Name: פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: למדו שיטה יעילה לדה-סלולריזציה ודה-כלציפיקציה של קוכליאות עכבר לשימוש כפיגומים בהנדסת רקמות האוזן הפנימית. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לחקור את האינטראקציה בין תאים למטריצה החוץ-תאית של הקוכליאה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט הנוכחי מומן על ידי אוניברסיטת קנזס הוכחת הרעיון קרן. ברצוננו להודות. האחיות-KUMC (קנזס סיטי, קאי אס) עבור מסייע לנו בהשגת האנושי חבל הטבור חוטי יורגנסן דוד על סיוע עם תרבויות cochleae.

כל ההליכים, לרבות בעלי חיים המתת חסד, נערכו לפי שאושרו אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) הפרוטוקול (תגיד #2014-2234) במרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס (KUMC).
הערה: HWJCs הם בודדו אותנו מהמתרחש חוטי חבל הטבור אנושי זה נתרמו על ידי מטופלים סיפק מדעת, דגימות שימשו לפי הפרוטוקולים שאושרו על-ידי אוניברסיטת קנזס הוועדה בנושאים אנושיים (KU-IRB #15402).
1. עצם הרקה הקציר ובידוד שבלול
<ol>
	<li>לערוף כראוי לאללה, בת שבוע 15 עכבר על ידי חיתוך בין הגולגולת לבין חוליות הראשון עם זוג מספריים כירורגיים חדים, ואז לרסס את הראש עם 70% אתנול לחטא (איור 1 א').</li>
	<li>קטיעות הגולגולת במטוס מאמצע-הווריד באמצעות אותו זוג מספריים כירורגיים (איור 1B-C, קווים מקווקווים) חדה.</li>
	<li>הסר את רקמת המוח לגולגולת באמצעות זוג מלקחיים (איור 1D, ראש חץ).</li>
	<li>לזהות העצם הטמפורלית דרך נוכחות של השמיעה העצב vestibular שורשים (איור 1E-F, ראשי חץ) על החלק הפנימי של הגולגולת, תעלת האוזן מבחוץ (איור 1F, חץ). לחתוך בזהירות דרך הגולגולת כדי לבודד את עצם הרקה מהשארית של הגולגולת (איור 1 ג'י). הערה: במקרים מסוימים, ייתכן שתהיה אפשרות לחטט בעדינות את עצמות הגולגולת מן העצם הטמפורלית שמסביב ללא צורך חיתוך.</li>
	<li>הכנס המלקחיים בסדר פתיחת תעלת האוזן כ 5 מ מ (איור 1 H), אז הטיפים לא לסכן את ניקב שבלול. בעדינות שבירת העצם של בולה (איור 1 H, האזור המוצלל אדום) אז זה שברים (קואיור 1I, אדום מנוקד). הערה: אם יש צורך, מיקרוסקופ לנתיחה עשויים לסייע בתהליך זה כדי להבטיח מיקום מדויק ומניפולציה של כלי נגינה.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים בסדר, לחטט משם את שארית בולה מן העצם הטמפורלית, חשיפת המבוך הגרמי של שבלול (איור 1J, מרובעים אדום).</li>
	<li>מניחים צלחת פטרי גדולה מספיק כדי להכיל הרקה (לדוגמה, 30 מ מ ומעלה) מתחת לנתח היקף שדה ראייה, למלא אותו עם מספיק פוספט Buffered מלוחים (PBS) כדי לכסות את העצם הטמפורלית (למשל, 0.5-1 מ ל).</li>
	<li>להטביע הרקה עם בולה להסיר את PBS עם החלונות עגולה, סגלגל של שבלול פונה כלפי מעלה. הערה: הסרת שיווי המשקל של שבלול הוא לא הכרחי, כפי שיווי המשקל משמש גם נקודת אחיזה עבור מניפולציה המכוונת תכונות של שבלול (איור 1I ו איור 2B).</li>
	<li>באמצעות זוג מלקחיים ultra-בסדר, להסיר את העורק stapedial, אשר עובר דרך באוזן.</li>
	<li>הוסף עצה אחת של המלקחיים ultra-בסדר דרך הקשת של באוזן שבו העורק עברו, והרם בעדינות באוזן כלפי מעלה. באוזן disarticulated צריך להרים את החלון הסגלגל.</li>
	<li>משתמש קצה אחד של המלקחיים ultra-בסדר, לנקב את האליפסה, בחלונות העגולים.</li>
	<li>שימוש של PBS 1 x מלא 28.5-מד מזרק עם אבובים (הקוטר הפנימי 0.28 מ מ, הקוטר החיצוני 0.61 מ"מ) מצורפים, מקם את הצנרור מעל החלון הסגלגל (איור 2A -B). הערה: הפתיחה של הצינור ניתן לטפל באמצעות מלקחיים ultra-בסדר לסייע להבטיח מיקום מדויק.<ol>
		<li>השתמש מזרק טריים ואת צינורות עבור כל שבלול.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuse 2 מיליליטר 10% אנטיביוטיקה-antimycotic (אנטי-נגד) ו- 10% פניצילין-סטרפטומיצין (עט-דלקת) ב- PBS דרך שבלול מעל 5 דקות כדי להסיר את perilymph. מה קורה מהר מדי עם לחץ רב מדי יגרום נזק המבנים הקנס בתוך שבלול. הערה: נהיגה באופן ידני את המזרק ביד כדי perfuse את הנוזל דרך שבלול הוא יעיל, למרות משאבה זלוף יכול לשמש אלטרנטיבה.<ol>
		<li>אם פרפוזיה באופן ידני, השתמש זוג הקנס, עצמי סגירת מלקחיים לייצב שבלול (איור 2 א) במהלך זלוף על ידי האוחז בחלק שיווי המשקל של העצם הטמפורלית. הערה: למרות שאינך נדרש, זה משאיר שתי ידיים חופשיות להתמודד עם מכשירים; יד אחת יכול להסיע את המזרק (איור 2 א) ואילו השני ניתן למקם את הצנרור כראוי (איור 2B).</li>
		<li>שלב זה קדימה, לטפל כדי למנוע חשיפת שבלול שלא לצורך לשידור. היכרות עם בועות אוויר לתוך שטחים נוזלים יחסום זרימת נוזל ולאחר ייבוש נוסף יגרום נזק המבנים הקנס בתוך שבלול.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>להסיר ולמחוק כל שריר רקמות ועצמות והשריד באמצעות מלקחיים משובחים.</li>
	<li>במידת הצורך, אחסן cochleae מבודדים ב 4 ° C אנטי-אנטי 10%, 10% הפתרון עט-דלקת ב- PBS עד שבעה ימים בשינויים קבועים של פתרון אנטיביוטי כל 48 שעות.</li>
</ol>
2. עיבוד שבלול
<ol>
	<li>Decellularization
	<ol>
		<li>עבור כל שבלול, מילוי בקבוקון נצנוץ 20-מ ל זכוכית עם dodecyl נתרן 1% חומצה גופרתית (מרחביות) פתרון במים מיוננים (DI) אשר משמש כדי decellularize שבלול.</li>
		<li>חותכים את העצה ממני פיפטה פלסטיק 7-mL העברה באמצעות סכין גילוח כך הפתח מספיק גדול עבור שבלול לעבור.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של העברה, בעדינות צייר שבלול לתוך פיפטה כך עובר לקצה ניתוק על ידי כמה מילימטרים.</li>
		<li>לגרש שבלול לתוך המבחנה 1% פתרון מלא נצנוץ מרחביות.</li>
		<li>הפיצו 2 מ של 1% מרחביות במים מיוננים (DI) דרך שבלול בבקבוקון נצנוץ באמצעות פיפטה של העברה.</li>
		<li>למקם את המבחנה נצנוץ מסובב, ולאפשר את המבחנה נצנוץ לסובב במהירות של סל ד 10 במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר.<ol>
			<li>שנה 1% פתרון מרחביות כל 24 שעות ביממה במשך 72 h. . שמור על עצמך בעת שינוי מרחביות לחשוף לעולם לא שבלול לאוויר.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>רחץ שבלול שלוש פעמים במשך 30 דקות כל במים DI.</li></ol></li></ol>לבצע את מנקי בבקבוקון נצנוץ באותו המשמש את ההאשמות מרחביות; בשלב זה, שבלול הוא decellularized.
	
