מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל
25 בספטמבר 2017
ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לנטר את הפעילות הסינפטית של בוטונים סינפטיים חזותיים בצומת העצב-שרירי של זחל הדרוזופילה. מערכת מודל מצוינת הניתנת לתיקון בקלות למניפולציות גנטיות. טכניקה זו יכולה לענות על שאלות מפתח במדע שלך.
כגון כיצד מוטציות של חלבונים סינפטיים מווסתות את ההעברה הסינפטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר את פעילותם של מספר מצומצם של אתרי שחרור ולתעד זרמים של קינטיקה מהירה וניתן לפתור אותה בקלות. כדי להתחיל בניסוי: הכן את חולץ המיקרואלקטרודה.
השתמש במיקרוסקופ בהגדלה של פי 35 כדי להבטיח שהקוטר הפנימי של האלקטרודה הנמשכת יהיה בטווח של שבעה עד עשרה מיקרומטרים. אחסן את הנימים במיכלים סגורים היטב כדי למנוע הצטברות אבק. לאחר מכן, אש נימים מלוטשים באמצעות מיקרו זיוף.
ודא שהקוטר הפנימי הסופי של האלקטרודה המלוטשת הוא חמישה מיקרומטרים. לאחר מכן, עברו לכיפוף. תקן את האלקטרודה במניפולטור ומקם את הקצה מעל החוט ולא נוגע בו.
הגדר את ערך החום ל-60-70% מהמקסימום ולחץ על דוושת המיקרו פורג' למשך שנייה עד שתיים כדי לחמם את הנימה. השתמש במחט בצורת L כדי למשוך בעדינות את קצה האלקטרודה כלפי מטה ולבצע את העיקול בכ-90 מעלות. החזק את האלקטרודה מעל להבת הלפיד ביד ובצע את העיקול השני בשבעה עד עשרה מילימטרים מהעיקול הראשון ובזווית של כ -120 מעלות.
הכן תמיסה דמוית המולימפה, או HL3. שמור את התמיסה במסנן והפוך אותה לטרייה מדי שבוע. הכן פיפטות גירוי באותו אופן כמו הקלטת פיפטות זכוכית מבלי לכופף אותן.
לאחר מכן, הכניסו פיפטת גירוי למחזיק מיקרואלקטרודה המחובר למזרק. צלחות חיתוך מיוצרות מצלחות פטרי קטנות המצופות באפוקסי גומי סיליקון. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים בחרו זחלי כוכב שלישי נודדים מבקבוקון.
הצמד את הזחלים והניח את הסיכה הראשונה בחלק האחורי וסיכה נוספת קדמית קרוב לווים בפה. הוסף פתרון HL3. בצד הגבי של הזחלים בצע חתך בעזרת מספריים קפיציים מהסיכה העליונה לסיכה התחתונה.
הצמד את פילה הזחלים והניח שני סיכות נוספות בצד שמאל וימין של הזחלים. הסר את המעיים וקנה הנשימה באמצעות מלקחיים. חותכים את העצבים ממש מחוץ לחוט העצב הגחוני באמצעות מספריים קפיציים.
מניחים את צלחת הפטרי עם התכשיר על במת המיקרוסקופ. הכנס את אלקטרודת הייחוס לאמבטיה. מלאו את אלקטרודת ההקלטה בתמיסת HL3.
תחת המטרה 10X טבלו את האלקטרודה באמבטיה והניחו אותה על שרירים 6 ו-7 מהפרעות הבטן של שתיים, שלוש או ארבע באמצעות המניפולטור המיקרו. לאחר מכן, העבר את המטרה ל-60X והתמקד באזור העניין באמצעות אופטיקה אפי-פלורסנציה או DIC. הנח את קצה האלקטרודה על גבי הזרוע הסינפטית ולאחר מכן לחץ את האלקטרודה בעדינות רבה על השריר מכיוון שלחץ מוגזם עלול לפגוע ב- NMJ או לגרום לעלייה בפעילות הסינפטית הספונטנית.
לאחר מכן, הפעל את המגבר, לוח AD והמחשב. לאחר מכן, בחר את מצב מהדק המתח במגבר. הפעל את תוכנת הרכישה ובחר במצב נטול פערים וצפה במראה של MEJCs על מסך המחשב.
