Name: מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: חקור הקלטות מוקד מזרמי סינפטית בזחלי Drosophila באמצעות מיקרואלקטרודות מכופפות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לנטר שחרור נוירוטרנסמיטרים מאתרי שחרור בודדים וללמוד על השפעת מוטציות על תפקוד סינפטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

נתמך על ידי המענק-NIH R01 MH 099557

1. ייצור של הקלטה אלקטרודות <ol><li>מושך האלקטרודות זכוכית <ol><li>השתמש בהבא פרוטוקול פולר microelectrode (ראה טבלה של חומרים): <ol><li>קו 1: חום 510 משוך - מהירות 30 פעם 250; קו 2: מחממים למשוך 490 - מהירות 30 פעם 250. 
			הערה: יחידות זמן שיתאימו ms 0.5 ליחידה; היחידות האחרות הן יחסיות. הערך של החום צריך להיות מותאם עבור כל נימה לאחר הבדיקה הרמפה מתבצע.</li>
		</ol></li> <li>להשתמש במיקרוסקופ (35 x הגדלה) על מנת להבטיח כי הקוטר הפנימי של האלקטרודה משך בטווח של 7-10 מיקרומטר ( איור 1 א'). לאחסן הנימים במיכלים סגורים היטב כדי למנוע הצטברות אבק.</li>
	</ol></li> <li>אש ליטוש <ol><li>אש פולנית נימים (80-90% של ערך חום מרבי עבור s 1-2) באמצעות מיקרו-פורג (ראה טבלה של חומרים). ודא הקוטר הפנימי הסופי של האלקטרודה מלוטש 5 מיקרומטר ( איור 1 א') 27-</li>
	</ol></li> <li>Bending הערה: שני עיקולים נעשות לצורך מקם את האלקטרודות על השריר תחת מטרה בהגדלה.
	<ol><li>שימוש המנגנון באיור איור 1B. לתקן את האלקטרודה manipulator ומקם את הטיפ מעל חוט הלהט, לא נוגע את זה</li>
		<li>סט חום ערך ל- 60-70% מהמקסימום והקש על דוושת של המיקרו-פורג עבור s 1-2 (ראה טבלה של חומרים) כדי לחמם את הסיב. השתמש של המחט בצורת L כדי להוריד בעדינות את קצה האלקטרודה ( איור 1B מוגדלת). להפוך את העיקול על 90 o ( איור 1C).</li>
		<li>החזק האלקטרודה מעל להבת המבער ביד באמצעות מלקחיים ולעשות העיקול השני ממרחק של 7-10 מ מ העיקול הראשון, בזווית של-120 o ( איור 1C).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg"> איור 1. הצעד האחרון של ייצור micropipette. (א) אלקטרודה טיפים לאחר משיכת וליטוש אש. (B.1) ההתקנה עצה כיפוף. (B.2) באזור ממוסגר מוצג מוגדלת בצד הימין. האלקטרודה ואת הלהט קבועים כך הקצה אלקטרודה הוא ממוקם מעט מעל הגדר ונוגע לא. (C.1) האלקטרודה הקלטה. (C.2) באזור ממוסגר מוצג מוגדלת בצד הימין. העיקול הראשון יש זווית של-90°, המרחק בין קצה האלקטרודה העיקול הראשון הוא בערך 1 מ מ. גודל בר = 3 מ מ. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target="_blank"> לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
 2. צעדים הכנה נוסף <ol><li>הכן, כמו heamolymph (HL3) פתרון (במ מ): 70 NaCl, 5 אשלגן כלורי, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, טרהלוז 5, סוכרוז 115, 5 HEPES ו- 1 מ מ CaCl 2; להתאים את ה-pH ל 7.3 - 7.4. לשמור את הפתרון במקרר ולהפוך אותו טרי כל שבוע.</li>
	<li>לגרום גירוי pipets באותה דרך כמו הקלטה זכוכית pipets, חוץ מזה שאין שום צורך לכופף אותם. 
	הערה: הכנת גירוי אלקטרודות מתואר בפירוט 28 ו -27. הקוטר סופי לאחר ליטוש אש צריך להיות בטווח של 5-7 מיקרומטר.</li>
	<li>הוספה פיפטה גירוי של בעל microelectrode מחובר מזרק.</li>
	<li>ייצור לנתיחה צלחות קטנות צלחות פטרי (35 x 10 מ מ) מצופה אפוקסי גומי סיליקון (ראה טבלה של חומרים) כמתואר ב- 28- 
	הערה: גומי סיליקון צריך להיות לגמרי מוקשח לפני השימוש.</li>
	<li>לבחור הזחלים השלישי-לחלל נודד, לנתח את זה. כפי שמתואר 27 , 28 , 29 , 30- 
	הערה: כדי להמחיש עם העיתון ons, השתמש המתח לטוס CD8-GFP (ראה טבלה של חומרים) <ol><li>באמצעות מלקחיים (ראה טבלה של חומרים), לבחור את הזחלים לחלל רואד 3 מתוך בקבוקון.</li>
		<li>להצמיד את הזחלים, הצבת את הסיכה הראשונה האחורי ולהדק אחר הקדמי (סגור את הפה ווים).</li>
		<li>HL3 להוסיף פתרון.</li>
		<li>לעשות חתך באמצעות מעיין מספריים (ראה טבלה של חומרים) כל הדרך מן הסיכה העליונה לתחתית אחת בצד הגבי של הזחלים.</li>
		<li>להצמיד את פילה הזחלים, הנחת 2 סיכות נוספים על השמאלי והימני של הזחלים.</li>
		<li>להסיר את האומץ ואת tracheas באמצעות מלקחיים.</li>
		<li>לחתוך את העצבים מחוץ חוט עצבי הגחון באמצעות מספריים האביב.</li>
	</ol></li></ol> 3. חשמל הקלטות של שלטון <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg"> באיור 2. הגדרת הקלטה. המדגם NMJ מוצמדת סיליקון מצופים צלחת פטרי (חץ) ממוקם על השלב מטלטלין של המיקרוסקופ מתחם זקוף מצוידים עם יכולות epifluorescence, מטרה בהגדלה, micromanipulators שני. המיקרוסקופ מוצב על טבלת אנטי רטט. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol><li>הקלטה <ol><li>מקום צלחת פטרי עם ההכנה על הבמה מיקרוסקופ ( איור 2). הכנס האלקטרודה הפניה באמבטיה.</li>
		<li>למלא האלקטרודה הקלטה עם HL3 פתרון. תחת המטרה 10 x (ראה טבלה של חומרים), לטבול את האלקטרודה לתוך האמבט ומניחים אותו מעל השרירים 6 ו-7 המקטעים בטן 2, 3 או 4 שימוש את micromanipulator ((ראה טבלה של חומרים) איור 3 A.1, A.2).</li>
		<li>לעבור המטרה 60 x (ראה טבלה של חומרים). להתמקד באזור עניין באמצעות epi-זריחה או אופטיקה DIC. המקום קצה האלקטרודה מעל סינפטית בוטון ( איור 3 B.1-3).</li>
		<li>הקש האלקטרודה בעדינות לתוך השריר. לחץ מופרז עלול נזק NMJ או לגרום לעלייה בפעילות הסינפטית ספונטנית. ודא קצה האלקטרודה אינה סתומות - אם זה, להחליף את זה</li>
		<li>לעבור על המגבר, לוח A/D המחשב.</li>
		<li>לבחור את מצב קלאמפ מתח על המגבר.</li>
