Name: סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: למדו לנתח שונות במספר עותקי DNA בסרום או פלזמה באמצעות PCR בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת לחזות עמידות לתרופות בסרטן הערמונית עמיד לסירוס וליישומים קליניים נוספים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מולינרי קיארה, פיליפו Martignano על תמיכה בניתוח נתונים.

הפרוטוקול מורכב הבידוד של דנ א מן הדוגמאות סרום או פלזמה לבצע PCR בזמן אמת לצורך ניתוח מספר עותק. הפקת דנ א, בקרת כמות ה-DNA (ספקטרופוטומטרים) ו- PCR בזמן אמת עבור מטרות ספציפיות בוצעו. איור 1, תקציר של נהלים, קו זמן מדווחים.
הפרוטוקול מנחים את ועדת אתיקה במחקר IRST אנושי.
1. סרום איסוף ועיבוד
<ol>
	<li>לאסוף כ מ ל דם בצינור סרום ללא קרישה כדי לקבל סרום. לשמור על צינורות הדם ב 4 ° C עד עיבוד.</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות ב 1,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>להעביר בזהירות סרום לתוך צינורות 2 מ"ל.</li>
	<li>למחוק את הצינור איסוף ומקפיאים מיד את תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
</ol>
2. פלזמה איסוף ועיבוד
<ol>
	<li>לאסוף כ 10 מ ל דם בצינור פלזמה עם EDTA להשיג פלזמה. ממלאים את הצינור לחלוטין, ואז היפוך זה 8 פעמים. לשמור על צינורות הדם ב 4 ° C עד עיבוד.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור ב g x 1,800 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם אין ההגדרה בלם לצנטריפוגה.</li>
	<li>להעביר בזהירות את החלק העליון של הפלזמה לתוך צינורות 2 מ"ל. חזור על ההעברה, משאיר לפחות 1 מ"ל של תגובת שיקוע מעל שכבת תאים לבנים. הערה: העברת החלק העליון של תגובת שיקוע מפחיתה את הסיכון של זיהום על ידי תאים או שאריות תאים.</li>
	<li>למחוק את הצינור איסוף ומקפיאים מיד את תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
</ol>
3. דנ א בידוד סרום או פלזמה
הערה: בידוד של דנ א סרום או פלזמה צריכה להתבצע באמצעות פרוטוקול מסחרי שונה בשלבים הבאים.
<ol>
	<li>הפשרת aliquot אחד (המכיל מ- 0.5 עד 2 מ"ל) של סרום או פלזמה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מערבולת, לערבב המדגם ולהעביר 0.5 מ"ל של סרום או פלזמה לתוך צינור נקי mL 1.5. להקפיא את שאר חומר ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של proteinase k (20 מ"ג/מ"ל) ישירות הדגימה.</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ של פירוק מאגר המדגם ומערבבים היטב על ידי pipetting.</li>
	<li>סגור את הצינורות, דגירה דגימות ב 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות גוש חום.</li>
	<li>להוסיף הסכום המצוין של 100% אתנול מאגר שטיפת 1 ו- 2, כפי שמציין הוראות היצרן.</li>
	<li>להחזיר את הדגימות בטמפרטורת החדר, להוסיף 0.5 מ"ל אתנול מוחלטת ולערבב היטב על ידי pipetting.</li>
	<li>הוסף µL 650 של תערובת שהושג בשלב 3.7 ההפרדה עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.</li>
	<li>למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ומניחים את העמודה על צינור נקי אוסף חדש. חזור על שלבים 3.8 ו- 3.9 עוד פעם אחת.</li>
	<li>להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 1, בלי להרטיב את החישוק של עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.</li>
	<li>למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ולהחליף אותו עם צינור נקי אוסף חדש.</li>
