פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטה יעילה להסרת תאים והסרת אבדן של שבלול עכברים לשימוש בפיגום ליישומי הנדסת רקמות באוזן הפנימית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי השמיעה והנדסת רקמות כגון, כיצד שבלול תלת מימדי ורכיבים שונים של המטריצה החוץ-תאית משפיעים על התמיינות תאי גזע? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחוקר לחקור כיצד תאים מקיימים אינטראקציה ישירה עם המטריצה החוץ-תאית של השבלול ליצירת אפיתל חושי.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שבידוד העצם הטמפורלי ומנגנון שפע התאים יכולים להיות קשים להמחשה נכונה על סמך תיאורי טקסט בלבד. כדי להתחיל בהליך זה, חצו את הגולגולת במישור האמצעי באמצעות מספריים כירורגיים חדים. לאחר מכן, הסר את רקמת המוח מהגולגולת.

לאחר מכן זהה את העצם הטמפורלית באמצעות נוכחות שורשי העצב השמיעתי והווסטיבולרי בחלק הפנימי של הגולגולת ותעלת האוזן מבחוץ. חותכים בזהירות את הגולגולת כדי לבודד את העצם הטמפורלית משארית הגולגולת. לאחר מכן, הכניסו את המלקחיים העדינים לפתח תעלת האוזן כחמישה מילימטרים כדי שהקצוות לא יסתכנו בניקוב השבלול.

שברו בעדינות את עצם הבולה כך שהיא תישבר. בעזרת מלקחיים עדינים, חטפו את שארית הבולה מהעצם הטמפורלית וחושפים את המבוך הגרמי של השבלול. לאחר מכן, טבלו את העצם הטמפורלית ב-PBS כשהחלונות הסגלגלים והעגולים של השבלול פונים כלפי מעלה.

בעזרת זוג מלקחיים עדינים במיוחד הסר את העורק הסטפדיה העובר דרך הסטפס. לאחר מכן הכניסו קצה אחד של המלקחיים העדינים במיוחד דרך קשת הסטפס שבה עובר העורק והרימו בעדינות את הסטפס כלפי מעלה. לאחר מכן, נקב את החלונות הסגלגלים והעגולים.

לאחר מכן, מקם את הצינור המחובר למזרק בגודל 28.5 מלא PBS מעל החלון הסגלגל. השתמש בשני מילימטרים של 10% אנטיביוטיקה-אטימיקוטית ו-10% פניצילין-סטרפטומיצין ב-PBS דרך השבלול במשך חמש דקות כדי להסיר את הפרילימפה. לאחר מכן הסר והשליך את כל רקמת השריר ושברי העצם שנותרו.

לצורך דה-סלולריזציה, באמצעות צינור ההעברה משוך בעדינות את השבלול לתוך הפיפט כך שהוא פשוט עובר את הקצה החתוך בכמה מילימטרים. לאחר מכן, הוציאו את השבלול לתוך בקבוקון הנצנוץ המלא בתמיסת SDS של 1%. הפיצו שני מיליליטר של 1% SDS במים נטולי יונים דרך השבלול בבקבוקון הנצנוץ באמצעות צינור העברה.

הנח את בקבוקון הנצנוץ לתוך מסובב ואפשר לו להסתובב ב-10 סל"ד למשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. החליפו בתמיסת SDS טרייה של 1% כל 24 שעות במשך תקופה של 72 שעות והקפידו לא לחשוף את השבלול לאוויר במהלך החלפת התמיסה. לאחר מכן, שטפו את השבלול שלוש פעמים באותו בקבוקון נצנוץ למשך 30 דקות כל אחת במי DI.

בשלב זה יש לפרק את השבלול. להסרת אבדן, הסר את מי ה-DI הנותרים מבקבוקון הנצנוץ והשאיר מספיק כדי לשמור על השבלול שקוע. כדי להתחיל בהסרת אבדן, הוסף חמישה מיליליטר של 10% EDTA ומי DI לבקבוקון הנצנוץ המכיל את השבלול.

הפיצו שני מיליליטר של 10% EDTA במים נטולי יונים דרך השבלול בבקבוקון הנצנוץ באמצעות צינור העברה. הנח את בקבוקון הנצנוץ בחזרה במסובב ואפשר לבקבוקון הנצנוץ להסתובב ב-10 סל"ד למשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. שנה את פתרון ה- 10% EDTA כל 24 שעות במהלך תקופה של 72 שעות.