		<li>להתחיל רכישת התוכנה ולבחור ' ללא פער ' מצב.</li>
		<li>להתבונן במראה של mEJCs על מסך המחשב.</li>
		<li>לוודא משרעת של mEJCs זה בטווח של 0.2 - 0.7 הערך לא ישים 
		הערה: שלטון קטנים יותר לציין כי האלקטרודה ההקלטה יש פגמים או כי זה אינו ממוקם כראוי.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg"> איור 3. ויזואליזציה של סינפטית עם העיתון ons- (א) א brightfield תמונה של המי-קטע מתחת לגיל 10 x הגדלה (A.1) ואזור מסגרת מוגדלת מראה שרירי 6 ו-7 (A.2, החץ מסמן האלקטרודה הקלטה). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) סינפטית עם העיתון ons הם דמיינו קו דרוזופילה סמן עצביים מקודדים גנטית (CD8-GFP) באמצעות הדמיה epi-קרינה פלואורסצנטית (B.1) או DIC אופטיקה (B.2). תמונות נלקחים עם ה 60 x אובייקטיבית, הקוביה מסנן עבור GFP הדמיה (ראה טבלה של חומרים). Synaptic עם העיתון ons מסומנים עם החצים, כיסוי של פלורסנט ותמונות DIC מוצג B.3. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"> <li>גירוי <ol><li>באמצעות micromanipulator, תחת פקד חזותי, מקום האלקטרודה גירוי ליד האקסון innervating מקטעים בטן 2-4-</li>
		<li>החל לחץ שלילי על ידי משיכת את הבוכנה של המזרק מחובר למחזיק אלקטרודה, כך האקסון עשה בתוך האלקטרודה ( איור 2).</li>
		<li>הפעל ממריץ. סובב את כפתור על יחידת בידוד (ראה טבלה של חומרים) כדי להגדיר את זרם אפס ולאחר מכן בעדינות להגדיל אותו, עד שלטון יופיעו (או עד לסף).</li>
		<li>לבצע הגירוי במשטר suprathreshold, עם גירוי הנוכחי עלה כ פעמיים, לעומת הסף עבור הצפיה שלטון. 
		הערה: מניסיוננו, עוצמת גירוי כזה הוא אופטימלי כדי למנוע כשלים פוטנציאל הפעולה, פוטנציאל הפעולה ירי. לדוגמה, אם שלטון יופיע הזרם גירוי של 0.2 אמא, להשתמש זרם של 0.4 mA לאורך כל הניסוי.</li>
	</ol></li> <li>חותם ההתנגדות <ol><li>למדוד את ההתנגדות החותם של האלקטרודה macropatch הקלטה על-ידי הפעלת המתג התנגדות האלקטרודה של המגבר כדי " חותם מבחן " עמדה. לצפות כי הערך של עמידות חותם GΩ יוצג " הנוכחי " החלון.</li>
		<li>לוודא ההתנגדות החותם הוא בטווח של 0.5 - 2 מ' Ω. ערכים מחוץ לטווח זה מציינים כי האלקטרודה מלוטשים כראוי או לא תקינה מוצבים.</li>
		<li>לנטר את ההתנגדות חותם לאורך ההקלטה, מוודא שזה נותרת קבועה לאורך כל הניסוי.</li>
	</ol></li></ol> 4. ניתוח <ol><li>ניתוח הקלטות העסקת אישית תוכנה לניתוח (ראה טבלה של חומרים). 
	הערה: המעבדה שלנו משתמשת בתוכנה שבאתר Quantan 31, אשר הוא מותאם אישית עבור הגילוי של שלטון, mEJCs הקליט focally ( איור 4). תוכנה זו מאפשרת הגילוי של פסגות ההרים quantal חופפים quantal מרובת אירועים ( איור 4A) וכולל דיגיטלית מסנן לפי עקומת גאוס. גישות אחרות מתוארים 17.</li>
</ol> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg"> באיור 4. ניתוח quantal. זיהוי של mEJCs (א) ושלטון (B) על-ידי תוכנת Quantan. אזור האירוע מסומן בירוק, פסגות שסומנו על-ידי ראשי חץ אדום. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).</li>
<li>Katz, B., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+on+the+synaptic+delay+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction.</a> J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).</li>
<li>Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+proteins+and+quantal+release+at+single+active+zones+of+amphibian+%28Bufo+marinus%29+motor-nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).</li>
<li>Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+secretion+and+nerve-terminal+cable+properties+at+neuromuscular+junctions+in+an+amphibian+%28Bufo+marinus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus).</a> J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).</li>
<li>Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of active zones.</a> Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).</li>
<li>Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+quantal+secretion+from+visualized+sympathetic+nerve+varicosities+on+the+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens.</a> J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).</li>
<li>Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transmitter+release+by+synapsin+II+in+mouse+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals.</a> J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).</li>
<li>Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab3a-mediated+vesicle+recruitment+regulates+short-term+plasticity+at+the+mouse+diaphragm+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse.</a> Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).</li>
<li>Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+currents+evoked+by+graded+intracellular+depolarization+of+crayfish+motor+axon+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals.</a> J Physiol. 383, 587-599 (1987).</li>
<li>Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+and+its+facilitation+in+crayfish.+I.+Saturation+kinetics+of+release%2C+and+of+entry+and+removal+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium.</a> Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).</li>
