אינדוקציה והדמיה מיקרו-CT של המוח מומים חלול במודל עכבר
4 בספטמבר 2017
פרוטוקול זה מדגים את תנאי הגיוס של מחלה מוחית מום חלול במודל של עכברים, שימושים חדות משופרת מיקרו טומוגרפיה כדי למדוד את הנגע הנטל. שיטה זו מגבירה את הערך של העכבר ויצר מודלים ללמוד את הבסיס המולקולרי של טיפולים פוטנציאליים חלול מום מוחי ומחלות אחרות כשאבדן.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום למומים מוחיים בעכברים יילודים, ולמדוד את נטל המחלה באמצעות מיקרו-CT. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות כלי דם במוח, כגון מומים במערות מוחיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לקבוע את נטל מחלת המום המוחי במודלים של עכברים יילודים בצורה מדויקת ויעילה בהשוואה לשיטות הקיימות.
הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד אינדוקציה של מום מוחי במערה ושלבי ניתוח מיקרו-CT, מכיוון שהיא דורשת ניסיון ושימוש בתוכנה מתוחכמת. התחל בהמסת 4-HT ב-100% אתנול לריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר. הכינו 30 מיקרוליטר אלאקוואס, ואז אחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס.
ביום השימוש, יש לדלל את ה-alaquad ב-4-HT בשמן תירס ל-0.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן השתמש במזרק אינסולין כדי להזריק 50 מיקרוליטר של 4-HT לגורים יילודים P1 כדי לגרום לנגעי CCM ניסיוניים. התחל בהכנת הדגימה על ידי מילוי מזרק של 10 מיליליטר המצויד במחט בגודל 29 עם שלושה מיליליטר של 2% פרפורמלדהיד ו-PBS.
לאחר מכן בצע שפע תוך לבבי על גור P8 שעבר המתת חסד על ידי החדרת המחט לחדר לב העכבר, והזרקה איטית של מלוא הנפח של פרפורמלדהיד. לאחר שימוש במספריים לניתוק הראש, הסר את העור מהראש וקילף את הגולגולת באמצעות מלקחיים כדי לנתח את כל המוח ל-4% פרפורמלדהיד ו-PBS. לאחר תיקון המוח למשך הלילה ב-4-HT מעלות צלזיוס.
למחרת, נתק את המוח האחורי באמצעות מלקחיים, ושטוף בתמיסת PBS. לאחר מכן דגרו על המוח האחורי בתמיסת היוד של לוגול, למשך 48 שעות. לאחר הדגירה, יש לייבש לזמן קצר את המוח האחורי באוויר כדי להסיר עודפי תמיסת היוד של לוגול.
לאחר מכן ארזו את המוח האחורי המוכתם ביוד של לוגול בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 0.65 מיקרוליטר, ואטמו לחלוטין עם סרט פרפין מפלסטיק כדי למנוע התכווצות רקמות. הנח את צינורות המיקרו-צנטריפוגה בצינורות פלסטיק של חמישה מיליליטר עם ספוגים כדי למנוע מהם לזוז במהלך הסריקה. הרכיבו אנכית את הצינור המכיל מוח אחורי על מחזיק אלומיניום במערכת המיקרו-CT.
הגדר את פרמטרי הסריקה. השתמש בהקרנות של 540 וזמן חשיפה של שתי שניות עם תנאי מקור של 50 קילו-וולט ו-10 וואט כדי לרכוש את מערכי הנתונים הטומוגרפיים. גרפי רדיו מהסריקה משוחזרים אוטומטית על ידי תוכנת שחזור הקרנה מבוססת חומרה, המסופקת על ידי מערכת המיקרו-CT, ומייצרת סדרת תמונות של פרוסות ציריות של 16 סיביות.
המיקרו-CT המנוגד ליוד של לוגול זיהה מספיק נגעי CCM. תמונות רנטגן סרוקות שוחזרו כדי לייצר תמונות תלת מימד של מוח העכבר, שאפשרו הדמיה של נגעים שלמים בפרנכימה של המוח, בעומקים ובכיוונים שונים, והערכת המבנה במיקום תלת מימדי של נגעים במוח. טבלה זו מציגה דוגמה לתפוקה כמותית של הנגעים הבודדים המסומנים.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות כלי הדם לחקור מנגנונים ואפשרויות טיפוליות למומים מוחיים במערות במודלים של עכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לנגע CCM במודלים של עכברים, וכיצד לרכוש ולנתח את עומס נגעי CCM בטכניקת מיקרו-CT.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את השראת מחלת המלקומה הנימיות המוחיות (cerebral cavernous malformation) בעכברים רכובים ומשתמש במיקרו-CT למדידת עומס הנגעים. שיטה זו משפרת את ההבנה של הבסיס המולקולרי והטיפולים הפוטנציאליים למלקומה נימיות מוחיות ולמחלות כלי דם מוחיות אחרות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של כלי דם
- מודלים של עכברים
רקע
- מבנים קהריים מוחיים (CCMs) הם נגעי כלי דם שעלולים להוביל לבעיות נוירולוגיות משמעותיות.
