שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג קווי תאי NK או T מחולי CAEBV שיש להם משמעות רבה למחקר על מחלה קטלנית זו. שיטה זו מסייעת בהשגת קווי תאי NK או T למחקר על המנגנון של CAEBV, כגון חקר ה-VBV הגולמי על התפשטות תאים, סינון מעכבים המפריעים להתפשטות תאי NK/T. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בטכניקה פשוטה ויעילה מאוד הדורשת רק כמות קטנה של דם היקפי ומינון נמוך של ברזל 2 כדי ליצור קווי תאי NK או T מחולי CAEBV.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, מכיוון שהישרדות התאים בשבועיים הראשונים של התרבית אינה ודאית ושיטה זו תראה לך כיצד לקבוע את התפשטות התאים של התרבית המוקדמת. כשעלה בדעתנו לראשונה הרעיון לשיטה זו, גילינו שברזל 2 בסרום אנושי יכול להכיל PBMC עד שבועיים. הראינו שהדגמה של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהיא מראה את צורת התאים ואת הגורם להתפשטות.

והרחבה זו של תאים ומספור תאי Y-bar כדי להתחיל בהליך זה, טהר PBMC ראשוני משני מיליליטר דם מלא של חולי CAEBV על ידי צנטריפוגה שיפוע. לחלופין, יש להפשיר PBMC משומר בהקפאה מחנקן נוזלי עם מדיום RPMI-1640. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של 0.4% טריפן כחול ל-18 מיקרוליטר של תרחיף תאים כדי להכתים את התאים למשך שלוש דקות ואז העביר את התרחיף לצלחת מונה התאים ומדוד את ריכוז התאים ואת כדאיות התאים עם מונה תאים אוטומטי.

הכן את תרחיף התאים בצפיפות של פי שניים עד שלושה מ-10 עד שישית תאים למיליליטר, בתוספת מדיום תרבית RPMI-1640 שלם המכיל 20% סרום אנושי, שני מילי-מולרי L-גלוטמין ואנטיביוטיקה. לאחר מכן, זרע מיליליטר אחד של תרחיף PBMC לבאר לתוך 24 לוחות תרבית תאי הבאר. לאחר מכן, הוסף 150 יחידות למיליליטר rhIL-2 לכל באר.

מניחים את צלחות התרבות בחממת פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ביום השני, התבוננו במורפולוגיה של התא תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 200. התאים במצב טוב כשהם בהירים ועגולים.

בשלב זה, הוסף שני מיקרוליטרים של 0.4% טריפן כחול ל-18 מיקרוליטר של תרחיף תאים וחשב את ריכוז התאים. לאחר מכן, התבונן במורפולוגיה של התא ועקוב אחר מצב צמיחת התאים על ידי מספור התאים לפני שינוי המדיום. חשוב לעקוב אחר המורפולוגיה של התא והמצב.

אנו יכולים לשפוט אם התאים שורדים על ידי התאים הפולימורפיים ומצבם של התאים בשלב מוקדם של התרבית. לאחר מכן, הסר 500 מיקרוליטר מהמדיום מכל באר בצלחת 24 הבארות והוסף לה 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם טרי. לאחר מכן הוסף 150 יחידות למיליליטר rhIL-2 לכל באר.

החלף את המדיום פעמיים בשבוע. שרטט את עקומת צמיחת התאים. כאשר ריכוז התאים הבר-קיימא עולה על פי חמישה מ-10 עד שישית תאים למיליליטר, חלקו את התאים לבארות חדשות בריכוז של אחד עד שניים מ-10 עד שישית תאים למיליליטר בכל באר.

תהליך זה אורך שבועיים עד ארבעה שבועות. כאשר התאים התרחבו, אסוף פעם אחת 10 עד שישית תאים כדי לקבוע את הפנוטיפים של קווי התאים. צנטריפוגה אותם ב -240 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרז את תאי ה- NKNT.

לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט, שטפו את המשקעים על ידי הוספת שבעה מיליליטר PBS. צנטריפוגה למשך חמש דקות ב 240 זמן גרם בטמפרטורת החדר. חזור על ההליך פעם נוספת, ואז הוסף 200 מיקרוליטר סרום אנושי לכל צינור, ערבב היטב ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר צנטריפוגה את התאים ב -240 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בפעם אחת 10 עד שישית תאים למיליליטר עם PBSA קר. לאחר מכן, חלקו את התאים לחמישה צינורות שכל אחד מהם מכיל פעמיים כפול 10 עד חמישית. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים ב-240 פעמים גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים עם מאגר PBSA או PBSA המכיל 10 מיקרוליטר PE ו-10 מיקרוליטר של נוגדנים מסומנים FITC כדי להכתים קולטני תאים של תאי T או NK על קרח.

תאים תלויים עם מאגר PBSA משמשים כבקרה שלילית. לאחר מכן, דגרו על התאים עם נוגדנים למשך 20 עד 30 דקות על קרח בחושך. שטפו את התאים פעמיים עם PBSA קר והשעו מחדש את התאים עם 300 מיקרוליטר PBSA קר לפני הניתוח עם ציטומטר הזרימה.

לאחר השלמת ניתוח הפנוטיפ של התא, הסר בזהירות מחצית מהסופרנטנט והימנע מלגעת בתאים בתחתית הצלחת. הוסף את אותו נפח של מדיום תרבית טרי המכיל rhIL-2 ב-300 יחידות למיליליטר לצלחות, ולאחר מכן החלף מחצית מהמדיום כל שלושה ימים עד שאשכולות התאים נראים בבירור במיקרוסקופ. לאחר מכן, העבירו את התאים מלוחות 24 הבארות לצלוחיות תרבית T-25 לאחר ערבוב בארות שונות מאותה שושלת.

הכפל את נפח מדיום התרבות כשהוא הופך לצהוב עד שנפח המדיום מתרחב ל -10 עד 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף אליו rhIL-2 בריכוז של 150 יחידות למיליליטר. החלף את המדיום 24 שעות לפני ההקפאה לאחר שבועיים-שלושה של גידול, כאשר ניתן לצפות במסת התא בעין בלתי.

מדוד את ריכוז התאים עם מונה התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא למשך חמש דקות ב-240 פעמים גרם והשעיה מחדש של כדור התא בצפיפות של חמישה עד 10 פעמים 10 עד שישית תאים למיליליטר עם תמיסת המלאי הקפוא המכילה 90% סרום בקר עוברי ו-10% DMSO. מקפיאים אותו בקצב של מעלה אחת לדקה עד מינוס 80 מעלות צלזיוס ואז מעבירים ישירות לחנקן נוזלי.

לאחר שלושה ימי תרבית במהלך הקמת קווי תאים, התאים הפולימורפיים מתחילים להופיע. לאחר שבעה ימים, תאים גדלים במהירות מכיוון שמספר התאים והכדאיות שלהם גדלו בקצב גבוה. אשכולות קטנים של תאים נראים בבירור לאחר 10 עד 14 ימי גדילה, כאשר ריכוז התאים עולה על פי 3 עד 6 פעמים 10 עד השישית.

בתקופה זו יש להרחיב את התאים על ידי חלוקה לשתיים או שלוש בארות של צלחת התרבות. כחודש לאחר מכן, ברגע שמספר התא מגיע לשלוש עד חמש כפול 10 לשביעי, הספירה גבוהה מספיק לשימור. נושא חשוב נוסף הוא קביעת הפנוטיפים לאחר תרבית מוצלחת של התאים.

התוצאות שלנו מצביעות על כך שניתן לתרבית תאי T ו-NK בשיטה שתוארה לעיל וניתן ליצור קווי תאים בטכניקה זו מכיוון שהתאים גדלו יותר משלושה חודשים במצב טוב. שיטה זו, טכניקה זו, ניתנת לביצוע אפילו יותר. קל לבצע אותו כמו שצריך.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על השונות של PBMC. עבור הליך זה, ניתן לבצע כל אחת מהשיטות, כמו ערכת בדיקת MTT 8, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו הרעילות של קווי תאי NK או T שעשויים לשמש לאימונותרפיה מאמצת. לאחר כל פיתוח, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום CAEBV לחקור מנגנונים של NK/T הקשורים ל-EBV הכוללים מחלות ניתוחיות במערכת מודל התא.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקים הרחבה של קווי תאי NK ו-T בעקבות פרוטוקול זה. אל תשכח שעבודה עם פתוגן עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.