<li>Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+changes+in+synaptic+release+sites+at+the+crayfish+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crayfish+neuromuscular+facilitation+activated+by+constant+presynaptic+action+potentials+and+depolarizing+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses.</a> J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+statistics+of+transmitter+release+during+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in the statistics of transmitter release during facilitation.</a> J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).</li>
<li>Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+at+the+lobster+neuromuscular+junction%3A+a+stimulus-dependent+mobilization+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model.</a> J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).</li>
<li>Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchrony+of+quantal+events+in+evoked+multiquantal+responses+indicates+presynaptic+quantal+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction.</a> J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).</li>
<li>Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechnisms+underlying+different+facilitation+forms+at+the+lobster+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).</li>
<li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions%2C+and+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).</li>
<li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfusional+control+of+quantal+current+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Postfusional control of quantal current shape.</a> Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).</li>
<li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+maintains+the+reserve+vesicle+pool+and+spatial+segregation+of+the+recycling+pool+in+Drosophila+presynaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons.</a> Brain Res. 1178, 52-64 (2007).</li>
<li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+endosomal+endocytic+pathway+increases+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size.</a> Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).</li>
<li>Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+Complexin+Accessory+Helix+with+Synaptobrevin+Regulates+Spontaneous+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion.</a> Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).</li>
<li>Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+unit+populations+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).</li>
<li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+current+and+release+at+the+crayfish+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).</li>
<li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Ca2%2B+inflow+to+quantal%2C+phasic+transmitter+release+from+nerve+terminals+of+frog+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle.</a> Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).</li>
<li>Marrero, H. G., Lemos, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarrero%2C+HG+%22Loose-Patch-Clamp+method%22">Loose-Patch-Clamp method</a>. , 2 ed, Humana Press. (2007).</li>
<li>Wu, W. H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+recordings+of+high+and+low+output+NMJs+on+the+crayfish+leg+extensor+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+1-43+labeling+of+synaptic+vesicle+pools+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19229190">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Imlach, W., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+methods+for+recording+synaptic+potentials+from+the+NMJ+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+quantal+analysis+more+convenient%2C+fast%2C+and+accurate%3A+user-friendly+software+QUANTAN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN.</a> J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).</li>
<li>Huntwork, S., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complexin+fusion+clamp+regulates+spontaneous+neurotransmitter+release+and+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth.</a> Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).</li>
<li>Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+plasticity+in+Drosophila+memory+mutants+with+a+defective+cyclic+AMP+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade.</a> Science. 251 (4990), 198-201 (1991).</li>
<li>Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+of+vesicle+pools%2C+rates+of+mobilization%2C+and+recycling+at+neuromuscular+synapses+of+a+Drosophila+mutant%2C+shibire%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire.</a> Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).</li>
<li>Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+evoked+release+are+independently+regulated+at+individual+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones.</a> J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

