Name: סינתזה והערכה של מעכב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי מבוססי רותניום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: למדו לסנתז ולטהר מעכב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי מבוסס רותניום. שיטה זו מייצרת אנלוג Ruthenium 360 טהור וחזק פי עשרה מהמסחרי, המאפשר מחקר מתקדם בביולוגיית סידן מיטוכונדריאלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת קורנל. עבודה זו עשוי להשתמש במרכז קורנל עבור חומרים משותפים מכוני מחקר, אשר נתמכים באמצעות תוכנית ה-NSF MRSEC (גרנט DMR-1120296). S.R.N. מאשר תמיכה של ה-NSF בוגר מחקר לאגודה (גרנט DGE - 1650441), ד ר דייב Holowka לקבלת סיוע עם הניסויים סידן. כל דעה, ממצאים, מסקנות או המלצות לידי ביטוי בחומר זה הם אלה של המחברים (s), אינן משקפות בהכרח את הנופים של הקרן הלאומית למדע.

הערה : מרוכז חומצות ובסיסים המשמשים סינתזה זו. השתמש כל נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע התגובה כולל השימוש של פקדים הנדסה (fume הוד), ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) כולל בטיחות משקפיים, כפפות, חלוק המעבדה, באורך מלא מכנסיים ונעליים סגורות.
 1-הכנת [(או 2) (NH 3) 4 Ru (ממוצע-O) Ru (NH 3) 4 (או 2)] Cl 5 <ol><li>סינתזה של Cl [Ru (NH 3) 5 קלרנית] 2 12 <ol><li>g 1.00 התמוססות של RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru לפי משקל, 4.1 mmol) ב 5 מ של H 2 O. מגניב הפתרון חום כהה 0 ° C באמבט קרח. להוסיף 11 מ ל (0.23 mol) של 80% הידרזין מימה פתרון באופן dropwise. התגובה הראשונית תהיה נמרצת עם הגז האבולוציה, וכתוצאה מכך פתרון חום. תן הפתרון שיתקבל מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 16 שעות; הפתרון הסופי יהיה כהה חא 
		זהירות: הידרזין היא בחריפות רעילים ומסרטנים. בנוסף, נטול מים צורות של ריאגנט הזה הם חומר נפץ. כמו תמיד, השתמש וקולטי עיקרון השוויון הפוליטי, fume המתאימה בעת הטיפול. לא להתרכז אלה פתרונות ליובש.</li>
		<li>כדי פתרון זה, להוסיף כ 5-10 מ של HCl מרוכזת כדי להתאים את ה-pH ל- 2. בשלב זה, הפתרון יהיה צהוב-חום בצבע.</li>
		<li>חום פתרון זה ב 105 ° C תוך ערבוב במשך 1-2 h. מוצק צהוב לזרז מתוך פתרון. כאשר אין יותר לזרז בעליל טפסים, מסירים מהאש.</li>
		<li>לאפשר תערובת התגובה כדי להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מקם באמבט קרח 0 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לאסוף את המוצק צהוב על-ידי סינון ואקום לשטוף עם 5 מ ל כל אחד אתנול וביו -דיאתיל אתר.</li>
		<li>נמסים לחלוטין את המוצר הגולמי ב- 15-25 מ של מים חמים. מקררים 10 מ"ל של פתרון HCl מרוכזת בבקבוקון מסנן על-ידי הצבתו באמבט קרח. לסנן את הפתרון צהוב בתוך תמיסת HCl צוננת לזירוז משקעים של מוצק טהור צהוב חיוור. לסנן את התמיסה ולשטוף עם 5 מ ל כל אחד של 0.5 M HCl, אתנול ואתר.</li>
		<li>Characterize מתחם באמצעות IR ספקטרוסקופיה. לאמת טוהר על ידי זיהוי תדרי מתיחה-3226 ס מ -1 ס מ 1604 -1, 1297 ס מ -1, 801 ס מ -1. הטומאה קטין נפוצים ב 2069 ס מ -1 מוקצה [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.</li>
	</ol></li> <li>סינתזה של Cl [(או 2) (NH 3) 4 Ru Ru (ממוצע-O) (NH 3) 4 (או 2)] 5 <ol><li>להמיס 100 מ ג (0.34 mmol) [Ru (NH 3) 5 קלרנית] Cl 2 ב- 50 מ של 1 מ' NH 4 או מגרגרי לחץ עגול עם תחתית הקיר כבד 200 מ. ברפיון שווי הבקבוק עם פקק, לחמם את תערובת התגובה ב 75 מעלות צלזיוס במשך 6-אייץ להסיר מהאש ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 4 ימים להניב פתרון ירוק כהה- 
		זהירות! חימום של תוצאות כלי אטום שיצטברו לחץ. הקפד להשתמש כלי זכוכית לחץ-בטוח המתאים. התגובה הזו, המטרה של איטום הספינה היא למזער אובדן של NH גז 3. לכן, למקם את פקק באופן רופף כדי לאפשר את שחרורו של לחץ עודף.</li>