	<li>להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 2, בלי להרטיב את החישוק של עמודה, צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) למשך 3 דקות.</li>
	<li>למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ולהחליף אותו עם צינור נקי אוסף חדש.</li>
	<li>צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) למשך 3 דקות להסיר את כל מאגר כביסה שיורית.</li>
	<li>מקם את העמודה לתוך צינור נקי mL 1.5. להוסיף 150 µL • תנאי מאגר והמתן 7 דקות כדי להבטיח שאת המאגר מרטיב את העמודה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 8000 g x עבור 1 דקות.</li>
	<li>Pipette את elute מהשלב 3.16 שוב לתוך באותה עמודה צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) עבור 1 דקות להבטיח מקסימלית התאוששות של ה-DNA.</li>
</ol>
4. DNA כמת, דילול
<ol>
	<li>לבצע כימות של הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. השתמש µL 2 מדגם ספקטרופוטומטרים ספסל-העליון לפי הוראות היצרן. הערה: אם הכמות הדנ א אינה מספיקה להמשיך עם ה-PCR בזמן אמת (לפחות 120 ng), לבצע תהליך חדש של בידוד ה-DNA.</li>
	<li>לדלל DNA סרום או פלזמה כדי 2.5 ng/µL באמצעי הסופי אחסון מספיק עבור PCR הכל בזמן אמת (כ 50 µL).</li>
</ol>
5. PCR בזמן אמת
<ol>
	<li>הפשרה עותק מספר מבחני התייחסות ג'ין assay, דגימות די אן איי מדולל, כיילים איחדו בקרח. Equilibrate בטמפרטורת החדר המיקס ראשי המאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להכין תערובת של 1 µL של היעד assay, µL 1 של הפניה ג'ין assay 10 µL של מיקס מאסטר 3 ושכפול של כל כיילים איחדו ולדגום. מכינים את תערובת כולל פקד שלילי (מים) ודוגמאות נוספות 2.</li>
	<li>ב- 96 טוב בצלחת, aliquot 12 µL של המיקס כל טוב. האם לא צינורות פיפטה או ספין.</li>
	<li>הוסף 8 µL (ריכוז של 2.5 ng/µL) של כל. דנ א ו כיילים איחדו לבאר כל. האם לא צינורות פיפטה או ספין. לשנות את המידע עבור כל טוב. הערה: דגימות די אן איי 30 ניתן לעבד עבור כל הניסוי בזמן אמת באמצעות הלוח 96-ובכן: 30 x 3 דוגמאות + שליטה במאגר + שלילי כיילים 1 x 3 = 94.</li>
	<li>בקצרה ספין למטה הצלחת ב 1,000 x g.</li>
	<li>הפעל את הצלחת באמצעות פרוטוקול הבאים: להחזיק הבמה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורי ב 95 ° C 15 s, ו- 60 ° C עבור 1 דקות.</li>
</ol>
6. נתונים ניתוח ופרשנות
<ol>
	<li>בסעיף "אפשרות", להלן התוצאות מגרש הגברה, לקבוע סף Ct 0.2 עבור הגן היעד הראשון מנותח. חזור על הסט עבור כל הגנים היעד או הפניה. כדי לייצא את הקובץ ה-PCR בזמן אמת בסיומת. txt, לחץ "לייצא" לתוך הכלים. דגל רק "תוצאות" בחר נתונים לייצא ← בחר כסוג קובץ סיומת. txt ← לחץ "התחל ייצוא" ← קרוב בכלי ייצוא.</li>
	<li>פתח את תוכנת ניתוח, לייבא את קובץ. txt (סרגל כלים ← ייבוא).</li>
	<li>בחר את שם הקובץ כדי לנתח ולבחור את הגדרת ניתוח באמצעות סרגל הכלים (סמל משחק).</li>
	<li>לציין את הדגימה כיל ידוע מספר העותקים של המטרה (למשל, 1 עותק עבור AR ג'ין). לחץ על "החל".</li>
	<li>עבור כל דגימה, להשמיט באר אחת עם דלתא שונים Ct (ΔCt) בהשוואה םש.</li>
	<li>לנתח מחדש את הניסוי (הקש הפעל סמל).</li>
	<li>הערכת התוצאות לפי מספר עותק בר מגרש או הטבלה. הערה: טבלת התוצאות מכילה פרמטרים רבים כמו ביטחון, Z-ציון משכפל מנותח זה יכול להיות שימושי עבור תוצאות פרשנות.</li>
</ol>

