וזמינותו אוטומטית מהירה Geotaxis שלילי איטרטיבי לניתוח התנהגות טיפוס למבוגרים מודל דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים
12 בספטמבר 2017
פרוטוקול שלב אחר שלב זה מנתח התנהגות שלילית geotaxis דרוזופילה באמצעות מערכת אוטומטית צילינדר רב מארח מאות זבובים ומסנכרן פעולתם על ידי מנוע חשמלי. בעת סינכרון, התנהגות לטוס geotaxis שלילי זה לבדיקה, דיגיטלית המוקלט ולאחר שנותחה שימוש בתוכנת RflyDetection בעיצוב עצמי.
המטרה הכוללת של מבחן הגאוטקסיס השלילי המהיר והאוטומטי הזה היא לנתח את הגירעונות בטיפוס של דרוזופילה בוגרת הקשורים לניוון עצבי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מרכזיות בתחום מדעי המוח כמו מנגנון הגירעונות הלוקומוטוריים הקשורים לניוון עצבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח את פעילות הטיפוס של הזבובים בצורה אוטומטית ומקצועית ברמת הוכחה גבוהה.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול ואבחון של ניוון עצבי, מכיוון שמחלות ניוון עצבי קשורות לעתים קרובות לאובדן הדרגתי של יכולת תנועה ותוחלת חיים מופחתת וניוון עצבי תלוי גיל. תחילה היתה לנו את הרעיון לשיטה זו. רצינו למדוד את פעילות הלוקומוטורית של דרוזופילה בוגרת בצורה מדויקת יותר.
כדי לבצע איסוף זבובים, התחל בשמירת הזבובים על מזון זבובים סטנדרטי ב 25 מעלות צלזיוס, לחות 70% ו 12 שעות אור, 12 שעות חושך מחזור. אסוף זבובות אוורג'יניות UAS-Dicer2 DDC-GAL4 תחת הרדמה בפחמן דו-חמצני. הצלב את הבתולות עם זכרים בוגרים בני יומיים הנושאים את הגנוטיפים הבאים, עם יחס זכר/נקבה של אחד לשניים.
לאסוף בנפרד זכרים ונקבות שנפתחו לאחרונה בשלושה צלוחיות לכל קבוצה לכל ניסוי, תוך הנחת 10 זבובים בכל צלוחית זבובים רגילה עם מזון סטנדרטי. לאחר מכן הגדר את הצלוחיות ל 25 מעלות צלזיוס. כדי לבצע את מבחן RING האוטומטי, העבר 10 זבובים אוניסקס לפי גנוטיפ לכל צלוחית.
לאחר מכן אבטח את הצלוחית בעזרת בורג. נתח את הזבובים הבקרה ואת הזבובים הנושאים גנוטיפים שונים יחד עבור כל סט ניסויים. הפעל את המצלמה הדיגיטלית הממוקמת מול המנגנון, וברגע שהזבובים נטענים ומוכנים, התחל להקליט.
יש להציב את המצלמה באופן אופקי והמצלמה במרחק מתאים ממנגנון RING כדי ללכוד את המיקום במיקום יחסית מדויק של כל הזבובים. לאחר שאפשר לזבובים דקה להתיישב בצלוחיות, הפעל את בקר השלבים ששולט בבקר השלבים. זה מניע את המנוע החשמלי הקטן כדי לשלוט על הידית המחוברת, כך שהוא עולה ברצף ודוקר את המנגנון ארבע פעמים בשתי שניות.
לאחר דקירת המנגנון, שים לב שהזבובים מתחילים לעלות על הקיר. עם ההקלטה שעדיין דלוקה, חזור על הסינכרון כפי שהוצג זה עתה, במרווחים של 60 שניות במשך שלוש עד חמש ניסיונות רצופים. חזור על הניסוי עבור זבובים בני חמש, 15, 25 ו 35 יום.
בצע לפחות שלושה ניסויים עצמאיים עבור כל קבוצה עבור כל ניסוי, עם לפחות 30 זבובים שנאספו או שלוש צלוחיות. כדי לנתח את הנתונים, ייבוא את הוידאו שהוקלט למחשב. עבור כל ניסיון, קח תמונת מסך של הוידאו שש שניות לאחר הדקירות.