	</ol></li> <li>טיהור באמצעות כרומטוגרפיה קטיונים <ol><li>בגביע, 25 מ ל להשעות 5 g-קטיון שרף (למשל, Dowex 50WX2 200-400 מחוט (טופס H +) 10 מ ל 0.1 M HCl.</li>
		<li>טען הזה slurry לתוך עמודה 10 מ"ל (בקוטר 10 מ מ, גובה 15 ס מ) מודבקת עם מאגר הממס 50 מ. לשטוף את השרף כ 20-30 מ של 0.1 M HCl, עד eluate חסר צבע.</li>
		<li>להחזיר הפתרון הירוק התגובה מבודד בשלב 1.2.1. כדי פתרון זה, להוסיף HCl מרוכזת כדי להתאים את ה-pH ל- 2, ובשלב צבע פתרון משתנה לחום.</li>
		<li>טען הפתרון acidified אל העמודה שרף-קטיון שהכין בשלב 1.3.2 בעדינות pipetting זה על גבי השרף. תן את eluate לחלוטין לנקז, להמשיך לטעון את הפתרון. חזור על תהליך זה עד הפתרון כולו נוספה. החלק העליון של השרף יהיה חום כהה/שחור. השרף תגרום להקטנת נפח מעט.</li>
		<li>שימוש חרוזי זכוכית כדי לכסות את החלק העליון של השרף. אלה ימנע השרף שמפריעים כאשר פתרונות חדשים מתווספים.</li>
		<li>Elute את העמודה עם 20 מ של 1 M HCl.</li>
		<li>Elute את העמודה עם ריכוז HCl מוגברת 1.5 M (&#8776; 50 מ ל). פתרון צהוב יתחיל להוריד את העמודה. להעלות את ריכוז HCl עד 2 מ' ולהמשיך eluting עד eluate חסר צבע או ירוק-צהוב חיוור מאוד. הנפח הכולל של 150-200 מ ל יידרש לתהליך זה.</li>
		<li>להגדיל את ריכוז HCl עד 2.5 מ' (20-50 מ"ל). לאסוף את eluate כשברים במבחנות. להגדיל את 3 M HCl. המוצר elute עמודה כמו פתרון ירוק-חום. שבר אדום-חום יכול גם להתחיל תיפרדי העמודה. כמו שברים אלה הם זיהומים האדומים מחומצן רותניום, לא בריכה עם שברים ירוק-חום.</li>
	</ol></li> <li>איפיון ואימות של טוהר [(או 2) (NH 3) 4 Ru Ru (ממוצע-O) (NH 3) 4 (או 2) Cl 5 <ol><li>מבחן כל השברים מן שלב 1.3.8. על ידי UV-vis ספקטרוסקופיה. כדי לבצע משימה זו, להוסיף 100 µL של השבר נתון לתוך 2 מ"ל של 3 מ' NH3, לנתח ידי UV-vis ספקטרוסקופיה. שברים המכיל מוצר טהור תהיה להקה גדולה ספיגת ב 360 nm ו של ספיגת פחות אינטנסיבי על 600 ננומטר. ספיגת-480 או 533 ננומטר הוא מרמז על האדומים מחומצן רותניום וזוהמה רותניום אדום, בהתאמה.</li>
		<li>מאגר שברים המכיל מוצר טהור, מתאדים הפתרון ליובש אידוי רוטרי. המוצר יהיה מבודד כמו מוצק ירוק-חום. התשואות הם בדרך כלל גודל 5-15 מ ג (10-20% תשואה). יחיד-גבישים, מתאים עקיפה של קרני רנטגן, יכולה להיות מושגת על ידי פעפוע אדי אתנול לתוך פתרונות מימית של המתחם-</li>
		<li>כדי לוודא טוהר, לנתח את המתחם על ידי UV-vis ספקטרוסקופיה בפתרון של תמיסת באגירה פוספט pH 7.4 (PBS). טוהר עשויים להידרש, על ידי לקיחת היחס בעוצמה של 360 nm ו 600 nm פסגות. יחס זה הוא 31 עבור תרכובת טהורה. עבור תרכובות טמא, היחס יהיה קטן יותר.</li>
		<li>לנתח את הדגימה בתוך המדינה מוצק ידי ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום. להקות האבחון הינם 3234 ס מ -1 ס מ 3151 -1, 1618 ס מ -1, 1313 ס מ -1, 815 ס מ -1. להקות הטומאה נפוצים הם ראו ב 1762 ס מ -1 ו- 1400 ס מ -1, האופייניים NH 4 Cl. רותניום אדום ניתן לזהות על ידי להקות 1404 ס מ -1, 1300 ס מ -1, 1037 ס מ -1 ו ס מ 800 -1.</li>
	</ol></li> <li>הערכה של עיכוב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי על-ידי קרינה פלואורסצנטית ספקטרוסקופיה זהירות! ההליכים הבאים שימוש בתרבית של תאים. העבודה צריכה להתבצע בברדסים זרימה שכבתית המתאימה שאושרו עבור בטיחות ביולוגית ברמה 2 מחקר (BSL2). 
	&#8203; הערה: [(או 2) (NH 3) 4 Ru Ru (ממוצע-O) (NH 3) 4 (או 2) Cl 5 להתייחס כמו [Ru] בסעיף זה <ol><li>להפוך buffered גלוקוז המכיל תמיסת מלח (BGSS) התקשורת וזמינותו. BGSS הוא פתרון הכוללת 110 מ מ אשלגן כלורי, 2 PO 1 מ מ ח' 4, 1 מ MgCl 2, 20 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), succinate נתרן 5 מ מ, 30 מיקרומטר אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-חומצה tetraacetic (EGTA). לשלב את הכל חוץ EGTA, להתאים את ה-pH ל 7.4. להוסיף EGTA והתאם pH ל 7.4. עבור 50 מ של מדיה assay להוסיף 0.5 מ"ל של גלוקוז 1 מ"ג/מ"ל.</li>