<ol><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer%3A+current+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li>
<li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li>
<li>Diaz, L. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li>
<li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer%3A+a+multi-institution+correlative+biomarker+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li>
<li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer%3A+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li>
<li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples%3A+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li>
<li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

AR ניתוח CN סרום ופלסמה מדגם מייצג גישה חדשה, לא פולשנית עבור השיכוב סירוס עמיד חולי סרטן הערמונית (CRPC). זה לאחרונה הוכח כי AR CN הוא מסוגל לחזות תוצאות CRPC חולים שטופלו abiraterone, enzalutamide, לפני ואחרי כימותרפיה7,8,9,10.
היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא שהפרוטוקול הוא פשוט מאוד לביצוע, המורכב רק בתהליך בידוד של דנ א, ניתוח ה-PCR בזמן אמת אחת...

במחזור התא DNA חופשי (cfDNA) בדם הוכח להיות מקור אופטימלי של סמנים אבחון סרטן, הפרוגנוזה, ניטור של חיזוי של טיפול ההתנגדות1,2. מחקרים רבים הוכיחו קונקורדנציה טוב בין DNA השינויים (מוטציות, העתק מספר וריאציות, שינויים epigenetic ברקמות) ואלה נמצאו המתאימים פלזמה דגימות1, המאשר כי במחזור הגידול דנ א (ctDNA) הוא אינפורמטיבי עבור שינויים רקמת הגידול העיקרי ולא גרורתי3. האפשרות של הלומדים ctDNA ובכך מאפשר את שיקומה של rearrangements גנומית, העתק מספר וריאציות (CNVs) oncogenes ספציפית4, זיהוי פוטנציאל גרורתי תאים המשובטים ו- subclonal. CtDNA הוכח כיעיל קלינית. במיוחד עבור סרטן טיפול ניטור כמו זה בנמלים מוטציות ספציפיות, CNVs, הקשורים ספציפית טיפולים ממוקדים5,6. גם הוא מתגבר על הצורך ביופסיות רקמות ומאפשר את תוצאות ניתן להשיג במועדים שונים במהלך טיפול בסרטן ספציפי בצורה לא פולשנית.
לגבי סרטן הערמונית, מובהק בין מחזורי ללא תא אנדרוגן קולטן (AR) CNVs וטיפול בתגובה abiraterone, enzalutamide הוכח, כמסמן AR ג'ין עותק מספר (CN) ב- cfDNA יכול להיות סמן המבטיחים יכולת חיזוי טיפול ההתנגדות7,8,9,10,11. CNVs של גנים ספציפיים ב- ctDNA ניתן להעריך באמצעות גישות שונות עם רגישות שונה, עלות במהירות (למשל-PCR בזמן אמת, דיגיטלי, קביעת רצף הדור הבא).
כאן נתאר בגישה פשוטה ומהירה, על סמך מבחני דופלקס בטכנולוגיית ה-PCR בזמן אמת, להערכת CN AR ב- cfDNA מסרום ופלסמה דגימות7,8. שקלנו שני מבחני ה-PCR שונה תוכנן על שני אזורים גנומית שונים בתוך אינטרון 5 של AR (Xq12), שני גנים אחרים, כמו גנים התייחסות תקן פנימי ידוע יש מצב מספר עותק נורמלי סרטן הערמונית (RNaseP, ממוקם על 14q11; לפני1, מלון ב 1 p 34). בחרנו גנים התייחסות שני, במקום אחד, כדי להגביר את הדיוק ואת הרגישות של התוצאות. כמות ה-DNA של 60 ng היה מוגבר עבור כל שילוב assay (assay משולב עבור AR-assay_1 + RNaseP , AR-assay_2 + AGO1). שלושה סרום או פלזמה דגימות דנ א גברים בריאים היו איחדו ומשמש כיל. שקלנו המכנסונים של &#62; 1.5 לרווח AR , &#60; 0.5 למחיקה. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא כי הוא גמיש וכי כי גנים אחרים גם ניתן להעריך, שינוי הגנים להפניה פנימית רגילה, על בסיס סוג הגידול ומאפיינים.