	
	<li>Decalcification
	<ol>
		<li>הסר את יתרת כמות המים DI המבחנה נצנוץ, משאיר מספיק כדי להשאיר שבלול מתחת למים.</li>
		<li>כדי להתחיל decalcification, הוסף 5 מ של 10% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0.02 נקודות ז) במים DI נצנוץ למבחנה המכילה שבלול.</li>
		<li>הפיצו 2 מיליליטר 10% EDTA במים DI דרך שבלול בבקבוקון נצנוץ באמצעות פיפטה של העברה.</li>
		<li>הכנס את המבחנה נצנוץ בחזרה מסובב, ולאפשר את המבחנה נצנוץ לסובב במהירות של סל ד 10 במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. לשנות את הפתרון EDTA 10% בכל 24 שעות ביממה במשך 72 h. יש להיזהר בעת שינוי פתרונות כך שבלול ואינו חשוף לאוויר.</li>
		<li>לשטוף שבלול 3 פעמים עבור 2 h כל עם PBS 1 x; בשלב זה, שבלול הוא decalcified.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>אחסון
	<ol>
		<li>לאחסן את cochleae עבור עד 72 שעות ב- 10% אנטי-נגד, 10% עט-דלקת פתרון ב- PBS ב 4 º C. הערה: פרקי זמן ממושכים אחסון ייתכן שניתן בשינויים קבועים של פתרון לאנטיביוטיקה; עם זאת, אחסון מורחב של cochleae מעובד לא אומתה ב פרוטוקול זה.</li>
	</ol>
	</li>

