מודל ראשי Trophoblast האנושי כדי לחקור את ההשפעה של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על ויסות Autophagy את השליה
27 בספטמבר 2017
המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמה אנושית היפרדות villous חלקית ואחריה בידוד של cytotrophoblasts לתרבות התא הראשי. טיפול trophoblasts עם TNFα recapitulates דלקת התוך-רחמית שמנים ומקל על גילוי מטרות מולקולריות מוסדר על ידי דלקת מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית.
המטרה הכוללת של מודל תרבית תאים טרופובלסטים זה היא למדוד את ההשפעה של דלקת הקשורה להשמנת יתר על ויסות מסלולים קריטיים בטרופובלסטים. היתרון העיקרי של מערכת בקרה זו הוא שהיא מבססת קשר בין דלקת בתיווך TNF אלפא לבין ויסות הגנים בשליה בהקשר של השמנת יתר אימהית. היתרון העיקרי של מערכת ניסויית זו הוא שהיא מבססת קשרים בין דלקת בתיווך TNF-אלפא לבין ויסות גנים בשליה בהקשר של השמנת יתר אימהית.
ידגימו את ההליך ביילי סיימון ומאט בוצ'ר, טכנאים מהמעבדה שלי. יש לדגום רקמת זבל מהשליה בהקדם האפשרי לאחר הלידה, רצוי תוך 30 דקות או פחות. כאשר הצלחת הכוריונית פונה כלפי מעלה, השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לכרות, באופן אקראי, שניים עד שלושה חלקים בעובי מלא, שניים עד שלושה סנטימטרים מהיקף השליה.
הימנע מחלקי השליה שנראים חריגים. חתוך את הלוחות הכוריוניים והבסיסיים ואת כל כלי הדם הגדולים. מניחים את רקמת הווילוס המתקבלת במדיום חם ושלם.
תוך 30 דקות מדגימת רקמות וילוס, התחל בבידוד טרופובלסטים. הניחו כל פיסת רקמה וילוסית בצינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא ב-PBS בטמפרטורת החדר וערבבו בעדינות כדי לשחרר עודפי דם ברקמה. רוקנים את ה-PBS ומחליפים ב-PBS טרי.
חזור על שטיפת ה-PBS עד להסרת רוב עודפי הדם. שטיפת ה-PBS תהיה אדומה בהירה או ורודה כאשר הטישו נשטף ביסודיות. הניחו את רקמת הווילוס בצלחת פטרי סטרילית והסירו כמה שיותר כלי דם באמצעות שקופית מיקרוסקופ כדי לגרד בעדינות את רקמת הווילוס הרכה מהכלים.
בעזרת מספריים, טוחנים דק את רקמת הווילוס המתקבלת. העבירו את רקמת הווילוס הטחונה לבקבוק סטרילי עם תמיסת עיכול על פי הנפחים המחושבים על סמך הפעילות הספציפית של טריפסין ו- DNase. דגרו את בקבוק העיכול באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-70 סל"ד למשך 35 דקות.
לאחר 35 דקות, הטו את בקבוק העיכול על צדו והניחו לחתיכות הרקמה הלא מעוכלות להתיישב בתחתית הבקבוק. שרטטו בזהירות את הסופרנטנט בעזרת פיפטה סרולוגית, הימנעו מהרקמה המיושבת. הוצא את הסופרנטנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרון באופן שווה בין צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר.
התחל את העיכול השני על ידי הוספת תמיסת עיכול לרקמה המיושבת שנותרה ודגירה של הבקבוק באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. שכבו בעדינות שלושה עד חמישה מיליליטר של סרום עגל שזה עתה נולד, או NCS, מתחת לסופרנטנט המאומץ מהעיכול הראשון על ידי הוצאה איטית מפיפטה סרולוגית בתחתית הצינור. אמור להיות נראה מניסקוס בין הסופרנטנט המתוח המכיל טרופובלסטים לבין NCS.