היזהר בעת החלפת פתרונות כך שהשבלול לא ייחשף לאוויר. לאחר מכן שטפו את השבלול שלוש פעמים במשך שעתיים כל אחת עם PBS. בשלב זה יש להסיר את השבלול.

לפני החדרת תאים, התחל בדגירה של שבלול מפוזר ונטול אבדן בחממת תרבית תאים של 5% פחמן דו חמצני, 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. כדי להעשיר את השבלול, לאחר מכן הוסיפו טיפה של MSCGM לכל שבלול כדי למנוע התייבשות של שבלול. העבירו אותם לצלחת חדשה של 24 בארות באמצעות צינור העברה.

כוונו בעדינות את השבלול באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד כך שהחלונות הסגלגלים והעגולים פונים כלפי מעלה. לאחר מכן באמצעות מזרק אינסולין סטרילי בגודל 28.5 עם צינורות מחוברים, שאב 0.2 מיליליטר של תאי ג'לי של Human Wharton תלויים מחדש. לאחר מכן, מקם צינורות מעל החלון הסגלגל באמצעות מלקחיים עדינים מעוקרים.

שופע בעדינות ובאיטיות את השבלול עם 0.2 מיליליטר של תאי ג'לי של וורטון אנושי במשך חמש דקות. שלב השפע הזה חשוב. שפע מוצלח של נוזלים דרך השבלול משפיע מאוד על התוצאה של פרוטוקול זה.

לאחר השפע, הוסף 0.8 מיליליטר של MSCGM מחומם מראש של 37 מעלות צלזיוס לבאר המכילה שבלול כדי להביא את הנפח הכולל למיליליטר אחד. חזור על ההליך עבור כל שבלול. שימוש במזרק וצינורות טריים בכל פעם.

הניחו את השבלול השופע באינקובטור תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס והחליפו את המדיה שלוש פעמים בשבוע. מוצג כאן דה-סלולריזציה והסרת אבדן מוצלחים של שבלול עכבר ללא תאים מוזרקים. בסך הכל, האנטומיה של השבלול נשמרת עם חללים שנותרו ללא כתמים מטושטשים.

להלן התוצאות המייצגות של תאי הג'לי של Human Wharton שתורבו בהצלחה על פיגום שבלול. כתמים מטושטשים בשפע נצפים בכל השבלול ועל פני השטח הגרמיים החיצוניים. בחינה מדוקדקת יותר של סיבובים בודדים מגלה כי מבני שבלול עדינים נשמרים לאחר דה-סלולריזציה והסרת אבדן וכי תאים מוזרקים מחוברים או מקיימים אינטראקציה עם המטריצה החוץ-תאית המקורית של השבלול.

דה-סלולריזציה בתרבית תאים לאחר מכן נחקרה גם באמצעות צביעת H&E. השבלול הנטול תאים לא הכיל אף אחד מתאי השבלול המקומי אך שומר על רוב האנטומיה של איבר קורטי מכיוון שהמטריצה החוץ-תאית נשארת. ניתן לצפות בהזרקה בתאים מתורבתים דרך האיבר של קורטי, תוך אינטראקציה עם המטריצה החוץ-תאית הנטולת תאים.

לאחר השליטה, שפע התאים לשבלול נטול תאים יכול להימשך כ-10 עד 15 דקות אם השבלול כבר מוכן והכלים הנדרשים מונחים כראוי. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לטפל בשבלול בזהירות מכיוון שהוא שביר. חשוב גם להימנע מהכנסת אוויר לשבלול מכיוון שבועות יחסמו את זרימת הנוזלים במהלך השפע.

ניתן ליישם הליך כללי זה על שבלול ממינים אחרים וניתן להזריק גם מגוון רחב של סוגי תאים. זמני דה-סלולריזציה והסרת אבדן ספציפיים ישתנו ככל הנראה אך המושגים הבסיסיים יישארו זהים. ד"ר פיטר סנטי מאוניברסיטת מינסוטה פיתח בתחילה את טכניקת הדה-סלולריזציה ששינינו עבור פרוטוקול זה.

אנו מקווים להפוך את הטכניקה שלנו ואת תרבית התאים שלנו על פיגום שבלול לזמינים למהנדסי רקמות אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד בהצלחה עצמות רקתיות ולהסיר אבדן לפני הזרקת תאים לשימוש בניסויי תרבית.