דרוזופילה מייצג אורגניזם מודל יתרון ללמוד הסינאפסית. מספר תצורות הקלטה השתמשו ב- NMJ זחל, כולל הקלטות תאיים של סינאפטיים, הקלטות של זרמי סינפטית עם שתי האלקטרודות מתח קלאמפ33,34, מיקוד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית המתוארים כאן. הטכניקה השנייה מאפשרת כימות מדויק של ההעברה הסינאפסית-עם העיתון ons מטמיעים.
ההצלחה של הפרוטוקול המתואר אנושות תלוי היכולת להמחיש בבירור את תחומי עניין, כדי להתאים אישית את הכנת הקלטה אלקטרודות. לפ...

דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוין לחקור את המנגנונים המולקולריים שליטה הסינאפסית. מערכת neuromuscular דרוזופילה הוא glutamatergic, ולכן צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) יכול לשמש כדי לחקור את התכונות ההכפלה של שחרור glutamatergic. מאז של יאן וג'ן מחקר1, הזחלים לחלל השלישי שימש בהרחבה ללמוד עורר וספונטני הסינאפסית על-ידי ניטור צומת סינאפסות פוטנציאל (EJPs) או זרמי (שלטון). EJPs בדרך כלל נרשמים intracellularly עם מיקרו-אלקטרודת זכוכית חדים, הם משקפים את הפעילות של NMJ כולו, כולל כל עם העיתון ons עושה הסינפסות סיבי השריר נתון.
לעומת זאת, הפעילות של מספר מוגבל של האתרים של שחרור ניתן להקליט focally על-ידי הצבת טיפ micropipette ליד מסופי עצביים או varicosities סינפטית. טכניקה זו במקור מועסק על ידי כץ ו Miledi2, הקלטות חוץ-תאית מוקד יש כבר מועסקים בהצלחה ב מספר הכנות NMJ, כולל צפרדע3,4,5, העכבר6 , 7 , 8, סרטנאים9,10,11,12,13,14,15,16, ו- דרוזופילה17,18,19,20,21,22,23. גישה זו פותחה עוד יותר על ידי Dudel, אשר מותאם במיוחד macropatch recoding אלקטרודות24,25. בהטמעה של Dudel, טכניקה זו התאימה היטב רופף-תיקון-קלאמפ שיטת26.
NMJ זחל דרוזופילה הגדירה בבירור עם העיתון ons סינפטית, קווים הטרנסגניים בתגים מקודדים גנטית פלורסנט עצביים (ראה טבלה של חומרים) זמינים. יתרונות אלה אפשרו לנו להקליט שלטון ו mEJCs מ21,20,22שנבחר בוטון סינפטית. כאן, אנו מתארים את טכניקה זו בפירוט.