3. רכש והרחבה של hWJCs
<ol>
	<li>לבודד hWJCs על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר22. בקצרה, קטע חבל הטבור מיתרי למקטעים של 3 ס מ.</li>
	<li>בזהירות עושים חתך רדוד עם איזמל לאורכו על כל קטע הטבור לפרוש ולחשוף וורטון הטבור. להשתמש מלקחיים כדי להסיר את כלי הדם.</li>
	<li>רחץ הטבור מקטעי פעמיים עם מספיק PBS (למשל, מ 40 ל 60 מ מ פטרי) ומטביעים את הרקמה. דק מינצ מקטעי רקמת עם אזמל. מעכלים רקמת ב- 100 מ מ צלחת פטרי עם 50 מ של עיכול בינוני (0.2% מסוג 2 collagenase, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, בגלוקוז נמוך בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco)).</li>
	<li>מקום רקמות לעכל בינוני על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד לילה ב- 5% CO2, חממה 37 º C. למחרת, לדלל עיכול בינוני ביחס של 1:16 % 2 אנטיביוטיקה-antimycotic ב- PBS, גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g בטמפרטורת החדר (~ 27 ° C) במשך 10 דקות להשליך תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend כדורי ב Mesenchymal תא גזע הצמיחה בינונית (MSCGM) ולשלב מחדש תאים. צלחת תאים על צפיפות של 7 x 103 תאים/cm2 בתרבות רקמה מטופלים T-75 המבחנות. תרבות HWJCs ב MSCGM, להרחיב את המעבר 5 לניסויים. הערה: HWJCs עשוי להיות תת תרבותי לתוך T-מבחנות גדולות יותר (למשל, T-150, T-300) כאשר passaging להגדיל תשואה של hWJCs לניסויים.</li>
</ol>
4. אינפוזיה של hWJCs אל Decellularized Cochleae
<ol>
	<li>להכין decellularized cochleae
	<ol>
		<li>באמצעות הטכניקה aseptic, לשטוף cochleae מאוחסנת ב- PBS 1 x שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד.</li>
		<li>להעביר את cochleae לתוך בארות נפרדים של צלחת 24-ובכן, ולהוסיף 1 מ"ל של 37 ° C מראש חימם MSCGM.</li>
		<li>דגירה cochleae ב 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה לקבוצות של h 1 לפני אינפוזיה של תאים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>מביצועם hWJCs, resuspend
	<ol>
		<li>שטיפת hWJCs עם 37 ° C מראש חימם 1 x PBS פעמיים.</li>
		<li>הוסף מספיק 37 ° C מראש חימם טריפסין עם EDTA 0.5% כדי לכסות את המשטח הקיבול של התא.</li>
		<li>דגירה hWJCs של עד 5 דקות 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה.<ol>
			<li>ודא כי 90% של תאים יש מנותקת השטח התרבות התא על-ידי הצגת תאים תחת מיקרוסקופ הפוכה. הערה: תאים ינוע הכלי תרבות הוא טפח בעדינות, יש להתנתק. תאים דייל, יש אינו מנותק.</li>
			<li>טפח בעדינות את צידי הבקבוק עוד יותר מכך התאים המצורפת.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>באמצעות הטכניקה aseptic, hWJCs העברה מכלי הקיבול תרבות אל צינור חרוטי 50-mL המכילים אמצעי אחסון המקבילה של MSCGM לנפח של טריפסין נהגו מביצועם התאים.</li>
		<li>גלולה של hWJCs על ידי צריך שתוציאו ב 500 g x בטמפרטורת החדר (~ 27 ° C) במשך 5 דקות.</li>
		<li>האחות תגובת שיקוע, resuspend hWJCs של MSCGM-ריכוז של תאים למ"ל 500,000.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuse cochleae
	<ol>
		<li>העברת cochleae צלחת 24-ובכן חדשה באמצעות פיפטה של העברה.</li>
		<li>להוסיף טיפה של MSCGM כל שבלול כדי למנוע כל שבלול ממנו להתייבש.</li>
		<li>בעדינות אוריינט שבלול באמצעות מלקחיים ultra-בסדר, כך החלונות סגלגל ועגול פונות מעלה. הערה: שמור על עצמך קיצוני בעת טיפול ישירות כל שבלול כמו שבלול בקלות יתערער.</li>
		<li>באמצעות מזרק אינסולין 28.5-מד סטרילי עם צינורות מחוברים, צייר עד 0.2 מ"ל resuspended hWJCs (100,000 תאים).</li>
		<li>בעזרת מלקחיים בסדר מעוקר, הצב אבובים החלון הסגלגל.</li>
		<li>בעדינות, לאט לאט perfuse שבלול 0.2 מ של hWJCs resuspended באמצעות מזרק אינסולין 28.5-מד מחובר לצנרת פוליאתילן (הקוטר החיצוני: 0.61 מ מ, קוטר פנימי: 0.28 מ מ) במשך כ 5 דקות.</li>
		<li>לאחר זלוף, להוסיף 0.8 מ של 37 ° C מראש חימם MSCGM את טוב המכיל שבלול להביא את הנפח הכולל בבאר 1 מ"ל.</li>
		<li>חזור על צעדים 4.3.3-4.3.7 עבור כל שבלול, באמצעות מזרק טריים, אבובים בכל פעם.</li>
		<li>הכנס perfused cochleae 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה, ושנה מדיה שלוש פעמים בשבוע.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. שבלול הקציר ושימור
הערה: Cochleae עשוי להיות בתרבית וקצרו בכל נקודת זמן עד 30 ימים שלאחר זלוף.
<ol>
	<li>כדי לשמר את cochleae, לתקן את paraformaldehyde 4% ב- PBS 1 x לילה ב 4 ° C על פלטפורמה נדנדה.</li>
	<li>לאחר קיבוע, לשטוף cochleae עם 1 x PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות.</li>
	<li>בהדרגה מייבשים שבלול עם אתנול, לנקות עם הממס פחמימן אליפטיות לפני הטבעה של פרפין.</li>
	<li>סעיף דגימות עובי של 10 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום הר על זכוכית שקופיות מיקרוסקופ. הערה: הדוגמאות הם עכשיו מוכן היסטולוגית או immunohistochemical עיבוד באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.</li>
</ol>

