Name: נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: למד אינטראקציות מארח-חיידק ב-Caenorhabditis elegans לחקר מחלות זיהומיות וגילוי תרופות. שיטה זו מאפשרת לחקור גורמי עקה פתוגניים ותגובות חיסון מארח בצורה מהירה ויעילה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ביצע, נתמך על ידי המכון הפוליטכני וורצ.

1. הכנה של תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM) <ol><li>עבור 1 L של מדיה, לשלב 20 גרם אגר, מקור חנקן אורגני 2.5 g (למשל, מה נשארתי-peptone) ו- 3 גר' נתרן כלורי בבקבוקון 2 ל'. להוסיף 975 מ ל מים סטריליים.
	<ol><li>הוספה בבר מערבבים סטרילי. אם משתמש של המשפך מדיה אוטומטי, אבובים אוטוקלב ומדיה למשך 15 דקות; המדיה צריך להיות בלוק עבור יותר אם נפח גבוה יותר עשוי.</li>
	</ol></li> <li>להגדיר את המדיה בצלחת מערבבים ולאחר להתקרר.
	<ol><li>לאחר מדיה חם למגע (כ 60 ° C) גילוח ורחיצה כירורגית להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl 2, 25 מ של KPO 4 ו- 1 מ"ל של 0.5% כולסטרול באתנול.</li>
		<li>שופכים מדיה (ידנית או על ידי משאבת אוטומטית) תחת זרימה שכבתית לתוך 35 מ"מ x 10 מ"מ עקר פטרי. אפשר להתייבש תחת מכסה המנוע של 1-2 ימים לפני השימוש. 
		הערה: צלחות לאחסנו ב 4 ° C כדי למנוע זיהום.</li>
	</ol></li></ol> 2. ביצוע של תולעת לבחור <ol><li>לחתוך חתיכה 1.5 ס מ של חוט אלומיניום. בזהירות להוסיף כ 0.5 ס מ באורך הזה לתוך קצה פיפטה פסטר.
	<ol><li>באמצעות מבער בונזן או אלכוהול המנורה, להמיס את הטיפ פיפטה מזכוכית ידי סובבים לאיטם זה ב הלהבה עד הכבל הוא מאובטח דבקה הפיפטה מבלי להתפשר על הצורה המקורית של קצה פיפטה.</li>
	</ol></li></ol> 3. הכנה של e. coli תרבות <ol><li>באמצעות לולאה סטרילי, לחסן שמושבה בודדת של e. coli זן OP50 ב 200 מ ל מרק לוריא. דגירה בין לילה ברעידות-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>התרבות נוזלי מוכן לשימוש ביום המחרת, ניתן לאחסן ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש. 
	הערה: המתח e. coli, OP50, משמש כמקור מזון עבור C. elegans. תרבות זו עשוי לשמש עד כמה חודשים כאשר הוא מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 4. חיוני C. elegans תחזוקה <ol><li>זרע שהכין NGM פלטות אגר עם e. coli אכון כ 50-100 µL של תרבות נוזלי מוכן OP50 במרכז הצלחת.</li>
	<li>מכסה צלחות, לאפשר להם לייבוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה. לאחר יבש, במקום צלחות בגיל 37 ° C בלילה לצמיחה מהירה או לשמור בטמפרטורת החדר, אם צמיחה איטית יותר רצוי.</li>
	<li>להוסיף תולעים לצלחת על-ידי &#34; chunking, &#34; (ראה פרוטוקול שלב 5 &#34; Chunking ותולעים איסוף &#34;), אוסף תולעים בנפרד או הצבת ביצי התולעת ישירות לצלחת (ראה פרוטוקול שלב 6 &#34; ביצה הכנה &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking ותולעים איסוף הערה: &#34; Chunking, &#34; מתייחס שיטה אשר נפוץ ב- C. elegans תחזוקה. זה כרוך חיתוך מקטע של צלחת אגר NGM המכיל תולעים, מעביר את החתיכה הזאת על גבי צלחת חדשה, וכך גם העברת כמות גדולה של תולעים בתהליך. הזיהום עשוי גם לגזור את הצלחת באופן זה. כאשר בוחרים תולעים, חשוב לשמור על היושרה של אגר כי תולעים יכולים ללכת לאיבוד בתוך חורים אגר. בנוסף, חשוב לאפשר האיסוף להתקרר, לפני שתיגע הלוח כדי למנוע התכה של אגר. או לשרוף את התולעים.
<ol><li>על מנת להעביר במהירות כמויות גדולות של תולעים על גבי לוחיות הרישוי, לחתוך חתיכה של אגר NGM המכיל את התולעים שנבחר בעזרת מרית. להסיר את החלק הגזור ולמקם אותו הפרצוף למטה בקצה הדשא של OP50 על צלחת חדשה.</li>
	<li>העברת תולעים בנפרד כמתואר להלן פרוטוקול שלב 8.2, &#34; Assay הישרדות, &#34; באמצעות תולעת לבחור. להבה החוט של התולעת לבחור עד שזה אדום. להסיר אותה הלהבה ולאפשר לו להתקרר למשך כמה שניות.</li>
	<li>בעדינות באמצעות הכבל על האיסוף, לגרד את הדשא של התרבות OP50 גדל על הלוח החדש, המכסים את החוט על האיסוף.</li>
	<li>התרבות צמיגה המכסים את קצה החוט גורם תולעים לדבוק קצה האיסוף, ובכך בעדינות להרים תולעים שנבחר באמצעות תנועה swiping.</li>
	<li>ברגע שנבחר תולעים אסופים, למקם אותם על צלחת חדשה על-ידי העברת בעדינות תרבות מעבר אגר. מניחים את החוט הלהבה כדי להסיר הנותרים תרבות על האיסוף.</li>
</ol> 6. ביצה הכנה <ol><li>במקום כ 20 למבוגרים בעלי חיים (כ 2-3 ימים לאחר הבקיעה כאשר גדל ב- 20 ° C) על ידי איסוף או chunking כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 5, &#34; Chunking ותולעים איסוף, &#34; על צלחת עם 50 µL של e. coli זן, OP50.</li>
	<li>כדי לאסוף את הביצים, להציף את הצלחת עם 10 מ"ל M9 מאגר לאחר 1-2 ימים. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית, מערבולת, בעדינות להתסיס את תוכנו בצלחת אגר לשחרר ביצים תקוע OP50 או חיות למבוגרים. לאסוף את כל הנוזל המכיל ביצים עם מבוגרים.</li>
	צינור <li>M9 להעביר פתרון OP50 לתוך חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל-2,100 g x עבור 2 דק</li>
	<li>האחות כ 9 מ של תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר OP50.</li>
	<li>Resuspend בגדר 2 מיליליטר מים סטריליים, 1 מ"ל של אקונומיקה ו 1 מ"ל של 0.25 M NaOH.</li>
	<li>לערבב בעדינות על ידי היפוך עד הרוב (כ 70 אחוז) של בעלי חיים למבוגרים מופיעות lysed; בדרך כלל, ביצים נשארים בעינם במהלך טיפול קצר אקונומיקה זה בגלל המעטפת שלהם. Centrifuge צינור חרוטי ב 990 g x עבור 2 דק</li>