צנטריפוגה את הסופרנטנטים מעל NCS ב-1, 250 פעמים גרם ב-20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הכדור המתקבל יכלול תאי דם אדומים בשכבה התחתונה ביותר, ואחריהם שכבה לבנה המכילה תאי טרופובלסט. באותו אופן, מסננים את הסופרנטנט מהעיכול השני והשלישי.
שכבת NCS מתחת לסופרנטנט והצנטריפוגה המאומצים ב-1, 250 פעמים גרם ב-20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר שכל הסופרנטנטים עברו צנטריפוגה והוסרו שכבות ה-NCS והסופרנטנטים, השעו מחדש כל כדור בחמישה מיליליטר של מדיום חם ושלם ולאחר מכן איגדו את המתלים. חלקו את תרחיף התא באופן שווה בין שני צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב -1, 250 פעמים גרם ב -20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
הסר בעדינות את הסופרנטנט והשהה מחדש כל אחד מכדורי התא בשישה מיליליטר של מדיום חם ושלם. כדי להתחיל בהליך זה, חלקו את תרחיף התא באופן שווה בין ארבעה שיפועי צפיפות באמצעות פיפטת העברה כדי להניח לאט ובזהירות את מתלה התא על גבי שיפועי הצפיפות. צנטריפוגה שיפועי הצפיפות ב-1, 250 פעמים g ב-20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם תאוצה והאטה.
זה אמור לייצר רצועות מובחנות של תאים משקעים. הסר לאט ובזהירות את השכבה העליונה של מדיה שיפוע צפיפות עד שתגיע לרצועה האטומה המכילה תאי טרופובלסטים. העבירו את רצועות הטרופובלסט לשני צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר ומלאו במדיום חם ושלם.
הפוך בעדינות את הצינורות שלוש עד שש פעמים לערבוב וצנטריפוגה ב -1, 250 פעמים גרם ב -20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש כל כדור תא בחמישה מיליליטר של מדיום חם ושלם. שלב את תרחיפי התאים וספור תאים ברי קיימא באמצעות המוציטומטר וטריפן כחול.
השלב הבא לאחר ספירת התאים הוא צלחת התאים. צלחת שלושה מיליון תאים לבאר בכל צלחת שש בארות. נדנד בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה.
השאירו את התאים המצופים בפתח הזרימה הלמינרי למשך כ-30 דקות כדי לאפשר לתאים להתפזר באופן שווה, להתיישב ולהתחיל להיצמד לתחתית הבארות. לאחר 30 דקות, הניחו את הצלחות בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו -95% לחות. בדוק את הטרופובלסטים תחת מיקרוסקופ לאחר 24 שעות של תרבית כדי לאשר התקשרות ומורפולוגיה נכונה של טרופובלסטים.
ניתן לטפל בתאים לאחר 24 שעות של תרבית. שאפו את אמצעי התרבות מהתאים והחליפו בשני מיליליטר של מדיום תוסף TNF אלפא לכל באר. החזירו את הצלחות לחממה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר 24 שעות של חשיפה ל-TNF אלפא, החלף את המדיום המוסף TNF אלפא במדיום מלא. דגירה למשך 24 שעות נוספות. 24 שעות לאחר הסרת TNF אלפא, יש לשאוב את המדיה ולשטוף בעדינות את התאים עם PBS בטמפרטורת החדר.
הוסף ישירות לכל באר 80 מיקרוליטר של מאגר בדיקת משקעים רדיו-אימונוגרפיים קרים כקרח המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז טריים שנוספו. הסר את התאים מהצלחת בעזרת מגרד תאים. העבירו את התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ואגדו בארות בתוך קבוצות הטיפול.
קרח את התאים על ידי מערבולת הצינורות גבוה למשך שלושה מרווחים של 15 שניות לפחות. דגרו על התאים בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה למשך 15 דקות. מערבל את הצינורות שוב גבוה.
צנטריפוגה ב-10,000 פעמים גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול פסולת תאית. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. אחסן את דגימות החלבון התאיות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח על ידי Western Blotting עבור החלבון המבוקש.