- שיטות קיימות למדידת עומס המחלה במודלים של עכברים הן לעיתים קרובות לא יעילות.
- מיקרו-CT מציע דרך לא פולשנית להדמיה וכמותית של הנגעים.
- הבנת CCMs יכולה לספק תובנות לגבי מחלות צרברובסקולריות אחרות.
מטרת המחקר
- להשראת תצורות קהריות מוחיות (cerebral cavernous malformations) בעכברים בניו-בורן.
- למדידה מדויקת של עומס המחלה באמצעות micro-CT.
- לשיפור מתודולוגיות לחקר מחלות של כלי הדם המוחיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המסה של 4-HT באתנול ליצירת תמיסה להשראת CCMs.
- הכנת מנות (aliquots) לאחסון בטמפרטורה של -80 °C.
- שימוש ב-micro-CT עם שיפור ניגודיות לצורך הדמיה.
- הדגמה חזותית של תהליך ההשראה והניתוח.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת קביעה מדויקת ויעילה של עומס המחלה של CCM.
- Micro-CT מספק ויזואליזציה ברורה של הגעוls במודלים של עכברים.
- השראת CCMs הושגה בהצלחה בעכברים בניוnatal.
- גישה זו יכולה להקל על מחקרים נוספים של טיפולים פוטנציאליים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מגביר את הערך של מודלים של עכברים למחקר של CCMs.
- Micro-CT הוא כלי רב עוצמה להערכת נטל של מחלות צרברובסקולריות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על מתודולוגיה זו כדי לבחון אפשרויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות micro-CT כמותי של מלקואות קהריות מוחיות (CCMs) במודלים של עכברים מהונדסים גנטית מאפשר הערכה מדויקת של עומס הגעשה, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטית ובתיקוף של מטרות במחקר של מחלות צביסולריות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בבדיקת היפותזות טיפוליות בשלבים מוקדמים ומסייעת בתעדוף תיקי פיתוח על ידי אספקת כימות געשות חסון וניתן לשחזור. שילוב של דימות ברזולוציה גבוהה עם מודלים גנטיים של מחלות מציב את זרימת העבודה הזו כנקודת השבחה קריטית להמשכיות תרגומית בצינורות פיתוח של ביולוגיה וסקולרית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה קפדנית של תפקוד גנים ב-CCM ומעורבות מסלולים במודלים של מחלות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות של היווצרות נגעים בעקבות מחיקה ממוקדת של גנים.
- מספק תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדידה ישירה של פנוטיפים הרלוונטיים למחלה.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירה או בתעדוף נמוך של מטרות מולקולריות למחקרים המשכיים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מקיים מודלים מאושרים של עכברים ופרוטוקולי דימות עבור סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- מספק מדדי נגעים כמותיים וסטנדרטיים המתאימים לפיתוח בדיקות ולהערכת שחזוריות.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה ובספיקות גבוהה של התערבויות טיפוליות בסביבות פרה-קליניות.
- תומך בהשוואה מהימנה של תנאי ניסוי באמצעות תוצרי דימות עקביים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים לגנטיקה של מחלות בבני אדם לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מבטיחה רציפות מהגילוי הגנטי ועד לתיקוף פרה-קליני של היפותזות טיפוליות.
- מפחיתה סיכון תרגומי על ידי אספקת נקודות סיום כמותיות להתקדמות המחלה וליעילות ההתערבות.
- מחזקת את ההבנה המכניסטית של פתולוגיה צרברו-ווסקולרית הרלוונטית לתרגום קליני.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי אפשור מניפולציה גנטית מונחית-השערה ופנוטיפיזציה כמותית במודלים של עכברים, ובכך היא תומכת בזיהוי מועמדים (lead identification) ובסנכרון של סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת השערת האפס והבהרה של מסלולים ביולוגיים באמצעות השראה של נגעים גנטיים וכמימות שלהם.
- סריקה: מספקת פלטי דימות כמותיים הניתנים לשחזור לצורך מוכנות הבדיקה והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת נתונים נפחיים ומספריים על נגעים לתמיכה בהשוואה סטטיסטית בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשרת מודלים גנטיים לנקודות סיום הרלוונטיות למחלה לצורך רציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מקריבה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לדימות ואנליזה עבור תוכניות מחקר מגוונות של מחלות בכלי דם מוחיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של כימות נגעים ותהליכי דימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון באמצעות אספקת נתונים פרה-קליניים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום תוכניות למחלות כלי דם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול במודלים גנטיים של עכברים ובפרוטוקולים של דימות micro-CT.
- נדרשת גישה למכשור micro-CT ברזולוציה גבוהה ולתוכנות ניתוח ייעודיות.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הדימות ופרשנות הנתונים.
- עשוי לדרוש התאמה של הפרוטוקולים לרקעים גנטיים שונים או לסוגי נגעים שונים.
- תלוי בהכנה מדויקת של הדגימות ובתנאי הדימות כדי להבטיח את איכות הנתונים.
שאלות נפוצות על ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