<ol><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+innervation+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).</li>
<li>LeMasurier, M., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-Cell+Mechanotransduction+and+Cochlear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification.</a> Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).</li>
<li>Neal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+counts+in+a+rat+model+of+sound+damage%3A+Effects+of+tissue+preparation+%26+identification+of+regions+of+hair+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss.</a> Hear Res. 328, 120-132 (2015).</li>
<li>Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss%3A+a+recreational+noise+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).</li>
<li>Stucken, E. Z., Hong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss%3A+an+occupational+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).</li>
<li>Dille, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinnitus+onset+rates+from+chemotherapeutic+agents+and+ototoxic+antibiotics%3A+results+of+a+large+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Audiol%22%5BJournal%5D)">Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study.</a> J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).</li>
<li>Sajjadi, H., Paparella, M. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18675691">Meniere's disease.</a> Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).</li>
<li>House, J. W., Brackmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinnitus%3A+surgical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found+Symp%22%5BJournal%5D)">Tinnitus: surgical treatment.</a> Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Ryals, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+species+differences+in+susceptibility+to+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Avian species differences in susceptibility to noise exposure.</a> Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).</li>
<li>Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+inner+ear+sensory+epithelia+from+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).</li>
<li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+to+the+auditory+nerve+and+cochlear+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct.</a> Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).</li>
<li>Shi, F., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+replacement+of+auditory+neurons+by+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells.</a> Hear Res. 297, 106-112 (2013).</li>
<li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+decellularized+cochleae+as+scaffolds+for+inner+ear+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering.</a> Stem Cell Res Ther. 8, (2017).</li>
<li>Santi, P. A., Johnson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+ear+tissues+as+scaffolds+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).</li>
<li>Davies, D., Holley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+alpha+3+and+alpha+6+integrins+in+the+developing+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear.</a> J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).</li>
<li>Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+matrix+in+the+formation+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear.</a> Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).</li>
<li>Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrices+associated+with+the+apical+surfaces+of+sensory+epithelia+in+the+inner+ear%3A+molecular+and+structural+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity.</a> J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).</li>
<li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Viability+and+Transfection+Efficiency+with+Human+Umbilical+Cord+Wharton%27s+Jelly+Cells+Through+Use+of+a+ROCK+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor.</a> Cell Reprogram. , (2014).</li>
<li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Photo-conversion%3A+A+second+chance+to+label+unique+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).</li>
<li>Mitchell, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+cells+from+Wharton%27s+jelly+form+neurons+and+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia.</a> Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).</li>
<li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+Reprogramming+of+Human+Wharton%27s+Jelly+Cells+Reveals+Differences+Between+ATOH1+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues.</a> Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).</li>
<li>Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+versus+sTSLIM+3D+imaging+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea.</a> J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).</li>
<li>Nonoyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+ototoxicity+of+gadoteridol+%28ProHance%29+and+gadodiamide+%28Omniscan%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice.</a> Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).</li>
<li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhesus+Cochlear+and+Vestibular+Functions+Are+Preserved+After+Inner+Ear+Injection+of+Saline+Volume+Sufficient+for+Gene+Therapy+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery.</a> J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).</li>
<li>Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioactivity+of+cartilage+extracellular+matrix+in+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration.</a> Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בהצלחה הראו כי ניתן להסיר תאים שבלולי יליד שבלול באמצעות תהליך decellularization, מה שמאפשר עבור השימוש של שבלול לגרדום רקמות מורכבות, תלת מימדי. סנטי ואח. 15 פיתח את שיטת הראשוני עבור decellularizing cochleae, במדויק העריכו את אמצעי האחסון של מבנים רבים-שבלולי דרך בעזרת מיקרוסקופ אור גיליון23. עבודה מוקדמת כל כך שימש בסיס חזק הנדסת רקמות וטכניקות התרבות התא המוצג כאן. שבלול decellularized בהצלחה יכול להיות מוחדר עם תאים ולאחר מכן תרבותי לתקופה ממושכת של זמן. תיאור...