לאחר 72 שעות של תרבית, ניתוח אימונוציטוכימי של ציטוקרטין 7, המוצג באדום, בטרופובלסטים ראשוניים מאשר שהתאים עברו סינציאליזציה המעידה על נוכחות של מסות תאים מרובות גרעינים. יתר על כן, ניתוח אימונוציטוכימי של וימנטין, גם הוא באדום, חשף מעט מאוד פיברובלסטים מזהמים. צביעה נגדית גרעינית מוצגת בכחול בשתי התמונות.
טיפול ב-TNF אלפא עד 250 פיקוגרם למיליליטר ביטוי רוביקון מווסת. בריכוזי TNF אלפא הגדולים מ-250 פיקוגרם למיליליטר, רמות ביטוי הרוביקון ירדו בחזרה לכיוון נקודת ההתחלה ואף מתחת. כמו כן, רוביקון מווסת באופן משמעותי בביופסיות רקמת וילוס קפואות מהשליה מהריונות שמנים עם עוברים נקבות בהשוואה לביקורת רזה.
לאחר שליטה, בידוד של טרופובלסטים מרקמת הווילוס יכול להיעשות תוך שש עד שבע שעות אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להכין חומרים וריאגנטים מבעוד מועד כדי שתוכל לעבוד בכוונה וביעילות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות אחרות, כגון אלה המודדות ביו-אנרגטיקה תאית, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האם דלקת בסביבה התוך רחמית השמנה משפיעה על היכולת המטבולית של טרופובלסטים?
לאחר פיתוח זה, שיטת הפיתוח סללה את הדרך לחוקר השליה לבסס את השפעת הסביבה האימהית על תפקוד הטרופובלסטים. לאחר צפייה בסרטון זה תהיה לך הבנה טובה כיצד לבודד טרופובלסטים מרקמת הווילוס לניסוי תרבית התאים שלך וכיצד לקבוע את ההשפעה של דלקת בתיווך TNF אלפא בוויסות מסלולים קריטיים בטרופובלסטים. אל תשכח שעבודה עם רקמה אנושית, תאים מתורבתים, DMSO, אקרילאמיד והפחתת ריאגנטים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת PPE מתאים ושימוש בטכניקה אספטית בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את דגימת רקמת סילי של שליה אנושית ואת הבידוד העוקב של ציטוטרופובלסטים לצורך תרבית תאים ראשונית. המודל נועד לחקור את השפעתה של דלקת הקשורה להשמנת יתר על הבקרה הגנטית של הטרופובלסט.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיילדות
רקע
- השמנת האם קשורה לדלקת בסביבה התוך-רחמית.
- TNFα הוא מתווך מרכזי של דלקת המשפיע על טרופובלסטים.
- הבנת הבקרה הגנטית בשילשייה עשויה לחשוף מטרות מולקולריות להתערבות.
- תרבית ראשונית של תאי טרופובלסט מאפשרת תנאים ניסיוניים מבוקרים.
מטרת המחקר
- למדידת ההשפעות של TNFα על הבקרה הגנטית של טרופובלסטים.
- להקמת מודל המדמה תנאים דלקתיים של השמנת יתר אימהית.
- לזיהוי מטרות מולקולריות המפוקחות על ידי דלקת ברקמה של השילייה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגימה של רקמת סינוס של השליה תוך 30 דקות לאחר הלידה.
- בידוד של ציטוטרופובלסטים לצורך תרבית.
- טיפול של טרופובלסטים ב-TNFα כדי לדמות תנאים דלקתיים.
- ניתוח של מסלולי בקרה גנטית המושפעים מדלקת.
תוצאות עיקריות
- ביסוס של מודל תרבית טרופובלסט אמין.
- הדגמה של תפקידו של TNFα בוויסות ביטוי גנים בטרופובלסטים.
- זיהוי מסלולים קריטיים המושפעים מדלקת הקשורה להשמנה.