	<li>וביופסיה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. מחדש להשעות את צניפה ב 10 מ"ל של מאגר M9.</li>
	<li>Centrifuge את צינור חרוטי 990 g x עבור 2 דק וביופסיה תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה. מחדש להשעות גלולה עם 200 µL מאגר M9. 
	הערה: הכנת ביצה עשויים לדרוש ניסויים מרובים. ביצים עלול להיהרס אם הם נחשפו אקונומיקה יותר מדי זמן. אם לא בוקעות, או להקטין את הריכוז של אקונומיקה בתמיסה או להקטין את משך החשיפה מלבין.</li>
</ol> 7. הגדרת צלחת זיהום <ol><li>לוותר על 3-5 מ של YPD לתוך מבחנה סטרילית ולא לחסן אותו עם מושבה בודדת של קנדידה אלביקנס באמצעות לולאה סטרילי.
	<ol><li>למקם את הצינורית על תוף על כל ההזמנות עבור-16-18 h ב- 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>תווית 1.5 mL microfuge שפופרת אחת להכיל אלביקנס ג, ועוד אחד להכיל OP50. להקליט את המשקל של כל שפופרת ריק.
	<ol><li>500 המקום µL של הלילה אלביקנס ג תרבות לתוך צינור הנקרא אלביקנס ג ו- 1,500 µL של התרבות OP50 לילה (מתוך שלב 3.1) לתוך הצינור הנקרא OP50.</li>
		<li>צנטריפוגה 10 דקות ב 16,100 x ג וביופסיה תגובת שיקוע ללא גלולה מטריד.</li>
		<li>מחדש להשעות כל גלולה עם 500 µL של מים סטריליים. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- g x. 16,100</li>
		<li>וביופסיה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. להקליט את המשקל הסופי של צינורות microfuge.</li>
		<li>לקבוע את המשקל של כל גלולה על ידי הפחתת המשקל ההתחלתי של הצינורות microfuge לפי המשקל הסופי.</li>
	</ol></li> <li>שימוש במים סטריליים, מחדש להשעות בגדר אלביקנס ג ל 10 מ"ג/מ"ל, בגדר OP50 200 מ ג/מ ל. לגרום זיהום ראשי לערבב על ידי שילוב של µL 10 של פתרון 50 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין, 2.5 µL התרבות OP50, 0.5 µL של תרבות אלביקנס ג ו µL 7 מים סטריליים.
	<ol><li>עבור לוחות בקרה, ליצור שילוב אב על-ידי החלפת הנפח של תרבות אלביקנס ג במים סטריליים. זרע µL 20 של זיהום ערבוב או OP50 פתרון שליטה על גבי הלוחות מרכז של NGM באמצעות micropipette. 
		הערה: תולעים כ-100 נחוצים כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית במהלך ניתוח. זה וזמינותו מנוהל בדרך כלל כן. לפיכך, של 3.2 x מיקס זיהום, כמו גם של 3.2 x שליטה פתרון מורכב. תערובות אלה עשויים להיות מעט מעל 3 x המקורי כדי להבטיח כי µL מלא 20 הוא נזרע על כל צלחת, ומאפשר מקום לטעויות. מיקס מאסטר זה נוצר בגלל הלוע של התולעת הוא קטן מדי הזחל הראשונית (L1-L3) לצרוך אלביקנס ג. חשיפה סוכנים תרופתי כגון תהליך הזיקוק ( איור 3B), הסוכן הוא הציג את התערובת זיהום. הריכוז של הסוכן של נקבעת מדעית. לדוגמה, ב- 3B איור, 50 מיקרומטר פלוקונאזול מיוצג, אולם 0, 12.5, 25, 50, 100 מיקרומטר פלוקונאזול היו גם נבדק באמצעות פרוטוקול אותו.</li>
	</ol></li></ol> 8. ניתוח של פנוטיפ מעוותים אזור אנאלי (Dar) ואת וזמינותו להישרדות <ol><li>Visualize פנוטיפ דאר הערה: דאר בצורה הטובה ביותר הוא מדמיין בשלב L3 ומעבר. דאר מציג כמו בליטה קטנה באזור פי הטבעת פוסט של התולעת ( איור 2 א), אשר הופך להיות בולט יותר לאורך זמן.
	<ol><li>אשר אם חיה דאר על-ידי הקשה במהירות את הצלחת על הבמה של המיקרוסקופ לנתיחה; בעלי חיים ללא דאר להזיז לאחור באופן מיידי, בעוד בעלי חיים דאר יהיה עליך לחזור על סבבי הקשה להיפוך הכיוון שלהם, או שהם לא יעשה כן בכלל.</li>
	</ol></li> <li>Assay הישרדות <ol><li>הכנת ביצה מלאה כאמור שמתואר פרוטוקול בשלב 6, &#34; ביצה הכנה &#34;. לספור את הביצים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה, לדלל את הפתרון ביצה עם M9 עד ריכוז של 5-6 ביציות בריאות לכל µL מושגת. באמצעות פיפטה של, לוותר על 20 מדגם µL המכיל כ- 30 ביצים על גבי צלחת NGM מוכן, באזור בין התרבות חיידקי לצד צלחת (ביצים, מזון לתולעים, OP50, נמצאים בשני מקומות נפרדים).</li>
		<li>Incubate צלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לספור את מספר תולעים מתים מבוגרים וחיים על כל צלחת, כמו גם את המספר של תולעים עם דאר. להקליט את האחוז עם דר.</li>
		<li>לשקול חיה מתה, אם זה אינו מגיב שמצותתים על הראש על ידי חוט אלומיניום או הקשה על הצלחת.</li>
		<li>כל יום להעביר תולעים בוגרות שנותרו על ידי איסוף כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 5, &#34; Chunking ותולעים איסוף, &#34; על צלחת זיהום או הפקד החדש. בשלב זה, במידת הצורך, לבצע וזמינותו של הישרדות על-ידי מעקב אחר מספר תולעים בשידור חי, מת, חסר כל יום. 
		הערה: assay זו עשויה לפעול במשך שבועיים, החל מהכנת ביצה. בנוסף, הפתרון ביצה צריכה לא לפי ראות עיניך אל התרבות חיידקי, הפתרון עשוי להכיל עקבות של אקונומיקה אשר יכול להרוג את OP50. הפתרון צריך להיות גם לפי ביצים יכול להיות תקוע בין צידי הלוח, אגר כ 0.5 ס מ מהקצה של הצלחת, ראות עיניך. בנוסף, עקב התפשטות מהירה של תולעים, העברת מבוגרים על גבי לוחיות הרישוי הוא קריטי כדי להפריד אותם הצאצאים שלהם.</li>
	</ol></li> <li>לנתח הישרדות <ol><li>לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח עקומת הישרדות (עיין רשימת חומרים).</li>
		<li>השווה הישרדות עקומות בשיטת Grehan-Breslow-Wilcoxon (בהנחה כי הנתונים מכל הזמנים הישרדות המוקדמים מדויקות יותר מאשר מאוחר יותר פעמים, משקל הנתונים בהתאם) כמו גם כלים סטטיסטיים Logrank 45. 