<table><tbody><tr><td>צינורות סרום BD Vacutainer</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>367814 צינור דם מלא לסרום</td></tr><tr><td>BD Vacutainer EDTA Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>צינור דם מלא לפלזמה</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>VWR</td><td></td><td>המשתמש יכול להשתמש גם בחברות אחרות</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4400291</td><td>בדיקות מתוכננות מראש ומאומתות עם צבע FAM. השתמשנו בבדיקה הבאה: AR_assay1: hs04107225 ו-AR_assay2: hs04511283</td></tr><tr><td>TaqMan מבחן מספר עותק (שונה)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4467084</td><td>מבחן שתוכנן מראש שונה עם VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4403326</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4326708</td><td>תערובת מאסטר לערכת מיני מיני PCR</td></tr><tr><td>QIAamp DNA בזמן אמת (50)</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>ערכת מיצוי DNA</td></tr><tr><td>MicroAmp 96-Well צלחות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td>לזמן אמת PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Fisher Scientific-המשתמש</td><td></td> <td>יכול להשתמש גם בשיטות ספקטרופוטומטריות אחרות כדי לכמת</td></tr><tr><td>DNA 7500 מערכת</td> <td>PCR מהירה בזמן אמתApplied Biosystem-המשתמש</td><td></td> <td>יכול להשתמש גם במכשיר אחר בזמן אמת</td></tr><tr><td>CopyCaller Software Applied</td><td>Biosystem-Software</td><td></td> <td>לניתוח מספרי עותקים</td></tr></tbody></table>

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות pcr בזמן אמת

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

סרום ותא פלזמה DNA חופשי (cfDNA) הוכח כמקור אינפורמטיבי, לא פולשנית של סמנים אבחון סרטן, הפרוגנוזה, ניטור של חיזוי של עמידות לטיפול. החל מההיפותזה אנדרוגן קולטן (AR) ג'ין עותק מספר (CN) לזכות הינו אירוע תכופים סירוס גרורתי עמידות סרטן הערמונית (mCRPC), אנו מציעים לנתח אירוע זה ב- cfDNA כמו סמן ניבוי פוטנציאליים.
אנחנו הערכה CN AR ב- cfDNA באמצעות 2 מבחני ה-PCR שונים בזמן אמת ו- 2 גנים התייחסות (RNaseP לפני1). כמות ה-DNA של 60 ng שימש עבור כל שילוב וזמינותו. AR CN רווח אושר באמצעות PCR דיגיטלית כמו שיטה מדויקת יותר. CN וריאציה ניתוח כבר הוכח כדי להיות אינפורמטיבי לחיזוי ההתנגדות טיפול בסביבה של mCRPC, אבל זה יכול להיות שימושי גם למטרות אחרות בהגדרות שונות של המטופל. CN ניתוח על cfDNA יש כמה יתרונות: זה לא פולשנית, מהירה וקלה לביצוע, זה מתחיל מאמצעי אחסון קטן של חומר סרום או פלסמה.

CfDNA הכולל ריכוז היה לכימות באמצעות ספקטרופוטומטר עבור כל הדגימות ניתח, מציג החציוני של 6.12 ng/µL (טווח: 2.00-23.71 ng/µL) ועבור הדוגמאות סרום החציוני של 3.21 ng/µL (טווח: 2.31-8.49 ng/µL) עבור דגימות פלסמה. ניתחנו את סך של דגימות 115 על ידי ניסויים PCR בזמן אמת.
מבחן רגישות הוערכה באמצעות DNA סרום מעורב מחולים עם רווח גבוה או נמוך עבור AR, ו- DNA מתורמים מאוד בריאים, אשר משמשים גם כיל דוגמאות לניתוח מספר עותק. כפי שמ...