שבלול הוא מבנה לולייני המורכב נמצאו הרקה. הוא מורכב של המבוך הגרמי החיצוני ואת המבוך membranous קונצנטריים, פנימית1. המבוך membranous מורכב 3 משבצות נוזלים: סקאלה vestibuli, סקאלה מדיה, ו טימפני סקאלה1. התקשורת סקאלה בתים האפיתל חושית, המורכב משילוב של מספר רב של סוגי תאים, אך התאים שיער חושית (HC), אשר מגלי אנרגיה מכנית של גלי קול דחפים עצביים2, הם מעניינים במיוחד. חשיפה טראומה אקוסטית3,4,5, תרופות6,7,המחלה8והזדקנות9 כל יכול לגרום תפקוד לקוי השמיעה דרך המוות HC. איבוד תאים שיער אצל יונקים הוא קבע, בניגוד HCs העופות, אשר יכול להתחדש לאחר פציעה10.
מגוון רחב של מאמצי מחקר עכשווי ביקשו לשחזר HCs אבוד, אף הגישות ניסיוני ספציפיים משתנים. מניפולציה של ביטוי גנים בתוך האפיתל חושית, השתלה של תאי גזע הבדיל מחוץ לגוף הם גישות דומיננטי בתחום, למרות שיטות אינדוקציה שואפים להבדיל תאי גזע לתוך שבלולי organoids היה ניסיון11,12,13. כל הגישות הללו הוא גם מסתמך ישירות על תאי גזע, או התפתחותית הותאם בשימוש בתאי גזע; עם זאת, רגע משותף, שעשוי להיות קריטי, אלמנט זה ה-ECM של שבלול עצמו14,15.
ECM לא רק מספק תמיכה פיזית תאים ורקמות, אשר כולל משטח אדהזיה תא, התפשטות, הישרדות של ההעברה, אך גם ממלא תפקידים חיוניים להתפתחות HCs ומן ספירלה גנגליון15,16 ,17. באופן טבעי ECM המתרחשים מספק אותות אינדוקטיבית להנחות תא בנחישות פנוטיפ ו/או תא אדהזיה התפשטות, הישרדות18. כתוצאה מכך, השימוש של שבלול decellularized בשילוב עם hWJCs בתרבית מציעים הזדמנות ייחודית לגלות את התפקיד של התחדשות ECM ו- HC. HWJCs הם סוג זמינים, נתינת תא מבודד מן האדם חוטי חבל הטבור המתנהגים כמו גזע mesenchymal19. HWJCs הראו את היכולת להבחין תא neurosensory שושלות20,21. לפיכך, בפרוטוקול הנוכחי מפרט את הבידוד, decellularization ו זלוף של cochleae מ- C57BL הגוויות עכבר עם hWJCs עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית.

<table><tbody><tr><td>Allegra X-14R צנטריפוגה</td><td>בקמן-קולטר</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חצי קשיחים אינטרמדיים</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק Innova 2000 Orbital Shaler</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים במיוחד</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>U-100 מזרק אינסולין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון נצנוץ פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>מסובב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>העברה פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>צלחת</td> <td>24 בארותפישר סיינטיפיק</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost PLUS זכוכית מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant עם DAPI</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 חממת CO2 Thermo Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול תאי גזע מזנכימלי</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 בקבוק תרבית</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 בקבוק תרבית</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-300 בקבוק תרבות</td><td>MidSci</td><td>TP90301</td><td></td></tr><tr><td>דיסקציה מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>Instruments Nikon SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2R-FL מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon Instruments</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire Class II, סוג A2 ארון בטיחות ביולוגית</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>1% תמיסת SDS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול עבור decellularizing cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