		<li>הלה התרבות התאים ב- 500 ס מ 2 צלחות פטרי ב- Dulbecco &#39; s בינוני נשר שונה (DMEM) עם 10% עוברית שור סרום (FBS) ב חממה humidified עם 5% CO 2-37 ° C. להגביר את הלה גדל התאים ב- 100 מ מ פטרי על ידי זריעה אותם בצלחת פטרי 2 ס מ 500. 115 מ ל שאמצעי האחסון מדיה סה כ צלחת גדולה. כל מנה גדולה תניב כ-18 מיליון תאים, מספיק בשביל שני ניסויים ספקטרוסקופיה של זריחה.
		<ol><li>לגדל את התאים עד שיגיעו 90-95% confluency. להסיר מדיה, ולשטוף את התאים עם 15 מ"ל pH 7.4 PBS. להוסיף 15 מ"ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) של 1 מ מ ב- PBS, תקופת דגירה של 10 דקות לנתק את התאים. להעביר את התאים 14 מ"ל סביב צינורות בז התחתון</li></ol></li> <li>לספור תאים באמצעות trypan blue ו- hemocytometer עם מיקרוסקופ הפוכה, ולחשב את המספר הכולל של תאים ונפח של התקשורת צריכה להגיע 7.5 מיליון תאים לכל אמצעי אחסון 1.8 mL בינוני. Centrifuge התאים 10 דקות ב × 5310 ג'י Decant תגובת שיקוע והוסף את הנפח מחושב של BGSS. Resuspend תאים בעדינות.
		<ol><li>בשביל זה assay, הכנת מלאי פתרונות של 40 מ מ digitonin ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), 1 מ מ סידן ירוק-5N H 2 O, ו- 10 מ"מ CaCl 2 H 2 O. [Ru] מניות פתרונות, מוכן במים טהורים, נע בין 1-3 מ מ. 
			&#8203; הערה: סידן ירוק-5N הוא רגישים לאור. לאחסן בחושך, למזער חשיפה קלה.</li>
		</ol></li> <li>התקנה של fluorimeter כדי לרגש-506 nm וקריאה הפליטה-532 ננומטר עם cuvette-מחזיק נשלטת על 37 ° C. הכן cuvette אקריליק עם בר מערבבים או גלגל, ההשעיה תא 1.8 mL מ 1.5.2 לעיל, 1.8 µL digitonin פתרון, 3.6 & #181; L סידן ירוק-5N (פתרון), µL 9 [Ru] (עבור פתרון מניות 1 מ"מ, 5 מיקרומטר הריכוז הסופי). דגירה תאים למשך 15 דקות fluorimeter.
		<ol><li>לקרוא את הנתונים כיחס עירור/פליטה במקום בליעת raw. פרקטיקה זו ממזערת את השגיאות המשויכות תנודות עוצמת מקור האור.</li>
			<li>לבצע את הניתוח הראשון מדגם בהיעדר [Ru] כדי למדוד את ההשפעה של התוספת של CaCl 2 על התגובה של התאים.</li>
			<li>בגין ניתוח על fluorimeter עם ההגדרות המתוארות 1.5.4. חכו כ 2 דקות כדי ליצור בסיס יציב פליטה, ולאחר מכן להוסיף µL 1.8 CaCl 2 (10 מיקרומטר ריכוז סופי). עוצמת הפליטה יגדיל מיידית על התוספת של CaCl 2 ולאחר מכן תרקב במשך דקות יוני הסידן הזנת המיטוכונדריה. המתן לסיום הריקבון (&#8776; 5 דקות). להוסיף בולוסים סידן נוספים כדי לקבוע את התגובה ספיגת סידן מיטוכונדריאלי של תאים לא שטופלו [Ru].</li>
		</ol></li> <li>ב cuvette אחר המכיל 5 מיקרומטר [Ru], חזור על הניסוי כמתואר לעיל ב- 1.5.4.3. בנוכחות החומר המדכא, עוצמת הפליטה להגדיל, אבל לא ריקבון. התבוננות זו מרמזת על חסם ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enjoy+the+trip%3A+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li>
<li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li>
<li>Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li>
<li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244437951_The_component_of_ruthenium_red_responsible_for_inhibition_of_mitochondrial_calcium_ion_transport_Spectra_electrochemistry_and_aquation_kinetics_Crystal_structure_of_m-O-HCO2NH34Ru2Cl_3">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2%2B+Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360%2C+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li>
<li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v67-220#.WW5AYYjyvIU">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25631032">Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף

סידן מיטוכונדריאלי ספיגת מעכב [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2) Cl5 יכול להיות מסונתז מן [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2, ruthenium(III) ידועה החל חומר, כפי שמתואר בהליך זה. הסינתזה של [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 מושגת בקלות עם קושי קלה. לאחר ערבוב RuCl3 עבור 16 h ב הידרזין מימה, ה-pH של התמיסה צריך להיות מותאם לערך של 2 עם HCl. הירידה pH הוא קריטי כדי להשיג את המוצר הרצוי. אם ר...

סידן מיטוכונדריאלי הוא מווסת מפתח עבור מספר תהליכים חיוניים לתפקוד תאים נורמליים, כולל הפקת אנרגיה אפופטוזיס. 1 , 2 , 3 uniporter סידן מיטוכונדריאלי (MCU), חלבון טרנספורטר יון ונותק מיטוכונדריאלי ממברנה פנימית, מווסת זרם של יונים של סידן לתוך המיטוכונדריה. 4 , 5 , 6 מעכבי כימי של לפשעים חמורים הם כלי רב ערך עבור המשך המאמצים לחקור את תפקוד ואת תפקידי הסלולר לשנע חלבון וסידן מיטוכונדריאלי הזה. מתחם [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, הוא אחד מעכבי סלקטיבי ידוע רק עבור לפשעים חמורים עם ערךד K המדווחת של 24 מיקרומטר.7 ,8,9,10 מתחם זה ממוקם הטומאה נפוצה מצאו ניסוחים מסחרי של רותניום אדום (RuRed), di triruthenium-ממוצע-אוקסו לגשר hexacation של הנוסחה [(NH3) 5 (ממוצע-O) Ru Ru (NH3)4(ממוצע-O) Ru (NH3)5)]6 +, אשר שימש גם בתור מעכב ספיגת סידן. למרות Ru360 זמין מסחרית, זה מאוד יקר. יתר על כן, סינתזה של בידוד של Ru360 קוראים תיגר על ידי טיהור קשה נהלים ושיטות אפיון דו-משמעי
לאחרונה דיווחנו הליכים חלופיים כדי לגשת Ru360 אנלוגי, [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2) Cl5. 11 מתחם זה מעכב לפשעים חמורים עם זיקה גבוהה, הדומה Ru360. ב פרוטוקול זה, נתאר שלנו סינתזה היעיל ביותר של מתחם זה, המתחיל [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2. טיהור של המוצר באמצעות שרף קטיונים חומציים מאוד מפורט, יחד עם מלכודות נפוצות עבור הליך זה. אנחנו גם להציג שיטות אפיון והערכת טוהר מורכבים, ניסחו בגישה פשוטה לבדיקת יעילותה על חסימת ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי.

