נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא להתבונן בהשפעת הזיהום הפטרייתי באורגניזם המודל C.Elegans. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מכניסטיות מרכזיות בתחום המחלות הזיהומיות, כגון גורמי אלימות פתוגנים, אפקטורים חיסוניים של המארח, כמו גם גילוי תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במערכת ניסויית לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן משתי נקודות המבט.

זוהי מערכת מהירה, קלה וחסכונית. למרות שהשיטה הספציפית הזו יכולה לספק תובנה לגבי פתוגנים פטרייתיים, היא יכולה להיות מיושמת גם על גורמים זיהומיים אחרים, כגון חיידקים או אפילו אורגניזמים מרובים כדי לחקור אינטראקציות מיקרוביאליות במארח חי. כדי לבצע בחירת תולעת, חותכים חתיכת חוט אלומיניום בגודל 1.5 ס"מ ואז מכניסים בזהירות כ- 0.5 סנטימטרים מהחוט לקצה פיפטת פסטר.

בעזרת מבער בונסן או מנורת אלכוהול ממיסים את קצה הפיפטה מזכוכית על ידי סיבובו האיטי בלהבה עד שהחוט נדבק היטב לפיפטה מבלי לפגוע בצורתו המקורית של קצה הפיפטה. לבסוף, בעזרת מלקחיים, כופפו בזהירות את קצה החוט ליצירת לולאה קטנה. להעברה מהירה של כמויות גדולות של תולעים לצלחות חדשות, השתמש במרית כדי לחתוך חתיכת אגר NGM המכילה את התולעים שנבחרו.

לאחר מכן הסר את החלק החתוך והנח אותו עם הפנים כלפי מטה על קצה התיקון של OP50 על צלחת חדשה. כדי להעביר תולעים בנפרד, הדליקו את החוט בקיסם התולעים עד שהוא אדום ואז הסירו אותו מהלהבה והניחו לו להתקרר למשך מספר שניות. בעזרת החוט שעל הבחירה, מגרדים בעדינות את התיקון של תרבית OP50 שגדלה על הצלחת החדשה, ומכסים את החוט בבחירה.

התרבות הצמיגה המכסה את קצה החוט גורמת לתולעים להיצמד לקצה הבור. לכן השתמש בתנועת החלקה כדי להרים בעדינות תולעים נבחרות. לאחר איסוף התולעים הנבחרות, הניחו אותן על צלחת חדשה על ידי החלקה עדינה של התרבית על פני האגר.

לאחר מכן הניחו את החוט לתוך הלהבה כדי להסיר את התרבות שנותרה על הבחירה. הניחו כ-20 בעלי חיים בוגרים על ידי קטיף או קיצוץ שלהם על צלחת עם 50 מיקרוליטר של זן E.coli OP50. כדי לאסוף את הביצים לאחר יום עד יומיים, הציפו את הצלחת ב -10 מיליליטר של מאגר M9.

לאחר מכן בעזרת פיפטה סרולוגית מזכוכית מערבבים בעדינות את התוכן על צלחת האגר כדי לשחרר בעלי חיים בוגרים או ביצים שנדבקו ל-OP50. אוספים את כל הנוזלים המכילים את הביצים והמבוגרים. העבירו את תמיסת M9 ו-OP50 לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה את הצינור ב -2, 100 x גרם למשך שתי דקות. לאחר מכן שאפו כתשעה מיליליטר של סופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. לאחר מכן, השתמש בשני מיליליטר מים סטריליים, מיליליטר אחד של אקונומיקה ומיליליטר אחד של 0.25 נתרן הידרוקסיד מולארי כדי להשעות את הגלולה.

מערבבים בעדינות על ידי היפוך עד שכ-70% מבעלי החיים הבוגרים נראים ליזה. בדרך כלל ביצים נשארות שלמות במהלך טיפול אקונומיקה קצר זה בגלל הקליפה שלהן. זה קריטי שכמות החשיפה לאקונומיקה תהיה מוגבלת בשלב זה.

חשיפה ממושכת לאקונומיקה תהרוס את הביצים. אם הכנת הביציות נכשלת, הגבל את משך החשיפה לאקונומיקה או דלל את התמיסה. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב-990 x גרם למשך שתי דקות.

שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מאגר M9. לאחר סיבוב שוב והסרת הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה, השתמש ב-200 מיקרוליטר של מאגר M9 כדי להשעות מחדש את הגלולה.

יש להוציא שלושה עד חמישה מיליליטר של YPD למבחנה סטרילית, ולהשתמש בלולאה סטרילית כדי לחסן אותה במושבה אחת של קנדידה אלביקנס. הנח את הצינור על תוף סיבובי בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך כ-16 עד 18 שעות. סמן שפופרת מיקרופוגה אחת של 1.5 מיליליטר להכיל C.albicans ואחרת להכיל OP50, ולאחר מכן רשום את המשקל של כל שפופרת ריקה.

העבירו 500 מיקרוליטר מתרבית C.albicans למשך הלילה לתוך הצינור המסומן C.Albicans. ו-1500 מיקרוליטר של תרבית OP50 למשך הלילה לתוך הצינור שכותרתו OP50. צנטריפוגה של הצינורות למשך 10 דקות ב-16, 100 x גרם, ואז שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורים.

השתמש ב-500 מיקרוליטר מים סטריליים כדי להשעות מחדש כל כדור. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות ב 16, 100 x גרם למשך חמש דקות. שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורים.