אצל יונקים, תאים שיער mechanosensory המאפשרים שמיעה חוסר היכולת להתחדש, אשר מוגבל טיפולים עבור אובדן שמיעה. אסטרטגיות רפואה רגנרטיבית הנוכחי התמקדו משתילים בתאי גזע או מניפולציה גנטית של סביב תמיכה התאים באוזן הפנימית כדי לעודד החלפה של תאים פגומים גזע כדי לתקן אובדן שמיעה. ובכל זאת, מטריצות (ECM) עשוי לשחק תפקיד חיוני גרימת ושמירה על תפקוד של תאים שיער, לא נבדקה היטב. באמצעות את שבלולי ECM בדומה לפיגום לגדל תאי גזע בוגרים עשויים לספק תובנות ייחודיות איך הרכב ואת הארכיטקטורה של הסביבה חוץ-תאית מסייע תאים הסדירה פונקציה השמיעה. כאן אנו מציגים שיטה אנליטית, decellularizing cochleae של עכברים להשתמש פיגומים מקבל תאי גזע בוגרים perfused. בפרוטוקול הנוכחי, cochleae הם בודדו אותנו מהמתרחש עכברים לאללה, decellularized, decalcified. לאחר מכן, תאים ג'לי האנושי וורטון (hWJCs) הם בודדו אותנו מהמתרחש הטבור היו perfused בזהירות לתוך כל שבלול. Cochleae שימשו ריאקטורים, התאים היו תרבותי עבור 30 ימים לפני שעברו עיבוד לניתוח. Decellularized cochleae נשמרות לזיהוי מבנים חוץ-תאית, אך אינו חושף את הנוכחות של תאים או מורגש שברי DNA. התאים perfused לתוך שבלול פלשו רוב הפנים והחוץ של שבלול, גדלה ללא תקלות משך זמן של 30 ימים. לכן, השיטה הנוכחית ניתן ללמוד איך שבלולי ECM משפיע על התא התפתחות והתנהגות.

באמצעות השיטות המובאות כאן, decellularization מוצלחת של cochleae הוערך על-ידי בדיקת נוכחות או היעדרות של ה-DNA באמצעות 4 אינץ ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. Cochleae נחשבו decellularized באופן מלא אם הדנ א לא זוהה בתוך שבלול decellularized. שבלול יליד מהניסוי הקודם זה לא עברה decellularization או decalcification שימש פקד חיובי כדי להמחיש את המבנים ותאים שנמצאו באופן מסורתי שבלול העכבר C57BL. שבלול decellularized-decalcified, אשר לא היה שום hWJCs חלוט, שימש פקד שלילי. אין גרעי...

המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין שיטה יעילה decellularize, decalcify cochleae העכבר עבור ניצול כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטה יעילה להסרת תאים והסרת אבדן של שבלול עכברים לשימוש בפיגום ליישומי הנדסת רקמות באוזן הפנימית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי השמיעה והנדסת רקמות כגון, כיצד שבלול תלת מימדי ורכיבים שונים של המטריצה החוץ-תאית משפיעים על התמיינות תאי גזע? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחוקר לחקור כיצד תאים מקיימים אינטראקציה ישירה עם המטריצה החוץ-תאית של השבלול ליצירת אפיתל חושי.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שבידוד העצם הטמפורלי ומנגנון שפע התאים יכולים להיות קשים להמחשה נכונה על סמך תיאורי טקסט בלבד. כדי להתחיל בהליך זה, חצו את הגולגולת במישור האמצעי באמצעות מספריים כירורגיים חדים. לאחר מכן, הסר את רקמת המוח מהגולגולת.לאחר מכן זהה את העצם הטמפורלית באמצעות נוכחות שורשי העצב השמיעתי והווסטיבולרי בחלק הפנימי של הגולגולת ותעלת האוזן מבחוץ. חותכים בזהירות את הגולגולת כדי לבודד את העצם הטמפורלית משארית הגולגולת. לאחר מכן, הכניסו את המלקחיים העדינים לפתח תעלת האוזן כחמישה מילימטרים כדי שהקצוות לא יסתכנו בניקוב השבלול.שברו בעדינות את עצם הבולה כך שהיא תישבר. בעזרת מלקחיים עדינים, חטפו את שארית הבולה מהעצם הטמפורלית וחושפים את המבוך הגרמי של השבלול. לאחר מכן, טבלו את העצם הטמפורלית ב-PBS כשהחלונות הסגלגלים והעגולים של השבלול פונים כלפי מעלה.בעזרת זוג מלקחיים עדינים במיוחד הסר את העורק הסטפדיה העובר דרך הסטפס. לאחר מכן הכניסו קצה אחד של המלקחיים העדינים במיוחד דרך קשת הסטפס שבה עובר העורק והרימו בעדינות את הסטפס כלפי מעלה. לאחר מכן, נקב את החלונות הסגלגלים והעגולים.לאחר מכן, מקם את הצינור המחובר למזרק בגודל 28.5 מלא PBS מעל החלון הסגלגל. השתמש בשני מילימטרים של 10% אנטיביוטיקה-אטימיקוטית ו-10% פניצילין-סטרפטומיצין ב-PBS דרך השבלול במשך חמש דקות כדי להסיר את הפרילימפה. לאחר מכן הסר והשליך את כל רקמת השריר ושברי העצם שנותרו.לצורך דה-סלולריזציה, באמצעות צינור ההעברה משוך בעדינות את השבלול לתוך הפיפט כך שהוא פשוט עובר את הקצה החתוך בכמה מילימטרים. לאחר מכן, הוציאו את השבלול לתוך בקבוקון הנצנוץ המלא בתמיסת SDS של 1%. הפיצו שני מיליליטר של 1% SDS במים נטולי יונים דרך השבלול בבקבוקון הנצנוץ באמצעות צינור העברה.הנח את בקבוקון הנצנוץ לתוך מסובב ואפשר לו להסתובב ב-10 סל"ד למשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. החליפו בתמיסת SDS טרייה של 1% כל 24 שעות במשך תקופה של 72 שעות והקפידו לא לחשוף את השבלול לאוויר במהלך החלפת התמיסה. לאחר מכן, שטפו את השבלול שלוש פעמים באותו בקבוקון נצנוץ למשך 30 דקות כל אחת במי DI.בשלב זה יש לפרק את השבלול. להסרת אבדן, הסר את מי ה-DI הנותרים מבקבוקון הנצנוץ והשאיר מספיק כדי לשמור על השבלול שקוע. כדי להתחיל בהסרת אבדן, הוסף חמישה מיליליטר של 10% EDTA ומי DI לבקבוקון הנצנוץ המכיל את השבלול.הפיצו שני מיליליטר של 10% EDTA במים נטולי יונים דרך השבלול בבקבוקון הנצנוץ באמצעות צינור העברה. הנח את בקבוקון הנצנוץ בחזרה במסובב ואפשר לבקבוקון הנצנוץ להסתובב ב-10 סל"ד למשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. שנה את פתרון ה- 10% EDTA כל 24 שעות במהלך תקופה של 72 שעות.היזהר בעת החלפת פתרונות כך שהשבלול לא ייחשף לאוויר. לאחר מכן שטפו את השבלול שלוש פעמים במשך שעתיים כל אחת עם PBS. בשלב זה יש להסיר את השבלול.לפני החדרת תאים, התחל בדגירה של שבלול מפוזר ונטול אבדן בחממת תרבית תאים של 5% פחמן דו חמצני, 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. כדי להעשיר את השבלול, לאחר מכן הוסיפו טיפה של MSCGM לכל שבלול כדי למנוע התייבשות של שבלול. העבירו אותם לצלחת חדשה של 24 בארות באמצעות צינור העברה.כוונו בעדינות את השבלול באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד כך שהחלונות הסגלגלים והעגולים פונים כלפי מעלה. לאחר מכן באמצעות מזרק אינסולין סטרילי בגודל 28.5 עם צינורות מחוברים, שאב 0.2 מיליליטר של תאי ג'לי של Human Wharton תלויים מחדש. לאחר מכן, מקם צינורות מעל החלון הסגלגל באמצעות מלקחיים עדינים מעוקרים.שופע בעדינות ובאיטיות את השבלול עם 0.2 מיליליטר של תאי ג'לי של וורטון אנושי במשך חמש דקות. שלב השפע הזה חשוב. שפע מוצלח של נוזלים דרך השבלול משפיע מאוד על התוצאה של פרוטוקול זה.לאחר השפע, הוסף 0.8 מיליליטר של MSCGM מחומם מראש של 37 מעלות צלזיוס לבאר המכילה שבלול כדי להביא את הנפח הכולל למיליליטר אחד. חזור על ההליך עבור כל שבלול. שימוש במזרק וצינורות טריים בכל פעם.הניחו את השבלול השופע באינקובטור תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס והחליפו את המדיה שלוש פעמים בשבוע. מוצג כאן דה-סלולריזציה והסרת אבדן מוצלחים של שבלול עכבר ללא תאים מוזרקים. בסך הכל, האנטומיה של השבלול נשמרת עם חללים שנותרו ללא כתמים מטושטשים.להלן התוצאות המייצגות של תאי הג'לי של Human Wharton שתורבו בהצלחה על פיגום שבלול. כתמים מטושטשים בשפע נצפים בכל השבלול ועל פני השטח הגרמיים החיצוניים. בחינה מדוקדקת יותר של סיבובים בודדים מגלה כי מבני שבלול עדינים נשמרים לאחר דה-סלולריזציה והסרת אבדן וכי תאים מוזרקים מחוברים או מקיימים אינטראקציה עם המטריצה החוץ-תאית המקורית של השבלול.דה-סלולריזציה בתרבית תאים לאחר מכן נחקרה גם באמצעות צביעת H&E. השבלול הנטול תאים לא הכיל אף אחד מתאי השבלול המקומי אך שומר על רוב האנטומיה של איבר קורטי מכיוון שהמטריצה החוץ-תאית נשארת. ניתן לצפות בהזרקה בתאים מתורבתים דרך האיבר של קורטי, תוך אינטראקציה עם המטריצה החוץ-תאית הנטולת תאים.לאחר השליטה, שפע התאים לשבלול נטול תאים יכול להימשך כ-10 עד 15 דקות אם השבלול כבר מוכן והכלים הנדרשים מונחים כראוי. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לטפל בשבלול בזהירות מכיוון שהוא שביר. חשוב גם להימנע מהכנסת אוויר לשבלול מכיוון שבועות יחסמו את זרימת הנוזלים במהלך השפע.ניתן ליישם הליך כללי זה על שבלול ממינים אחרים וניתן להזריק גם מגוון רחב של סוגי תאים. זמני דה-סלולריזציה והסרת אבדן ספציפיים ישתנו ככל הנראה אך המושגים הבסיסיים יישארו זהים. ד"ר פיטר סנטי מאוניברסיטת מינסוטה פיתח בתחילה את טכניקת הדה-סלולריזציה ששינינו עבור פרוטוקול זה.אנו מקווים להפוך את הטכניקה שלנו ואת תרבית התאים שלנו על פיגום שבלול לזמינים למהנדסי רקמות אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד בהצלחה עצמות רקתיות ולהסיר אבדן לפני הזרקת תאים לשימוש בניסויי תרבית.