בתוכנת גילוי R-fly, השתמש בתפריט הקובץ כדי לייבא את תמונת התמונה. לאחר מכן, באמצעות סמל הקו היסוד בסרגל הכלים, קבע במדויק את קווי הבסיס העליונים והתחתונים של הצלוחית ולאחר מכן השתמש בסמן כדי לסמן את קווי הבסיס העליונים והתחתונים בתמונה. בתוך סרגל ההגדרות, בשדה זבובים ברקטנגל, הזן את מספר הזבובים לכל צלוחית, ובשדה גובה הצינור, הזן את אורך הצלוחית.
מיקומי זבובים בודדים מזוהים ומסומנים עם נקודות על המסך עבור כל צלוחית. שים לב שבטבלה שנמצאת בלוח הימני, התוכנה קובעת אוטומטית את מרחק הטיפוס עבור כל זבוב ומציגה את הערכים הממוצעים מ 10 זבובים בכל צלוחית. הצג את הנתונים כממוצע פלוס מינוס SEM.
חשב את ערכי ה-P של המשמעות באמצעות ANOVA חד-כיווני עם בדיקת השוואה מרובה של בונפררוני. ניתוח של זבובים שמועדים ל-Dicer2 באמצעות מבחן RING האוטומטי שהוצג בוידאו זה הראה ירידה תלוית גיל במרחק הטיפוס באורך של שש שניות הן עבור זכרים והן עבור נ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה אוטומטית לניתוח התנהגות גיאוטקסיס שלילית ב-Drosophila, תוך התמקדות בליקויי טיפוס בבוגרים הקשורים לניוודה-דגנרציה. הטכניקה משתמשת במערכת רב-גלילית לסנכרון והקלטה של תנועות הזבובים, ובכך מספקת תובנות לגבי ליקויים לוקומוטוריים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצב
- ניתוח התנהגותי
- ניורודגנרציה
רקע
- Drosophila משמשת כאורגניזם מודל לחקר מחלות נוירודגנרטיביות.
- התנהגות גאוטקסיס שלילית היא מדד ליכולת תנועה בזבובים.
- נוירודגנרציה מובילה לעיתים קרובות לאובדן פרוגרסיבי של התנועתיות ולקיצור תוחלת החיים.
- מערכות אוטומטיות משפרות את הדיוק של בדיקות התנהגותיות.
מטרת המחקר
- לניתוח פגמים בטיפוס ב-Drosophila הקשורים לניוורודגנרציה.
- לבחינת המנגנונים העומדים בבסיס פגמים לוקומוטוריים.
- לשיפור דיוק המדידה של הפעילות הלוקומוטורית של הזבוב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מערכת רב-גלילית אוטומטית לתנועה מסונכרנת של זבובים.
- הקלטה דיגיטלית של התנהגות גיאוטקסיס שלילי.
- ניתוח באמצעות תוכנת RflyDetection בעיצוב עצמי.
- בדיקה איטרטיבית מהירה לאיסוף נתונים בסביבה של תפוקה גבוהה.
תוצאות עיקריות
- סנכרון מוצלח של תנועות הזבובים לצורך ניתוח מדויק.
- זיהוי פגמים בטיפוס הקשורים לניורודגנרציה.
- ניתוח אוטומטי שהוכח כיעיל ואמין.
- השלכות פוטנציאליות לטיפול ואבחנה של מחלות ניורודגנרטיביות.
מסקנות
- הבדיקה האוטומטית מספקת שיטה חסונה לחקר התנהגות מוטורית ב-Drosophila.
- התובנות שיירכשו עשויות להנחות גישות טיפוליות לניוון עצבי.
