בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד חיידקים שלמים ומועשרים המכילים פגוזומים. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה כגון שינויים בהבשלת הפגוזומים ועיבוד האנטיגן כאשר מיקרואורגניזמים פתוגניים פולשים לתאים מארחים. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא בכך שהיא מייצרת חיידקים באיכות גבוהה המכילים פגוזומים בשלבים פשוטים וללא צורך בציוד מיוחד.

אנשים חדשים בשיטה ימצאו אותה נגישה מבחינה טכנית בהשוואה ללא-מתודולוגיות. הרעיון לפתח את השיטה הזו עלה לראשונה כשחקרנו את המנגנונים שבאמצעותם פתוגנים תוך-תאיים חוטפים את הפגוזומים לטובתם. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה שרי גוטיירז, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל בתרבית סלמונלה טיפימוריום, השתמש בלולאת חיידקים כדי לחסן מושבת חיידקים בודדת לתוך 5 מיליליטר של מרק עירוי לב מוח. לאחר מכן דגרו את המתלה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה תוך כדי טלטול. העבירו מיליליטר אחד של תרחיף חיידקי זה למרק BHI של 19 מיליליטר בבקבוק חרוטי למחרת.

דגירה נוספת באינקובטור 37 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול. כאשר ה- OD600 מגיע לאחד, הסר את הבקבוק מהחממה והעביר את התרבית לצינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב-5400 x G ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה החיידקית ב-PBS סטרילי של 10 מיליליטר. לאחר חזרה על הצנטריפוגה פעם אחת, השעו מחדש את הגלולה ב -4.9 מיליליטר PBS. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת קישור ביוטין טרייה שהוכנה לתרחיף החיידקים.

לאחר פיצול מתלה זה לחמישה צינורות של 1.5 מיליליטר, יש לדגור בבלוק תרמי בטמפרטורת החדר עם טלטול מתמיד ב -350 סל"ד למשך שעתיים. לאחר צנטריפוגה של הצינורות ב -15, 000 x G בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות, השליכו את הסופרנטנט. לאחר שני שלבי צנטריפוגה נוספים והסרה מוחלטת של תמיסת קישור הביוטין, השעו מחדש את החיידק המקודד ביוטין ב-PBS סטרילי של מיליליטר אחד בשפופרת אחת של 1.5 מיליליטר.

העבירו 100 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים מגנטיים מצומדים לסטרפטווידין לתוך צינור טרי של 1.5 מיליליטר והניחו אותו במדף מגנטי למשך חמש דקות. לאחר הוצאת הממס מהצינור, הסר את הצינור מהמתלה המגנטי. לאחר מכן השעו מחדש את החרוזים שנותרו בשפופרת עם מיליליטר אחד של תרחיף חיידקים מקודד ביוטין.

דגרו את הצינור על בלוק תרמו בטמפרטורת החדר למשך שעה תוך כדי ניעור ב -350 סל"ד. לאחר מכן, הנח את הצינור על המתלה המגנטי למשך חמש דקות. השתמש בפיפטה כדי להסיר את החיידקים שלא נדבקו לקיר ולהעביר לצינור חדש שכותרתו חיידקים לא מקודדים.

הצינור עם חרוזים מגנטיים הנצמדים לקיר מכיל חיידקים מקודדים ביוטין סטרפטווידין. הסר את השפופרת עם חיידקים מקודדי ביוטין סטרפטווידין מהמתלה המגנטי ותלה מחדש ב-PBS סטרילי של מיליליטר אחד. לאחר שהצינור היה על המתלה המגנטי במשך חמש דקות, הסר את ה-PBS.

לבסוף, השעו מחדש את החיידקים המקודדים ביוטין סטרפטווידין השטופים ב-500 מיקרוליטר של PBS סטרילי ותייגו את השפופרת כחיידקים מקודדים. ביום שלפני ההדבקה, צלחת BMDM מובחנת לחלוטין בצלחת של שישה סנטימטרים ב-RPMIs בתוספת עשרה אחוז FBS. למחרת, צנטריפוגה את תרחיף החיידקים המקודד ב-15,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה החיידקית במדיום RPMI בתוספת עשרה אחוז FBS. הסר את המדיום מה-BMDM והוסף חמישה מיליליטר של תרחיף חיידקים מקודד במדיום RPMI על מנת להדביק את התאים. כדי לסנכרן פגוציטוזיס, יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות.