- תובנות לגבי יעדים טיפוליים פוטנציאליים לתפקוד לקוי של השילשייה.
מסקנות
- מודל הטרופובלסט מדמה ביעילות את הסביבה הדלקתית של השמנת יתר אצל האם.
- הממצאים תורמים להבנת הבקרה הגנטית של השילייה תחת תנאי דלקת.
- מחקר זה עשוי להנחות התערבויות עתידיות לבעיות שילייתיות הקשורות להשמנת יתר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דלקת הנגרמת מהשמנה במהלך ההיריון מהווה אתגר משמעותי לתפקוד השילייה, ומשפיעה על תוצאות העובר ועל מחקרים תרגומיים. מודל זה של טרופובלסט אנושי ראשוני מאפשר בחינה ישירה של סיגנלינג דלקתי, כגון מסלולים המתווכים על ידי TNFα, על בקרה של אוטופגיה בשילייה. המערכת מספקת פלטפורמה מבוקרת ורלוונטית למחלה להפחתת סיכונים מכניסטיים ולתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של תהליכי גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מונחית-היפותזה של מתווכים דלקתיים על ויסות גנים בשילייה.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד השפעות TNFα על רגולטורים של אוטופגיה כמו Rubicon.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות בהקשר של תאי אדם ראשוניים.
- מספק ביטחון חיזוי עבור אסטרטגיות של מודולציה של מסלולים במורד.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מערכת טרופובלסט ראשונית שעברה תיקוף לקבלת תוצאות כמותיות.
- מאפשר מדידה הדירה של שינויים בביטוי גנים וחלבונים תחת תנאי דלקת מוגדרים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות לסריקת מודולטורים של אוטופגיה ודלקת.
- מכין פלטפורמה ניתנת להרחבה להערכת השפעות של תרכובות על מסלולים של השילייה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות של השמנת יתר אצל האם ותפקוד לקוי של השליה.
- מספק רציפות תרגומית (translational continuity) מתצפיות in vivo למחקרי מנגנונים ex vivo.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של מטרות המעורבות בדלקת של השליה.
- מאפשר חקירה של סמנים ביולוגיים לבריאות השליה בהקשרים של מחלות מטבוליות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מודל זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי כך שהוא מאפשר בדיקה ישירה של היפותזות דלקתיות בתרופובלסטים אנושיים ראשוניים, ובכך תומך בזיהוי מועמדים לטיפול ובתיקוף מכניסטי.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשר בדיקת השערת אפס של ויסות אוטופגיה המונע על ידי TNFα בתאי שליה.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים וניתנים לשחזור של ביטוי גנים וחלבונים תחת גירויים דלקתיים מבוקרים.
- אנליזה: תומכת בהשוואה סטטיסטית של תנאי טיפול ומערכות יחסים של תגובה למנה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים בשילייה in vivo לתיקוף מכניסטי ex vivo בתאי אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר עבור מבחנים מגוונים המכוונים לדלקת שליה ולשיבוש מטבולי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במערכות יחסים בין מטרה למסלול עבור דלקת של השילייה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי בידוד תאים ראשוניים וטיפולים לצורך הדירות.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות המשך (go/no-go) עבור מטרות המווסתות אוטופגיה בהשמנת אם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מטרות שילייתיות לפיתוח נוסף.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמות אנושיות ובתרביות תאים ראשוניות.
- מחייב גישה לרקמת שליה ותשתית ייעודית לבידוד תאים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להשגת תוצאות הדירות.
- ייתכן צורך בהתאמה עבור גילאים גסטציוניים שונים או מצבי מחלה שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את זמינות הרקמה ואת השונות בין התורמים.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Collection of Placental Tissue
1:42
Isolation of Trophoblasts from Vilous Tissue
5:11
Density Centrifugation
6:29
Plating Cells
7:18
Treating Cells with TNFα and Harvesting Cells and Total Protein
9:10
Results: TNFα Regulates the Expression of Rubicon in Trophoblasts from Lean Pregnancies with Female Fetuses
10:20
Conclusion