		הערה: כך למשל, ב איור 4B -C, ההישרדות של תולעים מטופלים עם מוטציה אלביקנס ג הוא בהשוואה לאלו שטופלו פקדים פראי-סוג isogenic או complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ellis, H. M., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+programmed+cell+death+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans.</a> Cell. 44 (6), 817-829 (1986).</li>
<li>Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+gene+ced-9+protects+cells+from+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death.</a> Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+potential+anti-infectives+against+Staphylococcus+aureus+using+a+Caenorhabditis+elegans+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complement+Altern+Med%22%5BJournal%5D)">Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model.</a> BMC Complement Altern Med. 14, 4(2014).</li>
<li>Marsh, E. K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%2C+a+model+organism+for+investigating+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).</li>
<li>Sem, X., Rhen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Salmonella+enterica+in+Caenorhabditis+elegans+relies+on+disseminated+oxidative+stress+in+the+infected+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host.</a> PLoS One. 7 (9), e45417(2012).</li>
<li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000982(2010).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li>
<li>Bae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+virulence+genes+identified+by+bursa+aurealis+mutagenesis+and+nematode+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).</li>
<li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).</li>
<li>Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+innate+immune+response+triggered+by+Salmonella+enterica+requires+intact+LPS+and+is+mediated+by+a+MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway.</a> Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).</li>
<li>Kesika, P., Balamurugan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Shigella+boydii+infection+in+Caenorhabditis+elegans+and+bioinformatics+analysis+of+immune+regulatory+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions.</a> Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).</li>
<li>Cinar, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+hemolysin+is+required+for+lethality%2C+developmental+delay%2C+and+intestinal+vacuolation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5 (7), e11558(2010).</li>
<li>Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Candida+albicans+AP-1+protein+against+host+derived+ROS+in+in+vivo+models+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection.</a> Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).</li>
<li>Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenesis+assay+using+Saccharomyces+cerevisiae+and+Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+roles+for+yeast+AP-1%2C+Yap1%2C+and+host+dual+oxidase+BLI-3+in+fungal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis.</a> Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).</li>
<li>Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans-based%2C+whole+animal%2C+in+vivo+screen+for+the+identification+of+antifungal+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds.</a> Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).</li>
<li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. 7 (6), e1002074(2011).</li>
<li>Dieterich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstructed+human+epithelia+reveal+contributions+of+Candida+albicans+EFG1+and+CPH1+to+adhesion+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion.</a> Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).</li>
<li>Chen, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+Candida+albicans+cph1%2Fcph1+efg1%2Fefg1+transcription+factor+mutant+establishing+restricted+zone+of+infection+in+a+mouse+model+of+systemic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunopathol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection.</a> Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).</li>
<li>Ricicova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+formation+in+a+new+in+vivo+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model.</a> Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).</li>
<li>Fazly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+identifies+filastatin%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+Candida+albicans+adhesion%2C+morphogenesis%2C+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).</li>
<li>Lo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonfilamentous+C.+albicans+mutants+are+avirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent.</a> Cell. 90 (5), 939-949 (1997).</li>
<li>Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+damage+and+neutropenia+are+required+for+Candida+albicans+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e35(2008).</li>