<table><tbody><tr><td>Sutter P-97</td><td>Sutter instrument</td><td>P-97</td><td>חולץ מיקרואלקטרודות</td></tr><tr><td>Narishige MF-830</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>WPI MF200</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>זכוכית קפילרים</td><td>WPI</td><td>B150-86-10</td><td>קמפי זכוכית</td></tr><tr><td>Microtorch 1WG61</td><td>גרגר</td><td>1WG61</td><td>Microtorch</td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td>סיליקון להכנת צלחות חיתוך</td></tr><tr><td>סיכות חיתוך סיכות</td><td>B00J5PMPJA של אמזון</td><td></td><td>למיקום זחלים</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>WPIINC</td><td>500342</td><td>פינצטה להנחת סיכות, הסרת המעיים וקנה הנשימה.</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>WPIINC</td><td>501778</td><td>מספריים לחיתוך הקוטיקולה של הזחלים והעצבים.</td></tr><tr><td>אולימפוס BX61WI</td><td>אולימפוס</td><td>BX61WI</td><td>מיקרוסקופ זקוף</td></tr><tr><td>אולימפוס Lumplan FL N 60x</td><td>אולימפוס</td><td>UPLFLN 60X</td><td>מיקרוסקופ אובייקטיבי 60X</td></tr><tr><td>אולימפוס UPlan FL 10x</td><td>אולימפוס</td><td>Uplanfl N 10X</td><td>מיקרוסקופ אובייקטיבי 10X</td></tr><tr><td>Narishige מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>MHW-3</td> שלושה <td>צירים מים הידראולי מיקרומניפולטור</td></tr><tr><td>npi אלקטרוני GmbH ELC-03XS</td><td>npi אלקטרוני GmbH</td><td>ELC-03XS</td><td>מגבר אלקטרופיזיולוגי</td></tr><tr><td>A.M.P.I מאסטר 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>מאסטר 8</td><td>סטימולטור חשמלי</td></tr><tr><td>A.M.P.I איזו-פלקס</td><td>A.M.P.I.</td><td>מבודד גירוי</td> <td>Iso-Flex</td></tr><tr><td>TMC שולחן נגד רטט</td><td>TMC</td><td>63-9090</td><td>שולחן נגד רעידות</td></tr><tr><td>TMC כלוב פאראדיי</td><td>TMC</td><td>81-333-90</td><td>כלוב פאראדיי</td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td>מחשב Digidata</td></tr><tr><td>Dell</td><td></td><td>Dimension 5150</td><td>מחשב עם</td></tr><tr><td>מחזיק אלקטרודות</td> Win XP OS <td>WPI</td><td>MEH3SW</td><td>מחזיק אלקטרודה</td></tr><tr><td>מסנן אופטי</td><td>אומגה אופטי</td><td>XF 115-2</td><td>קוביית סינון לזיהוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)</td></tr><tr><td>pCLAMP 8</td><td>Axon Instruments</td><td>8.0.0.81</td><td>תוכנה להקלטת אותות</td></tr><tr>תוכנה <td>פנימית</td><td></td> של<td>Quantan</td> תוכנה <td>לעיבוד אותות</td></tr><tr><td>Canton-S (Wildtype)</td> <td>מרכז המניות בלומינגטון</td><td>64349</td><td>קו זבוב בקרה</td></tr><tr><td>cpx SH1</td><td>מתנה נדיבה של J.T.</td><td></td> <td>Littleton-Complexin קו זבוב נוק-אאוט עם אקסוציטוזיס ספונטני מוגבר</td></tr><tr><td>CD8-GFP</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>5137</td><td>קו זבוב עם תג פלואורסצנטי עצבי (GFP)</td></tr></tbody></table>

