ייצור ואפיון של סיבים Griffithsin-השתנה פיגומים לצורך מניעת מחלות המועברות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר ולשנות את פני השטח של חומצה פולילקטית, חומצה קו-גליקולית, סיבים חשמליים, עם כמויות משתנות של החלבון האנטי-ויראלי גריפיתסין. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אספקת התרופות, כגון כיצד לנסח ולאפיין כלי משלוח חדשים שיכולים למנוע זיהומים נגיפיים המועברים במגע מיני, כגון HIV-1. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהפעילות האנטי-ויראלית של גריפיתסין ממקסמת על ידי שימוש בסיבים פולימריים-אלקטרוספונים כפיגום נייח לגריפיתסין מקומי מאוד על פני הסיבים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בזיהומים נגיפיים וחיידקיים אחרים, בגלל הפוטנציאל המניעתי והטיפולי החזק של גריפיתסין כנגד מגוון סוגי זיהומים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה למניעת הידבקות ב-HIV-1, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון זיהומים נגיפיים או חיידקיים אחרים שבהם גריפיתסין הוכיח עוצמה. כדי להתחיל בהליך זה, שקלו 720 מיליגרם של 50/50 PLGA לתוך נצנוץ של 10 מיליליטר.

בעזרת פיפטת זכוכית סרולוגית, הוסף 3.0 מיליליטר HFIP. מכסים את השפל בסרט פלסטיק. לאחר מכן, מדוד ורשום את המסה השפלה.

דגרו את תרחיף הפולימר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להבטיח פירוק מוחלט של הפולימר. לאחר מכן, הכן את מנגנון האלקטרו-ספינינג כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש במזרק של שלושה מיליליטר כדי לשאוב את תמיסת הפולימר.

לאחר מכן, חבר קצה מחט קהה בגודל 18 בגודל 0.5 אינץ' למזרק. הוצא את התמיסה העודפת כדי להסיר חלל ראש ריק במחט. הנח את המזרק על משאבת מזרק, והגדר את קצב זרימת המכשיר ל-2.0 מיליליטר לשעה.

חבר את מקור החשמל למחט המזרק. אלקטרוספין את תמיסת הפולימר באמצעות מתח של 27 קילו-וולט חיובי. לאחר שהפתרון כולו חשמלי, כבה את מקור החשמל.

אפשר לצירת להסתובב במשך 30 דקות נוספות, כדי לאדות את הממס במלואו. לאחר מכן, כבה את אספן השדרה המסתובב. בעזרת סכין גילוח, מקלפים בעדינות את הסיבים מהמקנה.

אוספים את סיבי ה-PLGA האלקטרוספונים לצלחת פטרי מסומנת. מניחים את המנה בחומר ייבוש למשך הלילה כדי להסיר שאריות ממס. כדי להתחיל, הכן את פתרונות PBS ו-MES כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, הוציאו את ה-EDC וה-NHS מהמקפיא. תנו להם לנוח כדי להתאזן לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שקלו ארבעה מיליגרם של EDC לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

שקלו שישה מיליגרם של NHS לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה אחר. הוסף מיליליטר אחד של מאגר MES לכל צינור. מערבולת את שני הצינורות במרץ כדי להבטיח שהריאגנטים מומסים במלואם.

לאחר מכן, שקלו 70 מיליגרם הידרוקסילאמין לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר. הוסף 20 מיליליטר PBS, ומערבולת. המסה כמות מתאימה של סיבי PLGA לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר.

הוסף שמונה מיליליטר של מאגר MES לסיב. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של פתרונות EDC ו-NHS. השתמש בסרט פלסטיק כדי לאטום את צינור הצנטריפוגה החרוטי בנפח 15 מיליליטר.

הנח את הצינור על מסובב כדי להפוך בעדינות את התמיסה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 14 מיקרוליטר של בטא-מרקפטואתנול כדי להרוות את התגובה. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב מלא.

השליכו את הסופרנטנט ושטפו את סיבי ה-PLGA פעמיים באמצעות 10 מיליליטר PBS לכל שטיפה. הוסף כמות מתאימה של תמיסת מלאי GRFT לשפופרת, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסף מספיק PBS כדי להביא את הנפח הסופי לשמונה מיליליטר.

סגור והפוך את הצינור כדי להבטיח ערבוב יסודי. אטום את הצינור בסרט פלסטיק. הנח את הצינור על המסובב כדי להפוך בעדינות את התמיסה למשך שעתיים.

