerebral+cavernous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).</li>
<li>Chan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+2+distinct+genetic+pathways+result+in+cerebral+cavernous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations+arise+independent+of+the+heart+of+glass+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor.</a> Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).</li>
<li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasudil+decreases+lesion+burden+in+a+murine+model+of+cerebral+cavernous+malformation+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease.</a> Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).</li>
<li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li>
<li>Gibson, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+identifying+repurposed+drugs+for+the+treatment+of+cerebral+cavernous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation.</a> Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).</li>
<li>Choi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+Imaging+Reveals+Mekk3+Heterozygosity+Prevents+Cerebral+Cavernous+Malformations+in+Ccm2-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice.</a> PLoS One. 11 (8), 0160833(2016).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations+arise+from+endothelial+gain+of+MEKK3-KLF2%2F4+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+comparative+morphology%3A+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiol. 9, 11(2009).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), 61(2006).</li>
<li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Procedure+for+Rapid+Imaging+of+Adult+Mouse+Brains+with+MicroCT+Using+Iodine-Based+Contrast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast.</a> PLoS One. 10 (11), 0142974(2015).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+cerebral+cavernous+malformation+pathway+controls+vascular+stability+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth.</a> Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

CCM הוא שבץ נפוצה המשפיעה עד 0.5% של יחידים1. CCM יכול להתרחש הטופס ספורדי או משפחתית. פרוגנוזה החולה לעתים קרובות לא ברור כמו נגעים CCM יכול הקרע באופן בלתי צפוי לגרום שבץ מוחי ו השלכות נוירולוגיות אחרות. כיום, הוא אפשרות הטיפול היחידה להסרת נגעים, אשר מלווים בסיכון גבוה.
תנאים אנושיים CCM שפירטתי לאחרונה ב חיה מודלים7,8,9,10. מודלים אלה מספק...

CCM הם קירות דקים, התרחבו מומים בכלי הדם במוח עם שכיחות של עד 0.5% האוכלוסייה האנושית1. יכול להיות תורשתית CCM כהפרעה דומיננטית בשל אובדן-של-פונקציה מוטציות בגן אחד הגנים 3: CCM1 (aka Krit1), CCM2ו- CCM3 (הנקראת גם PDCD10)2,3,4 5, ,6. גנים אלו נמצאים יחיד איתות מורכבים.
מודלים שונים פותחו למחלה CCM האדם מודל, כדי להבין את המסלולים במורד הזרם של גנים CCM אשר אחראים CCM7,8,9,10. המודל החזקה ביותר היא מותנית למחוק באחד הגנים Ccm עם טמוקסיפן-inducible Cdh5-CreERT2 -P1 הגורים היילוד8,10. הגורים צפויים להיות מודל אידיאלי עבור מחקרים קליניים בחיפוש של מנגנונים, סוכני טיפולית בטיפול במחלות CCM ולפתח CCM נגעים במוח מ- P6 ואילך.
CCM נטל הנגע במוח העכבר יש כבר נמדד בעיקר על ידי שיטות מבוססות-היסטולוגיה, גישה זו זמן רב מאוד, על החוקר הטיה10,11,12. MRI המבוסס על שיטות השתמשו כדי להעריך CCM הנגע נטל העכבר למבוגרים דגם9,13. עם זאת, מאוד מיוחדים מכשיר MRI קטן בעל חיים עם סריקה-זמן של מספר שעות ללון נדרש כדי להגיע לפתרון משביע רצון לזיהוי CCM נגעים. בנוסף, MRI יכול לשמש כדי לזהות נגעים CCM בעכברים neonatal לא דווחה, רזולוציה עשוי להגביל את הרגישות.
לאחרונה פיתחנו שיטה מיקרו-CT תמונה ולנתח CCM הנגע14,15. זה ברזולוציה גבוהה, שיטה חסכונית וזמן באופן דרמטי שיפרה את הערך של מודל המחלה CCM במחקרים מכניסטית וטיפוליים. שיטות לשיפור חדות, כל הר מכתימים שימשו עבור מיקרו-CT הדמיה של רקמות רכות, העכבר עוברי16,17. בעבר, השתמשנו מבוסס-אוסמיום מכתים כדי לשפר את הניגודיות עבור מיקרו-CT הדמיה של CCM נגעים במוח14. בנייר זה, השתמשנו רעיל פחות, גמישה, ומבוססות ריאגנט חסכוניים, יוד הפתרון של Lugol, כדי לשפר את הניגודיות עבור מיקרו-CT הדמיה. יוד יכול לפזר ברחבי המוח, יש זיקה גבוהה בדם18.
פרוטוקול מפורט מוצג כאן את תנאי הגיוס של נגעים CCM במודל של עכברים neonatal יחד עם ההדמיה וניתוח של נגעים CCM עם מבוסס ניגודיות מיקרו-טי בשיטה זו מבוסס מיקרו-CT מספק מדידה הכללית כמותית של נפח הנגע CCM מזהה במדויק את מספר ומיקום תלת-ממדי של CCM נגעים במוח העכבר, מקטינה באופן משמעותי את העלות, הזמן הנדרש כדי פנוטיפ בעלי חיים אלה.