לאחר מכן רשום את המשקל הסופי של צינורות המיקרופוגה. קבע את המשקל של כל גלולה על ידי הפחתת המשקל ההתחלתי של צינורות המיקרופוגה מהמשקל הסופי. באמצעות מים סטריליים, יש להשעות את כדור C.albicans ל-10 מיליגרם למיליליטר ואת כדור ה-OP50 ל-20 מיליגרם למיליליטר.

לאחר מכן הכינו תערובת זיהום מאסטר על ידי שילוב של 10 מיקרוליטר של תמיסה של 50 מיליגרם למיליליטר של סטרפטומיצין. 2.5 מיקרוליטר של תרבית OP50. 0.5 מיקרוליטר של תרבית C.Albicans, ו -7 מיקרוליטר מים סטריליים.

עבור לוחות בקרה, צור תערובת מאסטר על ידי החלפת נפח תרבית C.albicans במים סטריליים. לאחר מכן השתמש במיקרופיפטה כדי לזרוע 20 מיקרוליטר של תערובת זיהום או תמיסת בקרת OP50 על מרכז לוחות ה-NGM. לאחר הכנת ביצים כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, ספור את הביצים תחת טווח הדיסקציה.

והשתמש ב-M9 כדי לדלל את תמיסת הביצים עד להשגת ריכוז של כחמש עד שש ביצים בריאות למיקרוליטר. בעזרת פיפטה, הוציאו דגימה של 20 מיקרוליטר המכילה כ-30 ביצים על צלחת NGM מוכנה באזור שבין תרבית החיידקים לצד הצלחת. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, ספרו את מספר התולעים הבוגרות החיות והמתות בכל צלחת. מחשיבים את החיה כמתה אם היא לא מגיבה להקשה על הראש על ידי חוט אלומיניום או להקשה על הצלחת. ספרו גם את מספר התולעים עם Dar ואשרו אם לבעל חיים יש Dar על ידי הקשה מהירה על הצלחת בשלב של מיקרוסקופ הדיסקציה.

בעלי חיים ללא דר ינועו לאחור מיד, בעוד שבעלי חיים עם דר יזדקקו לסבבים חוזרים ונשנים של הקשה כדי להפוך את כיוונם או שהם לא יעשו זאת כלל. כל יומיים העבירו את כל התולעים הבוגרות שנותרו על ידי קטיף תולעים על צלחת זיהום או בקרה חדשה. בשלב זה, במידת הצורך, בצע בדיקת הישרדות על ידי מעקב אחר מספר התולעים החיות, המתות והחסרות בכל יום.

חשוב להעביר את התולעים כל יומיים לפחות. זה מבטיח שהתולעים הבוגרות שזוכות לניקוד בבדיקה זו לא יתבלבלו בצאצאיהן. C.elegans נחשפו ל-C.albicans במשך תקופה של שישה ימים ונצפו לסימני זיהום, התקדמות המחלה ומוות.

הפנוטיפ של דאר נראה לעין ביותר ביום הרביעי של בדיקת ההישרדות, כפי שצוין על ידי אזור אנאלי בולט שאינו נראה בבעל החיים הלא נגוע. ידוע גם כי תולעים הנגועות ב- C.albicans מציגות נפיחות באזור הפות. בשני המקרים התולעת אינה מסוגלת לנקות את ההדבקה לאחר שהגיעה לשלב זה.

על מנת לדמיין קולוניזציה של C.albicans בלומן המעי, תולעים הוזנו ב-C.albicans מסוג בר המתויג ב-RFP הגורם לאזורי קולוניזציה להאיר באדום. C.albicans מאכלסים את לומן המעי ביום השלישי של הבדיקה. כפי שמוצג כאן, תולעים נגועות הראו נפיחות מעיים חמורה יותר ממה שנצפה בביקורת הלא נגועה.

בניסוי זה נבדקה יכולתן של התולעים לשרוד זיהום שנגרם על ידי מוטציה כפולה אלימה C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. תולעים הנגועות במוטציה הכפולה חיות סטטיסטית זמן רב יותר מקבוצת הביקורת. מה שמרמז על כך ששני הגנים הללו נדרשים לאלימות של C.albicans כנגד C.Elegans.

לאחר שליטה, כל חלק בטכניקה זו יכול להיעשות תוך שעה עד שעתיים בכל יום מתוחלת החיים של התולעת. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שייתכן שמשתמשים בגורמים זיהומיים. לכן יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים לבטיחות ביולוגית.

ניתן לבצע שינויים קלים בהליך הבסיסי הזה, כמו הכנסת חומרים מיקרוביאליים נוספים על מנת לחקור אינטראקציות מיקרוביאליות בהקשר של מארח חי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחלות הזיהומיות לחקור אלימות מיקרוביאלית, מנגנונים של תגובות חיסוניות מולדות של המארח, כמו גם גילוי של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתחזק ולתפעל C.Elegans ולהשתמש באורגניזם כדי לחקור אינטראקציות של מיקרואורגניזמים מארחים ברמה המולקולרית.

אל תשכח שעבודה עם פתוגנים מיקרוביאליים וריאגנטים כימיים, כמו נתרן אזיד, עלולה להיות מסוכנת ויש להשתמש באמצעי זהירות מתאימים כמו PPE ושיטות פינוי פסולת.