לאחר מכן, כדי להתחיל פגוציטוזיס, יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של חמישה אחוזים של פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוציאו את המדיום מהכלים ושטפו את התאים שלוש פעמים ב-RPMI כדי להסיר חיידקים לא מופנמים. להרוג כל חיידק שאינו פגוציטים בעשרה מיליליטר של RPMI המכיל עשרה אחוז FBS ב-50 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין.

לבסוף, דגרו את ה-BMDM הנגועים ב-37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני של חמישה אחוזים עד לנקודת הזמן הרצויה. ראשית, הכינו את נפח מאגר בידוד הפגוזום A הנדרש על ידי הוספת DTT ו-Cytochalasin B ממש לפני השימוש ומעכבי פרוטאז ופוספטאז לפי המלצת היצרן. הסר את המדיום מהתאים הנגועים בנקודת הזמן הרצויה ושטוף את התאים עם PBS סטרילי שחומם מראש לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הוסיפו 750 מיקרוליטר של מאגר בידוד פגוזום A למנה ודגרו על קרח למשך 20 דקות. זכור לנענע את הצלחת מדי פעם. לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר של מאגר בידוד פגוזום B ולאחר מכן נדנד את הלוחות כדי להבטיח שהמאגר מכסה לחלוטין את פני השטח.

מגרדים בעדינות את התאים בעזרת שוטר גומי כדי להוציא את התאים מהצלחת ולהעביר אותם לצינור מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן השתמש במזרק של מיליליטר אחד כדי להעביר את מתלה התא דרך מחט בגודל 26 לפחות 15 פעמים. לאחר מכן, הנח את מתלה התאים על המתלה המגנטי למשך חמש דקות.

חלקיקים המחוברים לחרוזים המגנטיים הם פגוזומים המכילים S.Typhimurium מקודד. לאחר מכן העבירו את התרחיף המכיל את שאר הרכיבים התאיים לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המסומן כציטוזול. הסר את הצינור המכיל פגוזומים מבודדים מהמתלה ותלה מחדש ב-PBS סטרילי של מיליליטר אחד.

הנח את הצינור בחזרה על המתלה המגנטי למשך חמש דקות ולאחר מכן הסר את ה-PBS. לאחר חזרה על שטיפה זו עם PBS פעם אחת, הסר את ה-PBS ולבסוף, השהה מחדש את S.Typhimurium המכיל פגוזומים במאגר הנדרש. כדי להעריך את היעילות של S.Typhimurium Biotinylation על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, BMDMs נדבקו ב-mCherry S.Typhimurium המסומן בביוטין.

לאחר קיבוע ודגירה עם Cy5-Streptavidin, ביוטינילציה מוצלחת אושרה על ידי אות פלואורסצנטי Cy5-Streptavidin. אות זה נצפה אך ורק ב-mCherry S.Typhimurium עם ביוטינילציה בעוד שלא היה אות ב-mCherry S.Typhimurium שאינו ביוטיניל. ניתוח אימונובלוק של פגוזומים מבודדים הראה העשרה משמעותית של mCherry המבטא S.Typhimurium בפאגוזומים בהשוואה למקטע הציטוזולי.

ניתוח אימונובלוק באמצעות סמני אנדוזום וליזוזום בפאגוזומים מבודדים הראה העשרה של הסמנים שנבדקו בפאגוזומים שבודדו ארבע שעות לאחר ההדבקה בהשוואה ל-30 דקות לאחר ההדבקה. כאשר פרוטוקול זה יושם על סטפילוקוקוס זהוב, הודגמה ביוטינילציה מוצלחת של GFP המבטא S.aureus. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה וחצי בהתאם לזמן הדגירה שנבחר להדבקה על ידי החוקר.

כדי להבטיח את הצלחת הבידוד של חיידקים המכילים פגוזומים, אנא ודא שהמאגרים מכילים את הריכוזים המצוינים וכי הלוחות מתנדנדים כדי להבטיח כיסוי הומוגני של התאים. כמו כן, היו עדינים בעת גירוד התאים ובעת העברת תרחיף התאים דרך המחט. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון פרוטאומיקה או מטבולומיקה עם פגוזומים מבודדים כדי לחקור שינויים הנגרמים על ידי פתוגנים תחת גורמים פתוגניים מעורבים.