<li>McDonough, K. A., Rodriguez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myriad+roles+of+cyclic+AMP+in+microbial+pathogens%3A+from+signal+to+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).</li>
<li>Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+white-opaque+phenotypic+switching+in+Candida+albicans+by+the+Efg1p+morphogenetic+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator.</a> Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).</li>
<li>Li, F., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAP1%2C+a+Candida+albicans+gene+involved+in+binding+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells.</a> Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).</li>
<li>Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+Cph1p+and+Efg1p+mediate+activation+of+the+Candida+albicans+virulence+gene+SAP5+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection.</a> Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).</li>
<li>Korting, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+expression+of+the+hyphal-independent+Candida+albicans+proteinase+genes+SAP1+and+SAP3+in+the+efg1+mutant+is+associated+with+attenuated+virulence+during+infection+of+oral+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+.Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium.</a> J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).</li>
<li>Chamilos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+facile+model+for+large-scale+studies+of+virulence+mechanisms+and+antifungal+drug+efficacy+in+Candida+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species.</a> J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li>
<li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).</li>
<li>Mallo, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+antibacterial+defense+system+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible antibacterial defense system in C. elegans.</a> Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).</li>
<li>Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+enzymes+are+required+for+DAF-16-mediated+immunity+due+to+generation+of+reactive+oxygen+species+by+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).</li>
<li>Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+hydrogen+peroxide+produced+by+Enterococcus+faecium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium.</a> Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).</li>
<li>Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ce-Duox1%2FBLI-3+generated+reactive+oxygen+species+trigger+protective+SKN-1+activity+via+p38+MAPK+signaling+during+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans.</a> PLoS Pathog. 7 (12), e1002453(2011).</li>
<li>Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+and+human+dual+oxidase+1+%28DUOX1%29+%26%2334%3Bperoxidase%26%2334%3B+domains%3A+insights+into+heme+binding+and+catalytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) &#34;peroxidase&#34; domains: insights into heme binding and catalytic activity.</a> J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).</li>
<li>Issi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+Cluster+Transcription+Factors+Alter+Virulence+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans.</a> Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).</li>
<li>Ford, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+drug+resistance+in+clinical+isolates+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans.</a> Elife. 4, e00662(2015).</li>
<li>Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+mucosal+Candida+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+letters%22%5BJournal%5D)">Animal models of mucosal Candida infection.</a> FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+host+for+identifying+Gram-positive+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).</li>
<li>Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+Model+Host+for+Staphylococcus+aureus+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis.</a> Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).</li>
<li>Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenesis+assay+using+Saccharomyces+cerevisiae+and+Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+roles+for+yeast+AP-1%2C+Yap1%2C+and+host+dual+oxidase+BLI-3+in+fungal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis.</a> Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ניתן לשנות את שיטות assaying C. elegans זיהום והישרדות לאורך כל החיים חשיפה אלביקנס ג אשר תארנו לבחון פתוגן אחר. נוזלי תרביות של חיידקים או פטריות אחר ייתכן וגם למאכל C. elegans באופן דומה. בנוסף, ייתכן לבדיקה זיהומים טורי על-ידי קודם חשיפת הזחל ל one פתוגן כמתואר ולאחר מכן להעביר את החיות על צלחת חדשה המכילה חיידק נפרד לאחר שהגיע לבגרות.
כשניצח assay הזה, חשוב לשים לב זהירה של תזמון. ראשית, כאשר השלמת הכנת ביצה כדי למסוק ביצים עבור וזמינותו, זה קריטי כדי להגביל את כ...