כתב יד זה מתאר את עותק מספר וריאציה ניתוח שבוצעה ב- DNA סרום או פלסמה, באמצעות גישה PCR בזמן אמת. שיטה זו מתאימה נבואתו של עמידות לתרופות בחולי סרטן הערמונית עמיד סירוס, אבל זה יכול להיות אינפורמטיבי גם למחלות אחרות.

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לזהות את השונות במספר עותקי הגן בדגימות סרום או פלזמה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סרטן הערמונית המתקדם כגון זיהוי סמנים שימושיים לחיזוי או ניטור הפחתת הנבגים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה ומהירה לביצוע. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסרטן ערמונית מתקדם מכיוון ששונות במספר העותקים של הגן של קולטן אנדרוגן היא אירוע שכיח. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהריכוז והאיכות של DNA נטול תאים לרוב נמוכים מהצפוי. לאיסוף סרום, יש לעבוד מדגימות של חמישה מיליליטר של דם מלא וסרום ללא נוגדי קרישה שנשמרו על ארבע מעלות צלזיוס.התחל בצנטריפוגה של הדגימות למשך 15 דקות ב-1,000 גרם.הסופרנטנט הוא הסרום. העבירו אותו לצינורות של שני מיליליטר והשליכו את הגלולה. אלא אם כן הסרום מעובד מיד, הקפיאו את הדגימות ב-80

serum-and-plasma-copy-number-detection-using-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי עם או בלי הגברה מראש. פרוטוקול זה מאפשר הבנה טובה יותר של כמות פלזמה miRNAs ומאפשר הערכה איכותית של נתונים התואמים מחקרים שונים או מעבדות.

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

כתב היד מתאר מבוססי שבב דיגיטלי PCR assay לזהות נדיר CDH1 התעתיק variant (CDH1a) רגילה מוקפאות ורקמות הגידול המתקבל בחולים עם סרטן קיבה.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי מוחלט (mt)DNA ורמות הטרופלזמה של מחיקת mtDNA בתאים בודדים.

מדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז

פרוטוקול זה מאפשר לחשוף את ההשפעה של פרופג'ים על המארחים שלהם. תרביות חיידקים מסונכרנות באמצעות תנאים התומכים בצורה הטובה ביותר במצב הליזוגני, ומגבילים את ההשראה הספונטנית. RT-qPCR מבדיל באופן חד-משמעי בין גנים מוגבלים לפאגים לבין אלה שאינם מצומדים מבקרת פאגים לבין אלה המתבטאים במהלך מחזור השכפול הליטי.

הבנת ההשפעה של בקטריופאג'ים ממוזגים על הליזוגנים שלהם באמצעות שעתוק

כתב יד זה מתאר שיטה לזיהוי מוטציות בתדר נמוך ב- ctDNA, אר-תת סעיף. בשיטה זו הוא הבדיל על ידי השימוש הייחודי של תיקון שגיאות דו כיווני, רקע מיוחד המסנן, וכן הקניית מולקולרית יעיל.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

נתאר כאן פרוטוקול לחקור cytotoxicity של טרום הופעל CD8+ T תאים נגד תאים סרטניים על ידי גילוי אפופטוטיים להיפגע סרטן תאים באמצעות בזמן אמת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה יכול לחקור מנגנונים מאחורי מיאלואידית הנוצרות על-ידי תאי T cell דיכוי והערכת תרכובות שמטרתה חידוש תאי T באמצעות המצור של תאים חיסוניים מיאלואידית מדכאים.

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

למדו לנתח שונות במספר עותקי DNA בסרום או פלזמה באמצעות PCR בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת לחזות עמידות לתרופות בסרטן הערמונית עמיד לסירוס וליישומים קליניים נוספים.

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

גלה סרטונים נוספים