וזמינותו אוטומטית מהירה Geotaxis שלילי איטרטיבי לניתוח התנהגות טיפוס למבוגרים מודל דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים

המטרה הכוללת של בדיקת גיאוטקסיס שלילית איטרטיבית מהירה ואוטומטית זו היא לנתח ליקויים בטיפוס מבוגרים של דרוזופילה הקשורים לניוון עצבי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כגון המנגנון של ליקויים בקטרים הקשורים לניוון עצבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח פעילות טיפוס זבובים במקצוע אוטומטי והוכחה גבוהה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול והאבחון של ניוון עצבי, מכיוון שמחלות נוירודגנרטיביות קשורות לעתים קרובות לאובדן מתקדם של יכולת התנועה ולהפחתת תוחלת החיים וניוון עצבי תלוי גיל. לראשונה עלה לנו הרעיון לשיטה זו. רצינו למדוד את פעילות הקטר של דרוזופילה למבוגרים בצורה מדויקת יותר.

כדי לבצע איסוף זבובים, התחל בשמירה על הזבובים על מזון זבובים סטנדרטי ב-25 מעלות צלזיוס, 70% לחות ועד 12 שעות אור, מחזור חושך של 12 שעות. אסוף בתולות זבוב UAS-Dicer2 DDC-GAL4 בהרדמת פחמן דו חמצני. הכלאה של הבתולות לזבובים זכרים בוגרים בני יומיים הנושאים את הגנוטיפים הבאים, עם יחס זכר/נקבה של אחד לשניים.

אספו בנפרד זכרים ונקבות שנסגרו לאחרונה בשלושה בקבוקונים לכל קבוצה בכל ניסוי, והניחו 10 זבובים בכל בקבוקון זבוב רגיל עם מזון סטנדרטי. לאחר מכן הגדר את הבקבוקונים ל-25 מעלות צלזיוס. כדי לבצע את בדיקת ה-RING האוטומטית, העבירו 10 זבובים חד-מיניים שנאספו לכל גנוטיפ לכל בקבוקון.

ואז אבטח את הבקבוקון בעזרת בורג. נתח זבובי ביקורת וזבובים הנושאים גנוטיפים שונים יחד עבור כל סדרת ניסויים. הפעל את המצלמה הדיגיטלית המוצבת מול המכשיר, וברגע שהזבובים נטענים ומוכנים, התחל להקליט.

יש למקם את המצלמה בצורה אופקית ואת המצלמה במרחק מתאים ממכשיר ה-RING כדי ללכוד את המיקומים במיקומים מדויקים יחסית של כל הזבובים. לאחר שאפשרתם דקה אחת לזבובים להתיישב בבקבוקונים, הפעילו את בקר הצעדים השולט בנהג הצעד. זה מניע את המנוע החשמלי הקטן לשלוט בידית המצורפת, כך שהוא עולה ברציפות ומקיש על המכשיר ארבע פעמים תוך שתי שניות.

לאחר הקשה על המנגנון, שימו לב שהזבובים מתחילים לעלות על הקיר. כשההקלטה עדיין פועלת, חזור על הסנכרון כפי שהודגם זה עתה, במרווחים של 60 שניות במשך שלושה עד חמישה ניסיונות רצופים. חזור על הניסוי עבור זבובים בני חמישה, 15, 25 ו-35 יום.

ערכו לפחות שלושה ניסויים עצמאיים לכל קבוצה עבור כל ניסוי, עם לפחות 30 זבובים שנאספו או שלושה בקבוקונים. כדי לנתח את הנתונים, ייבא את הווידאו המוקלט למחשב. עבור כל ניסוי, צלם תמונה של הסרטון בשש שניות לאחר ההקשה.

בתוכנה לזיהוי זבובי R, השתמש בתפריט file כדי לייבא את תמונת התמונה. לאחר מכן, באמצעות סמל קו הבסיס בסרגל הכלים, הגדר במדויק את קווי הבסיס העליונים והתחתונים של הבקבוקון ולאחר מכן השתמש בסמן כדי לסמן את קווי הבסיס העליונים והתחתונים בתמונה. בתוך סרגל ההגדרות, בשדה זבובים ב-Rect, הזן את מספר הזבובים לכל בקבוקון, ובשדה גובה הצינור, הזן את אורך הבקבוקון.

מיקומי זבוב בודדים מזוהים ומסומנים בנקודות על המסך עבור כל בקבוקון. שימו לב שבטבלה בלוח הימני, התוכנה קובעת אוטומטית את מרחק הטיפוס של כל זבוב ומציגה את הערכים הממוצעים של 10 זבובים בכל בקבוקון. הצג את הנתונים כממוצע פלוס או מינוס SEM.

חשב את ערכי ה-P של המובהקות באמצעות ANOVA חד-כיווני עם מבחן השוואה מרובה של Bonferroni. ניתוח של זבובים ייעודיים של Dicer2 באמצעות בדיקת RING האוטומטית המוצגת בסרטון זה הראה ירידה תלוית גיל במרחק הטיפוס במסגרת זמן של שש שניות עבור זבובים זכרים ונקבות כאחד, מה שמצביע על כך שביטוי aux בנוירונים דופמינרגיים או DA הוא חיוני לפעילות תנועתית זבובים. נראה כי יכולת הטיפוס אינה מושפעת מביטוי יתר של auxGFP בנוירוני DA וביטוי משותף של auxR ו-auxGFP בתאי עצב DA שחולצו מפנוטיפ RNAi.

לאחר השליטה, ניתן לעשות זאת תוך שעתיים-שלוש אם זה מבוצע כראוי. פיתוח זה הוא כעת דרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור ניוון עצבי בדרוזופילה מלנוגסטר. אל תשכח שעבודה עם מכשירי RING חשמליים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להדק כל אישור בחוזקה ולבדוק בזהירות לפני ביצוע הליך זה.