<table><tbody><tr><td>רותניום טריכלוריד הידראט</td><td>לחץ כימי</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית מרוכזת</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום הידרוקסיד מרוכז</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>סידן ירוק 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סוקסינט</td><td>אלפא Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>אולדריץ'</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 בקבוק תחתון עגול</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>פקק זכוכית</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>עמוד זכוכית 10 מ"מ x 15 ס"מ עם מאגרים</td><td>מותאם אישית - בדומה לעמודי Chemglass</td><td>בדומה ל- CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בז תחתון עגול</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 ס"מ2 צלחות</td><td>פטרי קורנינג</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>קובטות אקריליות</td><td>VWR&nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר UV-Vis זריז</td><td>דגם קארי 8454&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופלואורמטר</td><td>SLM דגם 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר IR</td><td>Bruker Hyprion FTIR עם חיבור</td><td></td><td></td>ATR</tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>ALC דגם PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור הפוך</td><td>VWR&nbsp;</td><td>ברקוד 89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

סינתזה והערכה של מעכב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי מבוססי רותניום

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

אנו מפרטים את סינתזה ולטיהור סידן מיטוכונדריאלי מעכב ספיגת, [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)]5 +. הסינתזה אופטימיזציה של מתחם זה מתחילה [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 ב 1 מ' NH4או במיכל סגור, מניב פתרון ירוק. טיהור מתבצע עם כרומטוגרפיה קטיונים. מתחם זה מאופיין, אומתו ספקטרוסקופיה מול UV ו- IR כדי להיות טהורים. המאפיינים המעכבת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי הם העריכו בתאים הלה permeabilized על-ידי קרינה פלואורסצנטית ספקטרוסקופיה.

שיטה זו מתארת סינתזה של סידן מיטוכונדריאלי ספיגת מעכב [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)] Cl5 החל מ [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2, חומר המוצא ידועה ruthenium(III). [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 מאופיין ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום, עם הלטראלית ב 3200 ס מ-1, 1608 ס מ-1, 1298 ס מ-1ו- 798 ס מ-1 (איור...

פרוטוקול עבור סינתזה, טיהור, אפיון מעכב מבוססי רותניום של ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי מוצג. הליך כדי להעריך את יעילותה בתאים בתרבית של permeabilized הוא הפגין.