a-protocol-for-decellularizing-mouse-cochleae-for-inner-ear-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי.  אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

קיימות שיטות שונות להחדרת חומרים אוטוטוקסיים לשבלול של מודלים של בעלי חיים. מוצג פרוטוקול כירורגי להעברת חומרים אוטוטוקסיים לגומחת החלון העגול. ההליך אמין, יוצר נגעים תוך-שבלוליים ממוקדים ומונע נזק מכני למיקרו-ארכיטקטורה. ניתן לבחון תיקון/התחדשות עצמית של השבלול.

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

ריסים ראשוניים משפיעים על מסלולי איתות שונים. שבלול היונקים אידיאלי לבחינת איתות קוטביות תאים מישוריים (PCP). תפקוד לקוי של ריסים משפיע על צמיחת השבלול, דפוס התאים וכיוון תאי השערה, קריאות של PCP. מטרתנו היא לנתח איתות PCP בשבלול עכבר באמצעות ניתוח פנוטיפי, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

שתי גישות מיקרו-כירורגיות להעברת תרופות מקומיות לאוזן הפנימית מתוארות כאן ומושוות במונחים של השפעה על פרמטרי שמיעה, ציטוארכיטקטורה של השבלול וביטוי סמנים דלקתיים.

מחקר השוואתי של שיטות שיגור תרופות אל האוזן הפנימית עכבר: Bullostomy Versus הזרקת Transtympanic

מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

במחקר זה, אנו מציגים שיטת הדמיה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להתבונן בתאים הנעים לכיוון רקמה פגומה על ידי דגירה ex vivo עם אפיתל שבלול המכיל את האיבר של קורטי.

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

הפרוטוקול הנוכחי מעדכן פרוטוקולים קודמים ומשלב גישות פשוטות יחסית לגידול צמחי שבלול באיכות גבוהה. זה מספק איסוף נתונים אמין והדמיה ברזולוציה גבוהה בתאים חיים וקבועים. פרוטוקול זה תומך במגמה המתמשכת של חקר תאי האוזן הפנימית.

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

פרוטוקול זה, המיועד למשתמשים מתחילים ברקמת האוזן הפנימית של העכבר, מפרט באופן מקיף שלבים לעיבוד אוזניים פנימיות של עכבר בשלבי התפתחות שונים לצביעה חיסונית של חתך.

הקפאה וצביעה חיסונית של רקמת האוזן הפנימית של עכבר: משלב עוברי לשלב בוגר

למדו שיטה יעילה לדה-סלולריזציה ודה-כלציפיקציה של קוכליאות עכבר לשימוש כפיגומים בהנדסת רקמות האוזן הפנימית. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לחקור את האינטראקציה בין תאים למטריצה החוץ-תאית של הקוכליאה.

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

גלה סרטונים נוספים