<table><tbody><tr><td>4-הידרוקסי טמוקסיפן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H6278</td> להפעלת שמן תירס <td>Cdh5-CreErt2</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8267-500ML</td><td>לדילול 4-הידרוקסי טמוקסיפן</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>M205FA</td><td>לצילום תמונות מקרוסקופיות</td></tr><tr><td>תמיסת היוד של לוגול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6146</td><td>לצביעה של דגימות לניגודיות מיקרו-CT</td></tr><tr><td>סרט פרפין מפלסטיק</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>לאריזת דוגמאות</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Xradia</td><td>MicroXCT-400</td><td>Micro-CT</td></tr><tr><td>תוכנת עיבוד תלת מימד</td><td>FEI Visualization Science Group</td><td>Avizo תוכנת עיבוד תמונה תלת מימד</td><td>לניתוח סריקות מיקרו-CT</td></tr></tbody></table>

אינדוקציה והדמיה מיקרו-ct של המוח מומים חלול במודל עכבר

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

מוטציות CCM1 (aka KRIT1), CCM2, או CCM3 (aka PDCD10) ג'ין לגרום מום מוחי חלול (CCM) אצל בני אדם. העכבר מודלים של המחלה CCM הוקמו על-ידי מחיקת טמוקסיפן המושרה Ccm גנים בבעלי חיים לאחר הלידה. מודלים אלה העכבר מספקים כלים שלא יסולא בפז לחקור את המנגנון המולקולרי, גישות טיפוליות למחלות CCM. שיטה כמותית ומדויקים כדי להעריך את הנגע נטל והתקדמות חיונית כדי לרתום את הערך המלא של מודלים בעלי חיים אלה. . הנה, נדגים את תנאי הגיוס של מחלת CCM במודל של עכברים, השימוש של הניגוד משופרת רנטגן טומוגרפיה מיקרו (מיקרו-CT) שיטת מדידה CCM הנגע נטל במוח העכבר. ביום כמחנכת 1 (P1), השתמשנו 4-hydroxytamoxifen (4HT) כדי להפעיל Cre פעילות recombinase מ transgene Cdh5-CreErt2 כדי לדבוק אלל floxed של Ccm2. CCM נגעים במוח העכבר נותחו-P8. עבור מיקרו-CT, הפתרון של יוד מבוססי Lugol נעשה שימוש כדי לשפר את הניגודיות ברקמת המוח. יש אופטימיזציה הפרמטרים סריקה ואנו מנוצל מימד voxel של 9.5 מיקרומטר, אשר להוביל בגודל תכונה מינימלי של 25 מיקרומטר. החלטה זו מספיקה למדוד את נפח הנגע CCM ומספר ברחבי העולם ובאופן מדויק, ולספק מיפוי תלת-ממד באיכות גבוהה של CCM נגעים במוח העכבר. שיטה זו מגבירה את הערך של הדגמים העכבר הוקמה כדי ללמוד את הבסיס המולקולרי של טיפולים פוטנציאליים עבור CCM ומחלות אחרות כשאבדן.

זריקה אחת של 4HT-P1 היה מספיק כדי לגרום CCM נגעים המוח הקטן. Lugol של יוד בניגוד המיקרו-CT מספיק זוהה CCM נגעים, יכול לכמת שלה אמצעי האחסון ואת המספר. ניצול של אופטימיזציה של המיקרו-CT, אנחנו עם תמונה CCM נגעים ב hindbrains של Ccm2iECKO עכברים. צילומים סרוקים שוחזרו לייצר תמונות תלת-ממדיות של המוח העכבר, אשר אפשרה ויזואליזציה של נגעים כולו ב- parenchyma המוח-בעומקים שונים וכיוונים, ואת ההערכה של מבנה ומיקום תלת-ממדי של נגעים במוח. חשוב, זו תמונת נתונים (dataset) יכול ...

פרוטוקול זה מדגים את תנאי הגיוס של מחלה מוחית מום חלול במודל של עכברים, שימושים חדות משופרת מיקרו טומוגרפיה כדי למדוד את הנגע הנטל. שיטה זו מגבירה את הערך של העכבר ויצר מודלים ללמוד את הבסיס המולקולרי של טיפולים פוטנציאליים חלול מום מוחי ומחלות אחרות כשאבדן.