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

המטרה הכוללת של הסינתזה והטיהור היא לייצר בקלות יחסית אנלוגי רותניום 360 המשמש במבחני ספיגת סידן מיטוכונדריאלי שהוא יעיל פי 10 מרותניום 360 הזמין מסחרית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסידן המיטוכונדריאלי על ידי מתן מעכב טהור של ספיגת סידן מיטוכונדריאלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתוצר הסופי הוא גם חזק מאוד וגם טהור.אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהטיהור דורש זמן וסבלנות. המפיקה תדגים שרה נתן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל הליך זה בסינתזה של פנטאמין כלורו רותניום דיכלוריד כמתואר בפרוטוקול הטקסט.ממיסים 100 מיליגרם של פנטאמין כלורו רותניום דיכלוריד ב-50 מיליליטר של תמיסת אמוניום הידרוקסיד מולרית אחת בבקבוק תחתון עגול של 200 מיליליטר. מכסים את הבקבוק באופן רופף עם פקק זכוכית ומחממים את תערובת התגובה בחום של 75 מעלות צלזיוס למשך שש שעות. חימום כלי אטום גורם להצטברות לחץ.ודא שפקק הזכוכית רופף כדי לאפשר שחרור לחץ עודף. לאחר שש שעות מסירים את תערובת התגובה מהאש. ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך ארבעה ימים כדי להניב תמיסה ירוקה כהה.כדי לטהר את הטרנס-דיאקווה אוקטו אמין mu-oxo diruthenium pentachloride המתקבל על ידי כרומטוגרפיה של חילופי קטיונים, השעו תחילה חמישה גרם של שרף חילופי קטיון רשת ב-10 מיליליטר של 0.1 HCL מולארי בכוס של 25 מיליליטר. טען את התרחיץ הזה לתוך עמודה של 10 מיליליטר המודבקת במאגר ממס של 50 מיליליטר. שטפו את השרף עם כ-20 עד 30 מיליליטר של 0.1 HCL מולארי עד שהנוזל חסר צבע.לאחר מכן, הוסיפו HCL מרוכז לתמיסת התגובה הירוקה שבודדה קודם לכן כדי להתאים את ה-PH לשניים, ובשלב זה צבע התמיסה משתנה לחום. טען את התמיסה המחומצת הזו לעמוד שרף חילופי הקטיונים על ידי פיפטינג בעדינות על גבי השרף. תן לאלוט להתנקז לחלוטין והמשיך לטעון את התמיסה.חזור על תהליך זה עד להוספת הפתרון כולו. החלק העליון של השרף יהיה חום כהה או שחור. השרף יקטן מעט בנפח.לאחר מכן, כסו את החלק העליון של השרף בחרוזי זכוכית כדי למנוע את הפרעת השרף בעת הוספת פתרונות חדשים. הסר את העמוד עם 20 מיליליטר של HCL טוחנת אחת. לאחר מכן יש להוציא את העמוד עם 50 מיליליטר של ריכוז HCL מוגבר של 1.5 טוחנת.תמיסה צהובה תתחיל לרדת מהעמודה. לאחר מכן, הגדילו את ריכוז ה-HCL לשתי טוחנות והמשיכו לנבול עם 150 עד 200 מיליליטר. הנוזל יתחיל כצהוב חיוור מאוד ויעבור לצהוב בוהק.המתן עד שהנוזל המגיע מהעמוד שוב חיוור מאוד. סבלנות היא קריטית בשלב זה. הנוזל חייב להיות חיוור מאוד.הגדל את ריכוז ה-HCL עוד יותר ל-2.5 טוחנות. אסוף את הנוזל כשברים במבחנות. לבסוף הגדל את הריכוז לשלוש HCL מולארי.המוצר ייפלט מהעמוד כפתרון ירוק-חום. שבר אדום-חום עשוי גם להתחיל לרדת מהעמוד. שברים אלה הם זיהומים חומים רותניום ואין לאגד אותם עם השברים הירוקים-חומים.כדי לבדוק את כל השברים על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis, הוסף 100 מיקרוליטר של שבר נתון לשני מיליליטר של אמוניה מולארית. לאחר מכן נתח את התערובת על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis. לשברים המכילים מוצר טהור תהיה רצועת ספיגה גדולה ב-360 ננומטר וספיגה פחות אינטנסיבית ב-600 ננומטר.ספיגה ב-480 ננומטר מעידה על חום רותניום וספיגה ב-533 ננומטר מייצגת זיהומים אדומים של רותניום. זיהומים אחרים נראים בספיגה של פחות מ-300 ננומטר. שברים המכילים מוצר טהור ומאדים את התמיסה ליובש על ידי אידוי סיבובי לפני ניתוח הדגימה במצב מוצק על ידי ספקטרוסקופיה IR.המשך להעריך את עיכוב ספיגת הסידן המיטוכונדריאלי על ידי ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית כמפורט בפרוטוקול הטקסט. ספקטרום UV-Vis של טרנס-דיאקווה אוקטו אמין מו-אוקסו דירותניום פנטכלוריד מטוהר מאופיין בספיגה העיקרית והמינורית ב-360 ננומטר ו-600 ננומטר בהתאמה. לעומת זאת, תערובת לא טהורה מציגה רצועות ספיגה ב-533 ננומטר מזיהומים אדומים רותניום וב-275 עד 300 ננומטר מחומר המוצא.לאפיון מצב מוצק באמצעות ספקטרוסקופיה אינפרא אדום יש את המתיחות הצפויות מהאמינים. כמו גם רותניום חמצן רותניום נמתח ב-850 סנטימטרים הפוכים. תאי HeLa שעברו פרמבל שטופלו בצבע פלואורסצנטי רגיש לסידן וטרנס-דיאקווה אוקטו אמין mu-oxo diruthenium pentachloride מראים עיכוב של ספיגת סידן למיטוכונדריה.בזמן ניסיון ההליך, חשוב לזכור לאפשר לשברים להתרוקן לחלוטין. סבלנות תניב מוצר טהור. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז, לטהר ולאפיין את אנלוגי רותניום 360 החזק הזה.רמות הסידן במיטוכונדריה מווסתות מגוון רחב של תהליכים בין-תאיים, כולל ביו-אנרגטיקה ומוות תאי מבוקר. ניתן ליישם את המעכב המופק משיטה זו במחקרים כדי להבין את תפקידה של ביולוגיה של סידן מיטוכונדריאלי בתיווך תהליכים ביולוגיים אחרים. אל תשכח שעבודה עם חומצות ובסיסים מרוכזים היא קורוזיבית ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת PPE מתאים בעת ביצוע הליך זה.