מוקד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה neuromuscular זחל

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) היא מערכת מודל מצויין ללמוד הסינאפסית glutamatergic. אנו מתארים את הטכניקה של מוקד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מ עם העיתון ons מטמיעים ב- NMJ זחל דרוזופילה . טכניקה זו דורשת מותאם אישית פבריקציה נוספת של הקלטה micropipettes, כמו גם מיקרוסקופ המתחם מצויד בהגדלה גדולה, המטרה טבילה במים למרחקים ארוכים, אופטיקה חדות (DIC) התערבות דיפרנציאלית של פלורסנט קובץ מצורף. האלקטרודה הקלטה ממוקם בחלק העליון בוטון סינפטית שנבחר דמיינו אופטיקה DIC, epi-זריחה, או שניהם. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ניטור פעילות סינפטית של מספר מצומצם של אתרים של שחרור. האלקטרודה ההקלטה יש קוטר של מספר מיקרונים, האתרים שחרור ממוקם מחוץ לקצה אלקטרודה אינם משפיעים באופן משמעותי את הזרמים המוקלט. הזרמים סינפטית מוקלטות יש קינטיקה מהיר, ניתן לפתור בקלות. יתרונות אלה חשובים במיוחד עבור הלימודים של קווי לעוף מוטנטים עם פעילות סינפטית משופרת ספונטני או אסינכרוני.

הקלטות macropatch מוקד מאפשרים ניטור פעילות סינפטית של הנבחרת עם העיתון ons סינפטית (איור 5). כאשר האלקטרודה ממוקמת בחלק העליון בוטון סינפטית (איור 5A, אתר 1), mEJCs המוקלט (איור 5C, אתר 1) יש את amplitudes באופן משמעותי העולה על רמת הרעש וחדד בעליה שלבים (מטווח תת אלפיות השנייה). כאשר האלקטרודה הקלטה הזזת את בוטון סינפטית על ידי מספר מיקרונים (איור 5A, אתר 2), amplitude...

ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לנטר את הפעילות הסינפטית של בוטונים סינפטיים חזותיים בצומת העצב-שרירי של זחל הדרוזופילה. מערכת מודל מצוינת הניתנת לתיקון בקלות למניפולציות גנטיות. טכניקה זו יכולה לענות על שאלות מפתח במדע שלך.כגון כיצד מוטציות של חלבונים סינפטיים מווסתות את ההעברה הסינפטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר את פעילותם של מספר מצומצם של אתרי שחרור ולתעד זרמים של קינטיקה מהירה וניתן לפתור אותה בקלות. כדי להתחיל בניסוי: הכן את חולץ המיקרואלקטרודה.השתמש במיקרוסקופ בהגדלה של פי 35 כדי להבטיח שהקוטר הפנימי של האלקטרודה הנמשכת יהיה בטווח של שבעה עד עשרה מיקרומטרים. אחסן את הנימים במיכלים סגורים היטב כדי למנוע הצטברות אבק. לאחר מכן, אש נימים מלוטשים באמצעות מיקרו זיוף.ודא שהקוטר הפנימי הסופי של האלקטרודה המלוטשת הוא חמישה מיקרומטרים. לאחר מכן, עברו לכיפוף. תקן את האלקטרודה במניפולטור ומקם את הקצה מעל החוט ולא נוגע בו.הגדר את ערך החום ל-60-70% מהמקסימום ולחץ על דוושת המיקרו פורג' למשך שנייה עד שתיים כדי לחמם את הנימה. השתמש במחט בצורת L כדי למשוך בעדינות את קצה האלקטרודה כלפי מטה ולבצע את העיקול בכ-90 מעלות. החזק את האלקטרודה מעל להבת הלפיד ביד ובצע את העיקול השני בשבעה עד עשרה מילימטרים מהעיקול הראשון ובזווית של כ -120 מעלות.הכן תמיסה דמוית המולימפה, או HL3. שמור את הת

focal-macropatch-recordings-synaptic-currents-from-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

יישום electrophysiology כדי סינפסות נגיש מספק מדד לכימות הפעילות הסינפטית, שימושי בניתוח מוטנטים הסינפטי. מאמר זה מתאר שיטה לנתיחה נהג לחשוף את בצמתים neuromuscular (NMJ)...

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

מאמר זה מדגים כיצד לנהל הקלטות אלקטרו התגובות הסינפטי על השרירים extensor ברגל הליכה של סרטן וכיצד מסופי העצב הם דמיינו כדי להראות את ההבדלים המורפולוגיים ברוטו גבוהה ונמוכה פלט מסופים עצב.

הקלטות פיזיולוגיים של NMJs פלט גבוה ונמוך על שרירים ברגליים סרטן הנהרות extensor

הזחל דג הזברה לייצג את חוליות first מודל המערכת כדי לאפשר הקלטה סימולטני מהדק תיקון של שריר מוטורי עצבי היעד השדרה השלד. וידאו זה מדגים את שיטות מיקרוסקופיות משמש לזיהוי שווי סגמנטלי מוטורי עצבי שרירים תאים היעד, כמו גם מתודולוגיות עבור הקלטה של ​​כל סוג תא.

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

בתיקון אתר הקלטות מהדקות משמשות לאפיון אלקטרו של הנוירונים במעגלים ללא פגע. בדרוזופילה הגנטית מודל התיקון Clamping קשה בגלל מערכת העצבים המרכזיים היא קטנה ומוקף בנדן איתן. מאמר זה מתאר את ההליך כדי להסיר את הנדן ונקי נוירונים להקלטות מהדקות תיקון לאחר מכן.

הכנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים מרכזיים עבור<em&gt; באתר</em&gt; התיקון clamping

צומת נוירומוסקולרי דרוזופילה (NMJ) משמש כמודל לחקר המורפולוגיה והתפקוד של סינפסות. סרטון זה מתאר תכונות חשובות שהחוקרים מכמתים כדי לאפיין את NMJ. הפרוטוקול לדוגמה מדגים תוכנה המסוגלת לבצע את הכימות באופן אוטומטי.

דרוזופילה כימות צומת נוירומוסקולרי (NMJ): שיטה להערכת מורפולוגיה ותפקוד סינפטיים

סרטון זה מדגים את הטכניקה להקלטת זרמים סינפטיים מבוטון סינפטי בצומת העצבית-שרירית של זחל דרוזופילה. טכניקה זו מאפשרת ניטור הפעילות של בוטון סינפטי יחיד, החשוב לחקר קווי זבובים מוטנטיים בעלי פעילות סינפטית ספונטנית או אסינכרונית מוגברת.

הקלטת זרמים סינפטיים בצומת הנוירומוסקולרית של זחל דרוזופילה

פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

חקור הקלטות מוקד מזרמי סינפטית בזחלי Drosophila באמצעות מיקרואלקטרודות מכופפות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לנטר שחרור נוירוטרנסמיטרים מאתרי שחרור בודדים וללמוד על השפעת מוטציות על תפקוד סינפטי.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

גלה סרטונים נוספים