C. elegans שימש כאורגניזם מודל חזק במשך יותר מ-50 שנה. בשנות השישים, ביולוג בדרום אפריקה סידני ברנר חלוץ השימוש של C. elegans ללמוד פיתוח עצביים, לסלול את הדרך לשושלת ארוכה של מדענים לחקור היבטים שונים של ביולוגיה תאים של בעלי חיים של נמטודות. זה כולל חתני פרס נובל קרייג מלו, אנדרו פייר עבור העבודה שלהם RNAi1, רוברט הורביץ, ג'ון סלסטון עבודתם על התפתחות האיברים ואפופטוזיס-2,-3,-4, מרטין צ'לפי על עבודתו על חלבון פלואורסצנטי ירוק5. למרות אורגניזם מודל זה שימש באופן מסורתי ללמוד ביולוגיה מולקולרית, התפתחותית, במשך 15 השנים האחרונות, חוקרים החלו להשתמש C. elegans כדי לחקור את הביולוגיה של פתוגנים אנושיים שונים כולל Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus סלמונלה enterica, בסרישיה marcescens6,7,8,9,10. מחקרים אלה חשף כי רבים של המנגנונים המעורבים באינטראקציה פתוגן-האדם נשמרים נמטודות, אלא גם כי ישנם כמה מנגנונים חסינות ייחודיים11,זה אורגניזם מודל12. בטבע, C. elegans נתקל מגוון רחב של איומים מפני פתוגנים בלע להציג באדמה, זה סיפק לחץ סלקטיבי חזקה להתפתח ולפתח לשמור על מערכת חיסונית מולדת מתוחכמת ב שלה לומן מעיים. רבים של גנים המנגנונים המעורבים ההגנה של לומן מעיים הם בניצוחו של אלמנטים והתפאורה מאוד שקיימים גם יונקים גבוהה יותר11,13. C. elegans ולכן מייצג מודל ללמוד פתוגנים מדרכי העיכול כמו סלמונלה enterica14, שיגלה boydii15או ויבריו כולרה16.
כאן אנחנו מדגישים צדדיות יוצא דופן של C. elegans כמחשב מארח דגם ללמוד מדבקים כגון אלביקנס ג. C. elegans כמחשב מארח המודל מאפשר תפוקה גבוהה הקרנה של התקפה אלימה פחות יקר, אורכת זמן רב יותר דגם העכבר, המשמש בדרך כלל ללמוד קנדידה42.
במחקר זה, אנו מראים כי מודל זה ואת וזמינותו להישרדות assosiated אמין ניתן ללמוד מארח מולדת המערכת החיסונית effectors חשוב לנטרל זיהומים, גורמים הפתוגן לנהוג התקפה אלימה, ולא תרופתי תרכובות שיכול. להתערב פתוגנזה. שיטה זו שונה כדי מבחני שתואר לעיל, מספק אמצעים של הלומדים חשיפה חיידק במהלך תקופת החיים של החיה, של הזחל לבגרות, ולא רק לבגרות אל המוות43,44. לסיכום, שלנו, C. elegans - מודל אלביקנס ג הוא כלי רב-תכליתי, עוצמה שניתן להשתמש בהם לא רק ללמוד את היסודות גנטי כי הכונן זיהום וחסינות אלא גם לזהות תרכובות חדשות התערבות טיפולית.

