שיטות ניתוח ההשפעות של אורניום טבעי על במבחנה Osteoclastogenesis

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את ההשפעות של חשיפה טבעית לאורניום על כדאיות, התמיינות ותפקוד אוסטאוקלסטים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרעילות הסביבתית לגבי השפעת החשיפה לאורניום על הפיזיולוגיה והמטבוליזם של העצם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כלי חדש ומעניין לסינון יוצרי אורניום.

כאשר תרבית התאים RAW 264.7 הגיעה למפגש של 85 עד 90%, השתמש במגרד תאים כדי להרים מכנית את התאים מתחתית בקבוק תרבית התאים ולהעביר את התאים לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר. פיפט את תמיסת התא כמה פעמים כדי לפרק את הגושים ולספור את התרחיף החד-תאי שנוצר. יש לדלל את התאים לריכוז חד פעמי של 10 עד 4 תאים למיליליטר במדיום חיוני מינימלי שעבר שינוי אלפא, בתוספת L-גלוטמין וסרום בקר עוברי 5% ולהוסיף מיליליטר אחד של תאים לבאר לצלחת תרבית תאים של 24 בארות לדגירה של שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

פרמטר חשוב לשחזור של התמיינות האוסטיאוקלסט ובדיקת הספיגה מחדש הוא צפיפות זריעת התאים. שימו לב במיוחד לספירת התאים, הכנת ההשעיה התאית וההומוגניות שלה לפני ציפוי התאים. להכנת תמיסת מלח המשתנה, החל מתמיסה מימית של נתרן ביקרבונט 7.5% שנבדקה בתרבית תאים סטרילית, הכינו תחילה וקררו 100 מיליקרבונט במים על קרח והוסיפו נפח אחד של תמיסת אצטט משתנה 100 מילי-מולרי, טיפה אחר טיפה, לתשעה נפחים של תמיסת הביקרבונט הקרה כקרח עם ניעור עדין.

אפשר לתמיסה להתייצב בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש שעות, יש לדלל את הנפח המתאים של תמיסת המשתנה, טיפה אחר טיפה, למדיום התמיינות המכיל 50 ננוגרם למיליליטר RANKL עד להשגת ריכוז העבודה הרצוי במשתנה ולאפשר שלוש שעות נוספות של שיווי משקל בטמפרטורת החדר. שלבי הדגירה הארוכים לאחר כל דילול של מלח המשתנה חיוניים לייצוב מתחמי המשתנה בתמיסות.

בתום תקופת שיווי המשקל השנייה, החלף בעדינות את המדיום בכל באר במיליליטר אחד של מדיום שטופל או בקרה לפי הצורך והחזיר את התאים לחממה. אוסטאוקלסטים מרובי גרעינים צריכים להופיע בין הימים השלישי לרביעי של התרבית. כדי להעריך את הגודל והמורפולוגיה של האוסטיאוקלסטים החדשים שהתמיינו, צבעו את התאים בחומצה פוספטאז עמידה לטרטרט, על פי הוראות היצרן ודמו את כל פני השטח של כל באר ברזולוציה מספקת להבחנה בין גרעיני התאים.

לאחר שכל הבארות צולמו, פתח תמונה של באר אחת עם תוכנת קוד פתוח ImageJ ואמת את יחידות קנה המידה. לאחר מכן סמן את התיבה גלובלית בחלון המוקפץ כדי להחיל את יחידות קנה המידה החדשות על כל התמונות המאוחרות יותר. בתפריט ניתוח, בחר הגדר מידות וסמן את התיבות אזור ותצוגה של תווית.

בטל את הסימון של כל התיבות האחרות. תחת תפריט ניתוח, פתח את כלים ולאחר מכן את מנהל אזור העניין ובחר את כלי הבחירה המלבני בחלון הראשי של ImageJ. תאר אזור עניין של כ- 1,000 על 1,000 מיקרומטר ולחץ על לחצן הוסף כדי להוסיף את הבחירה למנהל אזור העניין.

לאחר מכן לחץ על עוד, שמור כדי לשמור את האזור. כדי ליצור עותק של אחד מחמשת האזורים שיש לנתח, בחר את אזור העניין במנהל אזור העניין ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בתוך האזור שנבחר כדי לשכפל את האזור. סמן את התיבות הצג הכל ותוויות ובחר בכלי בחירת המצולע כדי לתאר ידנית את אחד האוסטיאוקלסטים באזור העניין המשוכפל.