אינדוקציה והדמיה מיקרו-CT של המוח מומים חלול במודל עכבר

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום למומים מוחיים בעכברים יילודים, ולמדוד את נטל המחלה באמצעות מיקרו-CT. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות כלי דם במוח, כגון מומים במערות מוחיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לקבוע את נטל מחלת המום המוחי במודלים של עכברים יילודים בצורה מדויקת ויעילה בהשוואה לשיטות הקיימות.הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד אינדוקציה של מום מוחי במערה ושלבי ניתוח מיקרו-CT, מכיוון שהיא דורשת ניסיון ושימוש בתוכנה מתוחכמת. התחל בהמסת 4-HT ב-100% אתנול לריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר. הכינו 30 מיקרוליטר אלאקוואס, ואז אחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס.ביום השימוש, יש לדלל את ה-alaquad ב-4-HT בשמן תירס ל-0.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן השתמש במזרק אינסולין כדי להזריק 50 מיקרוליטר של 4-HT לגורים יילודים P1 כדי לגרום לנגעי CCM ניסיוניים. התחל בהכנת הדגימה על ידי מילוי מזרק של 10 מיליליטר המצויד במחט בגודל 29 עם שלושה מיליליטר של 2% פרפורמלדהיד ו-PBS.לאחר מכן בצע שפע תוך לבבי על גור P8 שעבר המתת חסד על ידי החדרת המחט לחדר לב העכבר, והזרקה איטית של מלוא הנפח של פרפורמלדהיד. לאחר שימוש במספריים לניתוק הראש, הסר את העור מהראש וקילף את הגולגולת באמצעות מלקחיים כדי לנתח את כל המוח ל-4% פרפורמלדהיד ו-PBS. לאחר תיקון המוח למשך הלילה ב-4-HT מעלות צלזיוס.למחרת, נתק את המוח האחורי באמצעות מלקחיים, ושטוף בתמיסת PBS. לאחר מכן דגרו על המוח האחורי בתמיסת היוד של לוגול, למשך 48 שעות. לאחר הדגירה, יש לייבש לזמן קצר את המוח האחורי באוויר כדי להסיר עודפי תמיסת היוד של לוגול.לאחר מכן ארזו את המוח האחורי המוכתם ביוד של לוגול בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 0.65 מיקרוליטר, ואטמו לחלוטין עם סרט פרפין מפלסטיק כדי למנוע התכווצות רקמות. הנח את צינורות המיקרו-צנטריפוגה בצינורות פלסטיק של חמישה מיליליטר עם ספוגים כדי למנוע מהם לזוז במהלך הסריקה. הרכיבו אנכית את הצינור המכיל מוח אחורי על מחזיק אלומיניום במערכת המיקרו-CT.הגדר את פרמטרי הסריקה. השתמש בהקרנות של 540 וזמן חשיפה של שתי שניות עם תנאי מקור של 50 קילו-וולט ו-10 וואט כדי לרכוש את מערכי הנתונים הטומוגרפיים. גרפי רדיו מהסריקה משוחזרים אוטומטית על ידי תוכנת שחזור הקרנה מבוססת חומרה, המסופקת על ידי מערכת המיקרו-CT, ומייצרת סדרת תמונות של פרוסות ציריות של 16 סיביות.המיקרו-CT המנוגד ליוד של לוגול זיהה מספיק נגעי CCM. תמונות רנטגן סרוקות שוחזרו כדי לייצר תמונות תלת מימד של מוח העכבר, שאפשרו הדמיה של נגעים שלמים בפרנכימה של המוח, בעומקים ובכיוונים שונים, והערכת המבנה במיקום תלת מימדי של נגעים במוח. טבלה זו מציגה דוגמה לתפוקה כמותית של הנגעים הבודדים המסומנים.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות כלי הדם לחקור מנגנונים ואפשרויות טיפוליות למומים מוחיים במערות במודלים של עכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לנגע CCM במודלים של עכברים, וכיצד לרכוש ולנתח את עומס נגעי CCM בטכניקת מיקרו-CT.

induction-micro-ct-imaging-cerebral-cavernous-malformations-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

ניגודיות משופרת כלי שיט קטן בעל חיים הדמיה על ידי microCT היא מהירה, חסכונית תפוקה גבוהה טכניקה...

כלי משופר ניגודיות הדמיה באמצעות MicroCT

במאמר זה, אנו מציגים טכניקה פשוטה, מעשית ליציקת כלי דם במוח כי הוא קל לביצוע, יכול להיות מנוצל על התמונה עץ כלי דם של המוח עכבר מבוגר.

יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי

מקור: Xavier, A. L. R., et al. השתלת צינורית בבור המים של מכרסמים. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את הליך השתלת צינורית בבור המים של עכבר מורדם. הטכניקה כוללת הנחיית צינורית המותקנת על מחט דרך הדורה לתוך הבור המשולש ההפוך ואבטחתה לאספקה ממוקדת לנוזל השדרה.

השתלת צינורית לתוך Cisterna Magna במודל עכבר

בסרטון זה, גור עכבר מהונדס גנטית הנושא את הגן Ccm2 ומשני צדדיו אתרי loxP ו-Cre recombinase המאוחה לקולטן אסטרוגן משמש לגרימת מומים מוחיים במערות (CCM). מתן 4-hydroxytamoxifen מפעיל Cre בתאי אנדותל, מה שמוביל למחיקת Ccm2 והיווצרות CCMs במוח.

Cre-LoxP תיווך אינדוקציה של מומים מוחיים במערות במודל עכבר

מקור: Choi, J. P.  ואחרים. אינדוקציה והדמיית מיקרו-CT של מומים במערות המוח במודל עכבר. J. Vis. exp. ( 2017)} סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיית מיקרו-CT כדי להמחיש נגעים של מום מערות מוחי (CCM) במוח של עכבר. הוא מפרט את השלבים להכנת דגימה, הדמיה ושחזור תמונה תלת מימדית כדי להעריך את הצפיפות והמיקום של נגעי CCM ברקמת המוח.

הדמיית מיקרו-CT משופרת ניגודיות של נגעי מום במערות המוח במוח עכבר

מקור: Kim, D., et. al. הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום וטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת להדמיה ישירה של טרומבואמבולי מוחי. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיה של פקקת מוחית בעכברים באמצעות הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (מיקרו-CT). מודל של עכבר פקקת מוח מוזרק עם ננו-חלקיקי זהב ממוקדי פיברין הפועלים כחומר מנוגד. העכבר מונח על מצע של מכונת מיקרו-CT, והתמונות מתקבלות מזוויות מרובות. באמצעות תוכנה מתאימה, התמונות משוחזרות ומעובדות.

הדמיה של פקקת מוחית בעכבר באמצעות הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת

פרוטוקול זה מתאר את היישום של ניאון בשילוב האינפרה-אדום הקרוב (NIRF) הדמיה וטומוגרפיה-מחושב מיקרו (microCT) המאפשר הדמיה thromboemboli מוחין. טכניקה זו מאפשרת כימות של נטל פקיק ואבולוציה. טכניקת דימות NIRF מדמיינת שכותרתו fluorescently פקיק במוח הניכר, ואילו טכניקת microCT מדמיינת פקיק בתוך חיות בעלות באמצעות-חלקיקי זהב.

משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

מטרת מאמר זה היא להציג שיטה המאפשרת שחזור תלת-ממדי של העץ כשאבדן בעכברים לאחר מיקרו שחושב טומוגרפיה והנחישות של אמצעי אחסון של מקטעי כל כלי יכול לשמש כדי לכמת vasospasm מוחין ב מודלים מאתר של דימום תת-עכבישי.

שיטה הנפחי עבור כימות Vasospasm המוחית במודל מאתר של דימום תת-עכבישי

מאמר זה מתאר שיטה פשוטה כדי להתכונן מוח בעל חיים קטן מיקרו-CT הדמיה, פצעים אשר ניתן לכמת, אלקטרודות הממוקם עם דיוק גבוהה בהקשר של המוח כולו.

שיטה המבוססות על מיקרו-CT אפיון נגעים ואיתור אלקטרודות במוח בעלי חיים קטנים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל חסימת עורק מוחי אמצעי דיסטלי (dMCAO) באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית בעכברי C57BL/6J ומעריכים את ההתנהגות הנוירולוגית והתכונות ההיסטופתולוגיות שלאחר מכן.

השראת שבץ איסכמי חריף בעכברים באמצעות טכניקת חסימת העורק האמצעי הדיסטלי

הפרוטוקול מתאר שיטה להזרקת תאי גידול דרך מסלול הניקוב המלעורי לתוך ציסטרנה מגנה הגורמת בעוצמה לגרורות לפטומנינגיאליות בעכברים, ומפחיתה את הטראומה ואת עומס הגידול החוץ-גולגולתי.

מודל הזרקת Cisterna Magna זעיר פולשני למחקרי גרורות לפטומנינגיאליות בעכברים

למדו אינדוקציה והדמיה מיקרו-CT של מומים חלול במוח בעכברים ניאונטליים. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של נטל המחלה ומסייעת בחקר מנגנונים ואפשרויות טיפול במחלות מוח כלי דם.

אינדוקציה והדמיה מיקרו-CT של המוח מומים חלול במודל עכבר

גלה סרטונים נוספים