<table><tbody><tr><td>אגר (מגורען, דרגה בקטריולוגית)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>חוט אלומיניום (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss מיקרוסקופ הפוך</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans זן Bli-3</td><td>Caenorhabditis המרכז הגנטי</td><td>Bli-3 (e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>פישר מדעי</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול, דרגת סיגמא, מינימום 99%</td> <td>סיגמא</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית חד פעמיים (20 x 150 מ"מ)</td> <td>FIsherbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה (NI-150 תאורה בעוצמה גבוהה)</td> <td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (תוכנת ניתוח עקומת הישרדות)</td><td>תוכנת</td><td></td><td></td>GraphPad</tr><tr><td>LB Broth (Miller's)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי בינוניות (35 X 10 מ"מ)</td><td>פלקון</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר מדעי</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט</td><td>פישר מדעי</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

נמטודות. caenorhabditis elegans - מודל רב תכליתי in vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

נדגים שיטה באמצעות Caenorhabditis elegans כמחשב מארח דגם ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי. חיידקים הם הציגו באמצעות הדיאטה עושה המעי המיקום העיקרי למחלה. המעי נמטודות מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית מחקה בתרבית של המעיים, שקוף שהופך אותו לבצע מחקר מיקרוסקופיות של קולוניזציה. הנה אנחנו מראים כי פתוגנים יכול לגרום למחלות ומוות. אנו מסוגלים לזהות חיידקים מוטנטים להראות שונה התקפה אלימה. שלה שנשמרת תגובה הטבועה ביוטיים מדגיש גורם C. elegans מערכת מעולה כדי לחקור היבטים של אינטראקציות החיסון מולדים המארח. אנו מראים כי מארחים עם מוטציות בגן אוקסידאז כפול לא יכול להפיק מינים חמצן תגובתי, אינם מסוגלים לעמוד בפני העלבון מיקרוביאלי. נדגים נוסף צדדיות של וזמינותו להישרדות שהוצגו על-ידי הצגת כי זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של מעכבי צמיחת חיידקים. Assay הזה עשוי לשמש גם כדי לגלות את הגורמים התקפה אלימה פטרייתי כמטרות לפיתוח של סוכני פטריות חדשניים, כמו גם לספק הזדמנות לחשוף עוד יותר אינטראקציות מארח-חיידק. העיצוב של זה וזמינותו משאיל את עצמו היטב כדי תפוקה גבוהה מסכי הגנום כולו, בזמן יכולת הקפאה-שימור תולעים לשימוש עתידי הופכת במודל חיה כל חסכונית ואטרקטיבית, ללמוד.

Assay פתוגנזה (איור 1) באמצעות אלביקנס ג ו- C. elegans בעבר שתואר עד17,שלנו במעבדה18 ו-19,אחרים מעבדות20. נדגים את amenability של השימוש C. elegans ללמוד התקפה אלימה אלביקנס ג מראה כי אלביקנס ג תאים במהירות בלע מהתולעים להצטבר לומן מעיים גורם ומכניקה איטי, מעוותים אנאלי אזור (Dar) (<strong class="xf...