synthesis-evaluation-ruthenium-based-mitochondrial-calcium-uptake

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca...

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

סרטון זה מתאר בדיקה מבוססת קורא צלחות למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי במיטוכונדריה מבודדת. הבדיקה מנתחת את האות הפלואורסצנטי של צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן כדי לחקור את הקינטיקה של ספיגת סידן במיטוכונדריה ועומס יתר של סידן.

בדיקת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי: שיטה מבוססת קורא צלחות למדידת ספיגת סידן במיטוכונדריה מבודדים

סרטון זה מתאר בדיקה מבוססת הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי בתאים בתרבית. הבדיקה משתמשת בצבע פלואורסצנטי רגיש לסידן Rhod-2/AM כדי למדוד את הסידן המיטוכונדריאלי בתאים בתרבית חדירה.

בדיקת זרימת סידן למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי בתאים בתרבית

מתחמי phosphine רותניום נמצאים בשימוש נרחב לתגובות קטליטי הומוגנית כמו hydrogenations. הסינתזה של סדרה של מתחמי רותניום tridentate רומן נושאות יגנד N -triphos N (CH 2 PPH 2) 3 מדווחת. בנוסף, התגובה של stoichiometric מורכב dihydride Ru- -triphos N עם חומצת levulinic מתוארת.

הסינתזה, אפיון ותגובתיות של סדרה של רותניום<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; מכלולים

המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ Ψm) כדי לעקל סידן (Ca 2 +), המאפשר להם לעצב Ca cytosolic 2+ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca 2 + ו ΔΨ מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

פרוטוקול זה שואפת לתאר שיטה לבחון על Ca2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca - עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות של המיטוכונדריה מבודד של SH-SY5Y תאים צעד אחר צעד.

Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת Assay ו- Ca2 +-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca2 + זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca2 + ייבוא assay באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca2 + לצבוע רוד-2/AM.

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

פרוקטוקול זה נועד לספק שיטה במבחנה ובהדמיה של ויוו מיטוכונדריאלי Ca2+ באסטרוציטים ונוירונים.

הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

הסתגלות מטבולית היא בסיסית עבור תאי T כפי שהיא מכתיבה בידול, התמדה, וציטוטוקסיות. כאן, פרוטוקול ממוטב לניטור נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים מובחנים ex vivo .

ניטור בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים מובחנים בציטוקינים

למדו לסנתז ולטהר מעכב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי מבוסס רותניום. שיטה זו מייצרת אנלוג Ruthenium 360 טהור וחזק פי עשרה מהמסחרי, המאפשר מחקר מתקדם בביולוגיית סידן מיטוכונדריאלי.

סינתזה והערכה של מעכב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי מבוססי רותניום

גלה סרטונים נוספים