לאחר מכן, יש להרוות את התגובה על ידי הוספת שני מיליליטר מתמיסת ההידרוקסילאמין המוכנה, ומערבולת למשך 30 שניות. השליכו את הסופרנטנט. שטפו את סיבי ה-PLGA שהשתנו על פני השטח פעמיים, תוך שימוש ב-10 מיליליטר מים טהורים במיוחד, ומערבולת לכל שטיפה.

לאחר מכן, העבירו את הסיבים השטופים לצלחת פטרי. מניחים את צלחת הפטרי בתוך חומר ייבוש, עד שהסיבים יבשים לחלוטין. לאחר מכן אחסן את צלחת הפטרי בארבע מעלות צלזיוס.

כדי להתחיל, הגדר שלושה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מס שני מיליגרם סיבים לכל אחד. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של DMSO לכל צינור.

מערבולת למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להמיס לחלוטין את הסיבים. לאחר מכן, יש לדלל 10 מיקרוליטר לפחות פי 100, במאגר TE. יש לאחסן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס, עד לטעינת האפיון עם אלייזה.

שקלו בין 5 ל-10 מיליגרם של סיבים שעברו שינוי פני השטח, והעבירו אותם לצינור מיקרו-צנטריפוגה. רשום את מסת הסיבים המונחת בכל צינור. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסה המחקה את הסביבה הפיזיולוגית של כל דגימה.

דגרו את הדגימות על שייקר מסתובב ב-200 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, הסר כמיליליטר אחד מהתמיסה המכילה את ה-GRFT הנספג והכניס אותו לצינורות אשכול. יש לאחסן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לביצוע כימות חלבון.

לאחר מכן העבירו את הדגימה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת חיץ טרייה ודגר עד לנקודת הזמן הבאה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה נבדקים התנאים לייצור סיבי אלקטרוספון PLGA.

ניתוח SEM של סיבי GRFT ריקים, 0.05 ננומול, 0.5 ננומול ו-5 ננומול מצביע על כך שלשינוי GRFT אין השפעה על מורפולוגיה של סיבים. נראה כי לכל התצורות יש קוטר ממוצע דומה, בסביבות 1.9 מיקרון, מה שמדגים את העקביות של תהליך הייצור השונה על פני קבוצות. לאחר מכן נקבעת כמות ה-GRFT המצומד בסיבי האלקטרו-ספון.

השינוי של 5 ננומול מכיל 373 ננוגרם של GRFT, בעוד שהשינויים 0.5 ו-0.05 מכילים 165 ו-42, בהתאמה. זה מדגים שסיבים מצומדים עם צפיפות שינוי פני השטח התיאורטית גבוהה יותר מביאים ליותר GRFT מצומד לסיב. עם זאת, ניתן לראות מתאם הפוך ביעילות ההצמדה המתקבלת.

לאחר מכן, מעריכים את כמות ה-GRFT המצומד קוולנטית לסיב. בתוך ארבע השעות הראשונות, 113 ננוגרם, 25 ננוגרם ו-10 ננוגרם של GRFT למיליגרם של סיב אלקטרוספון מתגלים בריכוזי השינוי התיאורטי של 5 ננומול, 0.5 ננומול ו-0.05 ננומול, בהתאמה. לאחר ארבע שעות, GRFT זניח מתגלה בשחרור השחרור עבור כל שלושת הפורמולציות.

נתונים אלה מצביעים על כך שרוב ה-GRFT קשור קוולנטית לסיבי האלקטרוספון וכי ה-GRFT הנספג על פני השטח משתחרר תוך ארבע השעות הראשונות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כארבעה ימים. אלקטרו-ספינינג של פיגום סיבי הפולימר, דורש יומיים להכנת תמיסת הפולימר ולאלקטרוספינינג.

בעוד ששינוי פני השטח, ייבוש לאחר מכן ואפיון סיבים נדרשו לפחות יומיים נוספים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על היחסים הנכונים של ריאגנטים כדי להבטיח שינוי אופטימלי. יתר על כן, חשוב גם לוודא שהפרמטרים החשמליים נכונים כדי להבטיח מורפולוגיה מתאימה של סיבים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום אספקת התרופות לייצר סיבים חשמליים, שלא רק עוטפים חומרים אנטי-ויראליים בתוך הסיב, אלא בעלי יכולת להצמיד חומרים פעילים דרך פני הסיב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע סיבים פולימריים אלקטרוניים, לבצע שינוי פני השטח של סיבים עם החלבון האנטי-ויראלי גריפיתסין, וגריפיתסין איכותי מצומד לסיב. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים כגון HFIP, בטא-מרקפטואתנול, EDC ו-NHS עלולה להיות מסוכנת ביותר.

תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון יישום נכון של PPE, ושימוש במכסי אדים כימיים, בעת ביצוע הליך זה.