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא להתבונן בהשפעת הזיהום הפטרייתי באורגניזם המודל C.Elegans. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מכניסטיות מרכזיות בתחום המחלות הזיהומיות, כגון גורמי אלימות פתוגנים, אפקטורים חיסוניים של המארח, כמו גם גילוי תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במערכת ניסויית לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן משתי נקודות המבט.זוהי מערכת מהירה, קלה וחסכונית. למרות שהשיטה הספציפית הזו יכולה לספק תובנה לגבי פתוגנים פטרייתיים, היא יכולה להיות מיושמת גם על גורמים זיהומיים אחרים, כגון חיידקים או אפילו אורגניזמים מרובים כדי לחקור אינטראקציות מיקרוביאליות במארח חי. כדי לבצע בחירת תולעת, חותכים חתיכת חוט אלומיניום בגודל 1.5 ס"מ ואז מכניסים בזהירות כ- 0.5 סנטימטרים מהחוט לקצה פיפטת פסטר.בעזרת מבער בונסן או מנורת אלכוהול ממיסים את קצה הפיפטה מזכוכית על ידי סיבובו האיטי בלהבה עד שהחוט נדבק היטב לפיפטה מבלי לפגוע בצורתו המקורית של קצה הפיפטה. לבסוף, בעזרת מלקחיים, כופפו בזהירות את קצה החוט ליצירת לולאה קטנה. להעברה מהירה של כמויות גדולות של תולעים לצלחות חדשות, השתמש במרית כדי לחתוך חתיכת אגר NGM המכילה את התולעים שנבחרו.לאחר מכן הסר את החלק החתוך והנח אותו עם הפנים כלפי מטה על קצה התיקון של OP50 על צלחת חדשה. כדי להעביר תולעים בנפרד, הדליקו את החוט בקיסם התולעים עד שהוא אדום ואז הסירו אותו מהלהבה והניחו לו להתקרר למשך מספר שניות. בעזרת החוט שעל הבחירה, מגרדים בעדינות את התיקון של תרבית OP50 שגדלה על הצלחת החדשה, ומכסים את החוט בבחירה.התרבות הצמיגה המכסה את קצה החוט גורמת לתולעים להיצמד לקצה הבור. לכן השתמש בתנועת החלקה כדי להרים בעדינות תולעים נבחרות. לאחר איסוף התולעים הנבחרות, הניחו אותן על צלחת חדשה על ידי החלקה עדינה של התרבית על פני האגר.לאחר מכן הניחו את החוט לתוך הלהבה כדי להסיר את התרבות שנותרה על הבחירה. הניחו כ-20 בעלי חיים בוגרים על ידי קטיף או קיצוץ שלהם על צלחת עם 50 מיקרוליטר של זן E.coli OP50. כדי לאסוף את הביצים לאחר יום עד יומיים, הציפו את הצלחת ב -10 מיליליטר של מאגר M9.לאחר מכן בעזרת פיפטה סרולוגית מזכוכית מערבבים בעדינות את התוכן על צלחת האגר כדי לשחרר בעלי חיים בוגרים או ביצים שנדבקו ל-OP50. אוספים את כל הנוזלים המכילים את הביצים והמבוגרים. העבירו את תמיסת M9 ו-OP50 לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.צנטריפוגה את הצינור ב -2, 100 x גרם למשך שתי דקות. לאחר מכן שאפו כתשעה מיליליטר של סופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. לאחר מכן, השתמש בשני מיליליטר מים סטריליים, מיליליטר אחד של אקונומיקה ומיליליטר אחד של 0.25 נתרן הידרוקסיד מולארי כדי להשעות את הגלולה.מערבבים בעדינות על ידי היפוך עד שכ-70% מבעלי החיים הבוגרים נראים ליזה. בדרך כלל ביצים נשארות שלמות במהלך טיפול אקונומיקה קצר זה בגלל הקליפה שלהן. זה קריטי שכמות החשיפה לאקונומיקה תהיה מוגבלת בשלב זה.חשיפה ממושכת לאקונומיקה תהרוס את הביצים. אם הכנת הביציות נכשלת, הגבל את משך החשיפה לאקונומיקה או דלל את התמיסה. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב-990 x גרם למשך שתי דקות.שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מאגר M9. לאחר סיבוב שוב והסרת הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה, השתמש ב-200 מיקרוליטר של מאגר M9 כדי להשעות מחדש את הגלולה.יש להוציא שלושה עד חמישה מיליליטר של YPD למבחנה סטרילית, ולהשתמש בלולאה סטרילית כדי לחסן אותה במושבה אחת של קנדידה אלביקנס. הנח את הצינור על תוף סיבובי בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך כ-16 עד 18 שעות. סמן שפופרת מיקרופוגה אחת של 1.5 מיליליטר להכיל C.albicans ואחרת להכיל OP50, ולאחר מכן רשום את המשקל של כל שפופרת ריקה.העבירו 500 מיקרוליטר מתרבית C.albicans למשך הלילה לתוך הצינור המסומן C.Albicans. ו-1500 מיקרוליטר של תרבית OP50 למשך הלילה לתוך הצינור שכותרתו OP50. צנטריפוגה של הצינורות למשך 10 דקות ב-16, 100 x גרם, ואז שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורים.השתמש ב-500 מיקרוליטר מים סטריליים כדי להשעות מחדש כל כדור. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות ב 16, 100 x גרם למשך חמש דקות. שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורים.לאחר מכן רשום את המשקל הסופי של צינורות המיקרופוגה. קבע את המשקל של כל גלולה על ידי הפחתת המשקל ההתחלתי של צינורות המיקרופוגה מהמשקל הסופי. באמצעות מים סטריליים, יש להשעות את כדור C.albicans ל-10 מיליגרם למיליליטר ואת כדור ה-OP50 ל-20 מיליגרם למיליליטר.לאחר מכן הכינו תערובת זיהום מאסטר על ידי שילוב של 10 מיקרוליטר של תמיסה של 50 מיליגרם למיליליטר של סטרפטומיצין. 2.5 מיקרוליטר של תרבית OP50. 0.5 מיקרוליטר של תרבית C.Albicans, ו -7 מיקרוליטר מים סטריליים.עבור לוחות בקרה, צור תערובת מאסטר על ידי החלפת נפח תרבית C.albicans במים סטריליים. לאחר מכן השתמש במיקרופיפטה כדי לזרוע 20 מיקרוליטר של תערובת זיהום או תמיסת בקרת OP50 על מרכז לוחות ה-NGM. לאחר הכנת ביצים כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, ספור את הביצים תחת טווח הדיסקציה.והשתמש ב-M9 כדי לדלל את תמיסת הביצים עד להשגת ריכוז של כחמש עד שש ביצים בריאות למיקרוליטר. בעזרת פיפטה, הוציאו דגימה של 20 מיקרוליטר המכילה כ-30 ביצים על צלחת NGM מוכנה באזור שבין תרבית החיידקים לצד הצלחת. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, ספרו את מספר התולעים הבוגרות החיות והמתות בכל צלחת. מחשיבים את החיה כמתה אם היא לא מגיבה להקשה על הראש על ידי חוט אלומיניום או להקשה על הצלחת. ספרו גם את מספר התולעים עם Dar ואשרו אם לבעל חיים יש Dar על ידי הקשה מהירה על הצלחת בשלב של מיקרוסקופ הדיסקציה.בעלי חיים ללא דר ינועו לאחור מיד, בעוד שבעלי חיים עם דר יזדקקו לסבבים חוזרים ונשנים של הקשה כדי להפוך את כיוונם או שהם לא יעשו זאת כלל. כל יומיים העבירו את כל התולעים הבוגרות שנותרו על ידי קטיף תולעים על צלחת זיהום או בקרה חדשה. בשלב זה, במידת הצורך, בצע בדיקת הישרדות על ידי מעקב אחר מספר התולעים החיות, המתות והחסרות בכל יום.חשוב להעביר את התולעים כל יומיים לפחות. זה מבטיח שהתולעים הבוגרות שזוכות לניקוד בבדיקה זו לא יתבלבלו בצאצאיהן. C.elegans נחשפו ל-C.albicans במשך תקופה של שישה ימים ונצפו לסימני זיהום, התקדמות המחלה ומוות.הפנוטיפ של דאר נראה לעין ביותר ביום הרביעי של בדיקת ההישרדות, כפי שצוין על ידי אזור אנאלי בולט שאינו נראה בבעל החיים הלא נגוע. ידוע גם כי תולעים הנגועות ב- C.albicans מציגות נפיחות באזור הפות. בשני המקרים התולעת אינה מסוגלת לנקות את ההדבקה לאחר שהגיעה לשלב זה.על מנת לדמיין קולוניזציה של C.albicans בלומן המעי, תולעים הוזנו ב-C.albicans מסוג בר המתויג ב-RFP הגורם לאזורי קולוניזציה להאיר באדום. C.albicans מאכלסים את לומן המעי ביום השלישי של הבדיקה. כפי שמוצג כאן, תולעים נגועות הראו נפיחות מעיים חמורה יותר ממה שנצפה בביקורת הלא נגועה.בניסוי זה נבדקה יכולתן של התולעים לשרוד זיהום שנגרם על ידי מוטציה כפולה אלימה C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. תולעים הנגועות במוטציה הכפולה חיות סטטיסטית זמן רב יותר מקבוצת הביקורת. מה שמרמז על כך ששני הגנים הללו נדרשים לאלימות של C.albicans כנגד C.Elegans.לאחר שליטה, כל חלק בטכניקה זו יכול להיעשות תוך שעה עד שעתיים בכל יום מתוחלת החיים של התולעת. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שייתכן שמשתמשים בגורמים זיהומיים. לכן יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים לבטיחות ביולוגית.ניתן לבצע שינויים קלים בהליך הבסיסי הזה, כמו הכנסת חומרים מיקרוביאליים נוספים על מנת לחקור אינטראקציות מיקרוביאליות בהקשר של מארח חי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחלות הזיהומיות לחקור אלימות מיקרוביאלית, מנגנונים של תגובות חיסוניות מולדות של המארח, כמו גם גילוי של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתחזק ולתפעל C.Elegans ולהשתמש באורגניזם כדי לחקור אינטראקציות של מיקרואורגניזמים מארחים ברמה המולקולרית.אל תשכח שעבודה עם פתוגנים מיקרוביאליים וריאגנטים כימיים, כמו נתרן אזיד, עלולה להיות מסוכנת ויש להשתמש באמצעי זהירות מתאימים כמו PPE ושיטות פינוי פסולת.