ודא שהמשרעת של ה-MEJCs היא בטווח של 0.2 עד 0.7 ננו-אמפר. באמצעות מיקרו מניפולטור תחת בקרה חזותית, מקם את אלקטרודת הגירוי ליד האקסון המעצבב מקטעי בטן שניים עד ארבע. הפעל לחץ שלילי על ידי משיכת הבוכנה של המזרק המחובר למחזיק האלקטרודה כך שהאקסון נמשך בתוך האלקטרודה.
לאחר מכן, הפעל את הממריץ. סובב את הכפתור ביחידת הבידוד כדי להגדיר זרם אפס ולאחר מכן הגדל אותו בעדינות עד להופעת ה-EJC או עד להגעה לסף. בצע את הגירוי במשטר סף על.
עם הגירוי זרם הגירוי גדל בערך פי שניים בהשוואה לסף התצפית על EJC. מדוד את התנגדות האיטום של אלקטרודת תיקון המאקרו על ידי סיבוב מתג התנגדות האלקטרודה של המגבר למצב בדיקת האיטום. שימו לב לערך התנגדות האיטום בג'יגה אוהם שיוצג בחלון הנוכחי.
הקלטות מדבקות מאקרו מוקדיות מאפשרות ניטור פעילות סינפטית מבוטונים סינפטיים נבחרים. כאשר האלקטרודה ממוקמת על גבי בוטון סינפטי, ל-MEJCs המוקלטים יש אמפליטודות העולות באופן משמעותי על רמת הרעש ושלבים עולים חדים בטווח של תת-אלפית השנייה. כאשר אלקטרודת ההקלטה מתרחקת מהבוטון הסינפטי בכמה מיקרונים, משרעות ה-MEJC של המקליט יורדות כמעט לרמת הרעש.
בקושי ניתן להבחין בין ה-EJCs המוקלטים לבין הרעש ויש להם שלבי עלייה ממושכים. הקלטות מוקד מאפשרות זיהוי מדויק של MEJCs במוטציה המורכבת והגמדים. בעוד שההקלטות הבין-תאיות ממוטציה זו מציגות אירועים חופפים ולא ניתן לזהות אותם באופן מהימן.
התאמת הזוויות של שבב האלקטרו היא קריטית למיקום האלקטרודה. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת הדמיה של אירועי שחרור בודדים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו שילוב הפעילות של אזורים פעילים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקה לניטור פעילות סינפטית מבוטונים סינפטיים שעברו ויזואליזציה בחיבור העצבי-שרירי של זחלי דרוזופילה בשלב הגוזל השלישי (third instar larvae). על ידי מתן אפשרות לאיסוף זרמים סינפטיים מבוטון בודד, שואפת השיטה לבחון כיצד מוטציות בחלבונים סינפטיים משפיעות על ההעברה הסינפטית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- גנטיקה
רקע
- זחלי דרוזופילה משמשים כמודל מצוין למניפולציות גנטיות.
- הקלטות מוקדיות (Focal recordings) יכולות להבחין בזרמים בעלי קינטיקה מהירה מבטונים סינפטיים.
- הבנת התמסורת הסינפטית היא חיונית לפענוח התקשורת העצבית.
- ניטור של אתרי שחרור בודדים חושף תובנות לגבי תפקוד חלבונים סינפטיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לניטור מדויק של פעילות סינפטית.
- בחינת ההשפעה של מוטציות גנטיות על התמסורת הסינפטית.
- מתן אפשרות לחוקרים לצפות ישירות במנגנונים של תפקוד סינפטי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השיטה משתמשת בהקלטות macro patch מוקדיות מהצומת העצבי-שרירי של זחלי Drosophila.
- זחלים חיים בשלב ה-instar השלישי הוכנו, קובעו בסיכות ועברו דיסקציה לצורך גישה לתאים.
- התהליך כולל הכנת אלקטרודות, מיקום ומעקב באמצעות הגדרות של voltage clamp.
- שלבים קריטיים כוללים כיפוף מדויק של האלקטרודות ושמירה על התנגדות האיטום (seal resistance) במהלך ההקלטות.
תוצאות עיקריות
- הקלטות מוקדיות מאפשרות זיהוי ברור של זרמי צומת עירורי זעירים (MEJCs) מבוטונים סינפטיים מזוהים.