- טכניקה זו משפרת את ההבנה של הקשר בין תנועה לבין מצבים של ניוון עצבי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
בדיקה אוטומטית זו בעלת תפוקה גבוהה מאפשרת כימות מהיר של ליקויים לוקומטוריים במודלים של Drosophila לניוון עצבי, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים באמצעות אספקת מדדים התנהגותיים אובייקטיביים וניתנים לשחזור. השיטה מגבירה את רמת הוודאות החיזוית בסינון פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח סימולטני של מאות זבובים על פני מספר גנוטיפים וקבוצות גיל, מה שמקל על הערכה יעילה של תרכובות או מודיפיקטורים גנטיים. שילובה בתהליכי הגילוי מסייע להפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות לניוון עצבי באמצעות פנוטיפינג סטנדרטי וניתן להרחבה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של פגמים בטיפוס התלויים בגיל, הקשורים לניוון עצבי במודלים גנטיים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדידה בסביבות תפוקה גבוהה של פעילות מוטורית כמדד לשלמות עצבית.
- ערך ניבוי: מייצר נתונים התנהגותיים כמותיים התומכים במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי גנוטיפים עם ליקוי מוטורי משמעותי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר מדדי גיאוטקסיס שלילית סטנדרטיים וניתנים לשחזור, המתאימים לתיקוף בדיקות במסגרת קמפיינים של סריקה הממוקדים בניווניות עצבית.
- ערך תפעולי: מאפשר סריקה מהירה של מודיפיקטורים גנטיים או פרמקולוגיים באמצעות לכידת וידאו אוטומטית וניתוח בתוכנת RflyDetection.
- יכולת הרחבה: מעבד נתונים של מאות זבובים לכל הרצה, ובכך מגביר את התפוקה ומפחית את השונות בהשוואה לבדיקות ידניות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: מספק מערכת הרלוונטית למחלה להערכת פנוטיפים של תנועה המקבילים לליקויים תנועתיים קליניים בהסעות נוירודגנרטיביות.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהערכה לאורך זמן לאורך גילאי הזבוב (5, 15, 25, 35 ימים) לצורך מידול של נוירודגנרציה פרוגרסיבית.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשר הערכה של ניסויי הצלה גנטיים (למשל, co-expression של auxR/auxGFP) כדי לתקף את ספציפיות המטרה ואת מעורבות המסלול.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת נקודת קצה התנהגותית כמותית המגשרת בין מניפולציה גנטית לתוצאה פנוטיפית במודלים של ניוורו-דגנרציה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי קישור ביטוי גנים (למשל, aux בנוירונים דופמינרגיים) לתפקוד לוקומוטורי באמצעות מדידה חוזרת של גאוטקסיס שלילי.
- סריקה: מספק פלטים סטנדרטיים ומוכנים לבדיקה (מרחק טיפוס במשך 6 שניות) המאפשרים השוואה מהימנה בין תנאים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מייצר נתוני mean ± SEM בדיוק סטטיסטי (one-way ANOVA, תיקון Bonferroni) לתמיכה בהשוואות בין-קבוצתיות ובבדיקות מובהקות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מדדים התנהגותיים למנגנונים של ניוון עצבי, ובכך תומך בהערכה פנוטיפית המותאמת לסמנים ביולוגיים במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקה התנהגותית אורךית על פני מספר גנוטיפים, גילאים וקבוצות טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת עמימות מנגונית באמצעות פנוטיפינג התנהגותי כמותי ברזולוציה גבוהה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות סנכרון אוטומטי, הקלטה דיגיטלית ואנליזה מבוססת תוכנה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות קבלת החלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות להערכה מהירה של גרעונות לוקומוטוריים במדגמים גדולים.
- השפעה על תיק הפיתוח: מקל על תיעדוף מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על נתונים חסונים של התקדמות פנוטיפית תלוית גיל.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, בתחזוקת הכלאות גנטיות ובהקמת מערכי בדיקה התנהגותית.
- תלוי במיכשור ייעודי הכולל את מכשיר ה-RING האוטומטי, בקר מדרגות (step controller), מצלמה דיגיטלית ותאורה תואמת.
- מחייב תשתית מחשוב לייבוא וידאו, חילוץ תצלומיות (snapshots) והפעלת תוכנת RflyDetection.
- כולל סטנדרטיזציה של תנאים סביבתיים (25°C, 70% לחות, מחזור אור/חושך של 12h) ופרוטוקולים להכנת מבחנות.
- כולל שיקולי בטיחות בשל רכיבים חשמליים; יש לאבטח את המכשיר ולאמת את תקינותו לפני ההפעלה.