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

נמטודות Caenorhabditis פראי קשורים חיידקים רבים, לעתים קרובות לומן המעיים או להדביק את המעי. פרוטוקול זה מפרט שיטה להעשרת חיידקים בלתי ניתנים לחישוב המתיישבים במעי, תוך ניצול ההתנגדות של עור דאואר.

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הטפיל המיקרוספורידי Nematocida parisii מאפשר לתולעים לייצר צאצאים שעמידים מאוד לאותו פתוגן. זוהי דוגמה לחסינות תורשתית, תופעה אפיגנטית לא מובנת היטב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות תורשתית במודל תולעת הניתנת למתיחה גנטית.

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט מביאים את המגוון המיקרוביאלי שנמצא בטבע למעבדה כדי להקל על מחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans. מובאים כאן פרוטוקולים להקמת ניסויי מיקרוקוסמוס, כאשר הניסויים מדגימים את היכולת לווסת את המגוון המיקרוביאלי הסביבתי כדי לחקור את הקשרים בין המגוון המיקרוביאלי הסביבתי לבין הרכב המיקרוביום של מעי התולעים.

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט כסביבות טבעיות מגוונות מיקרוביאלית לחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans הוא מודל רב-עוצמה לבחינת הדטרמיננטים המולקולריים המניעים אינטראקציות בין המארח למיקרוביום. אנו מציגים צינור בתפוקה גבוהה המתאר את רמות ההתיישבות של מיקרוביום המעי בבעלי חיים בודדים יחד עם היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה של C. elegans.

יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

כאן אנו מספקים הוראות לשימוש יעיל ב-SegElegans, מערכת למידה עמוקה שפיתחנו לפילוח אוטומטי של תולעים בודדות בתמונות מיקרוסקופיה רחבות, לשימוש מאוחר יותר בתוכנות ניתוח תמונות כגון ImageJ. אנו מספקים דרכים להשתמש במערכת הן באופן מקוון והן באופן לא מקוון.

ניתוח אוטומטי של תמונות פלואורסצנטיות של C. elegans באמצעות SegElegans

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

למד אינטראקציות מארח-חיידק ב-Caenorhabditis elegans לחקר מחלות זיהומיות וגילוי תרופות. שיטה זו מאפשרת לחקור גורמי עקה פתוגניים ותגובות חיסון מארח בצורה מהירה ויעילה.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

גלה סרטונים נוספים