כדי להוסיף חלוקה לרמות זו למנהל אזור העניין, לחץ על הוסף בחלון מנהל אזור העניין. לאחר הוספת כל האוסטיאוקלסטים, בחר את כל קווי המתאר ולחץ על מדידה כדי למדוד את פני השטח שלהם. לאחר מכן העבירו את המידות שמופיעות בחלון התוצאות לגיליון אלקטרוני.

כדי להעריך את תפקודם של אוסטאוקלסטים שטופלו בשתן, יום אחד לפני הוספת מדיום ההתמיינות, צלחו תאי RAW מתרבית תאים קונפלואנט של 85 עד 90% על צלחת בדיקת אוסטאו-24 בארות במדיום הגידול, כפי שהודגם זה עתה. למחרת, החליפו בעדינות את הסופרנטנט במדיום המכיל משתנה התמיינות ואפשרו לתאי ה-RAW להתמיין לאוסטאוקלסטים, כפי שהודגם זה עתה. ביום החמישי של אוסטאוקלסטוגנזה, החלף את המדיום המכיל משתנה בתמיסת אקונומיקה של 10% כדי להסיר את התאים מהמשטח המימטי של העצם.

לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, שטפו את הבארות פעמיים במים נטולי יונים ותנו להן להתייבש באוויר. לאחר מכן, צבעו את מלחי הסידן באזורים הלא נספגים של כל באר בתמיסת מלח נתרן 1% Alizarin Red S. לאחר 10 עד 15 שניות, הסר את תמיסת האליזרין ושטוף בעדינות את הבארות שלוש עד ארבע פעמים במים.

כדי להמיר תמונת RGB של הבארות המוכתמות באליזרין לתבנית של 8 סיביות בגווני אפור, בתפריט תמונה, בחר סוג ו- 8 סיביות. לאחר מכן, באמצעות כלי הבחירה הסגלגלה, שרטט את כל פני השטח של הבאר לניתוח לספיגה ושמור את אזור העניין, כפי שהודגם זה עתה. כדי להקל על בחירת הסף, בחר Edit ו-Clear Outside כדי לנקות את כל התכונות מחוץ לאזור העניין שהוגדר.

שכפל את אזור העניין כפי שהודגם זה עתה ובחר Adjust Threshold בתפריט Image, והתאם את סרגל ההחלקה כדי לבחור סף מתאים. כל האזורים הנספגים צריכים להיות מעל הסף ולהיראות לבנים, ואילו כל האזורים שאינם נספגים צריכים להיות מתחת לסף ולהופיע באדום. כדי להשלים את בחירת הסף, לחץ על החל בחלון סף ושמור את התמונה הבינארית הסופית בתבנית המתאימה לעניין.

כדי להגדיר את המדידות שיש לבצע באזור העניין, בתפריט Analyze, בחר Set Measurements וסמן את התיבות Area, Area Fraction ו-Limit to Threshold ובטל את הסימון של כל התיבות האחרות. לאחר מכן, כדי להשיג את השבר של האזור הנספג ישירות בתוך חלון התוצאות, הפוך את התמונה הבינארית המשוכפלת על ידי בחירה בהפוך תחת תפריט עריכה והקפדה על כך שאזור העניין העיקרי ייבחר בתמונה הבינארית הסופית ולמדוד את שבר השטח הנספג מחדש. השינויים במספרם וגודלם של אוסטאוקלסטים חדשים בתגובה לאורניום נראים בקלות בתמונות מורכבות של בארות שלמות, כמו גם בתמונות מוגדלות של אזורי עניין נבחרים.

ניתן לנתח את גודל האוסטיאוקלסטים הגדלים בתנאי תרבית שונים כפי שהודגם זה עתה על ידי תיאור כל האוסטיאוקלסטים בכל אזור ומדידת השטח של כל תא מתואר. כדי לחקור את השפעת האורניום על פעילות ספיגת האוסטיאוקלסט, תאי RAW 264.7 מצופים ומתמיינים על לוחות משטח מחקים אוסטאו. בתום הבדיקה, מסירים את האוסטיאוקלסטים והאזורים שאינם נספגים מוכתמים ומצולמים כפי שהודגם.

לאחר מכן התמונות עוברות המרה לגווני אפור של 8 סיביות וסף כדי להקל על חישוב האזורים הנספגים. ניתן ליישם הליך זה גם לחקר ההשפעה של מתכות כבדות אחרות על אוסטאוקלסטוגנזה.