- שינויים באמפליטודות של MEJCs מעידים על השפעות מיקום האלקטרודה.
- שינויים אלקטרופיזיולוגיים היו ניכרים בתנאי מוטציה, ובכך סיפקו תובנות לגבי תפקוד לקוי של הסינפסה.
- הטכניקה זיהתה התנהגות סינפטית מובחנת לפני ואחרי מניפולציה במודלים גנטיים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים גישה בעלת ערך לחקירת פעילות סינפטית באתרים בודדים של שחרור.
- הבנת זרמים סינפטיים מרחיבה את הידע על מנגנונים נוירונליים ועל פלסטיות סינפטית.
- בסופו של דבר, שיטה זו תורמת להשלכות רחבות יותר על חקר השפעות גנטיות על תפקוד סינפטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
הקלטות מאקרו-פאץ' (macropatch) ממוקדות בחיבור העצבי-שרירי של זחלי Drosophila מאפשרות בחינה מדויקת של התמסורת הסינפטית באתרים בודדים של שחרור, ובכך תומכות בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מספקת נתונים כמותיים ברזולוציה גבוהה על זרמים סינפטיים, דבר המקל על תיקוף תפקודי של מטרות והבהרת מסלולים עבור הפרעות המוגדרות גנטית. השיטה מחזקת את הביטחון החזוי במודלים של ביולוגיה סינפטית, ומסייעת בקבלת החלטות לגבי תעדוף תיקי פיתוח וקידום במחקר ופיתוח (R&D) הממוקד בנוירוביולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה ישירה של האופן שבו מוטציות גנטיות בחלבונים סינפטיים משנות את ההעברה העצבית.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות פוטנציאליות על ידי בידוד פעילות סינפטית בבטונים (boutons) ספציפיים.
- מספק בהירות מכניסטית לחקירת מסלולים ולהפחתת סיכונים ביולוגיים.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירה או בתעדוף נמוך של מטרות סינפטיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכונן מערכת בדיקה כמותית ומתוּקפת למדידת זרמים סינפטיים ברזולוציה זמנית גבוהה.
- מאפשר זיהוי הדיר של אירועים סינפטיים מיניאטוריים ומעוררים לצורך סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- תומך בסטנדרטיזציה של קריאות אלקטרופיזיולוגיות בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מכין פלטפורמה חסונה להערכת מודולטורים של תפקוד סינפטי במערכת שניתן לתמרנה גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מנגנונים רלוונטיים למחלה על ידי מידול של תמסורת סינפטית גלוטמטרגית באורגניזם נגיש גנטית.
- מספק רצף מגילוי מולקולרי ועד לתיקוף פרה-קליני של פנוטיפים סינפטיים.
- מאפשר קידום מותאם-סיכונים של מטרות עם השפעה פונקציונלית מוכחת על זרמים סינפטיים.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים באמצעות נקודות קצה אלקטרופיזיולוגיות כמותיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים, ובכך היא מגשרת בין מניפולציה גנטית לבין מדדים סינפטיים תפקודיים.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבחינת היפותזות על תפקידם של חלבונים ומסלולים סינפטיים ספציפיים.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של זרמים סינפטיים לצורך פיתוח בדיקות ומוכנות לסריקה.
- אנליטיקה: מספקת נתונים אלקטרופיזיולוגיים ברמת דיוק גבוהה לצורך ניתוח השוואתי של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הפרעות מולקולריות לתוצאות סינפטיות תפקודיות הרלוונטיות למודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך תיקוף מתמשך של מטרות ומחקרים מכניסטיים במספר תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות סינפטיות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה אלקטרופיזיולוגיים לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרת ההשפעה התפקודית בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מטרות ומסלולים סינפטיים לצורך קידום.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה ומניפולציה מדויקת של מיקרו-אלקטרודות.
- דורש מכשור ייעודי, כולל מיקרוסקופיית DIC/פלואורסצנציה בהגדלה גבוהה ומגברי voltage clamp.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדת בין צוותים בתהליכי ייצור האלקטרודות ובפרוטוקולי ההקלטה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול לצורך נגישות לרקמה ולמבנה הסינפטי.
- המגבלות כוללות רגישות למיקום האלקטרודה והצורך בהתנגדות אטימה (seal resistance) יציבה כדי להבטיח את איכות הנתונים.
