סינתזה והערכה של מעכב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי מבוססי רותניום

המטרה הכוללת של הסינתזה והטיהור היא לייצר בקלות יחסית אנלוגי רותניום 360 המשמש במבחני ספיגת סידן מיטוכונדריאלי שהוא יעיל פי 10 מרותניום 360 הזמין מסחרית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסידן המיטוכונדריאלי על ידי מתן מעכב טהור של ספיגת סידן מיטוכונדריאלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתוצר הסופי הוא גם חזק מאוד וגם טהור.

אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהטיהור דורש זמן וסבלנות. המפיקה תדגים שרה נתן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל הליך זה בסינתזה של פנטאמין כלורו רותניום דיכלוריד כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

ממיסים 100 מיליגרם של פנטאמין כלורו רותניום דיכלוריד ב-50 מיליליטר של תמיסת אמוניום הידרוקסיד מולרית אחת בבקבוק תחתון עגול של 200 מיליליטר. מכסים את הבקבוק באופן רופף עם פקק זכוכית ומחממים את תערובת התגובה בחום של 75 מעלות צלזיוס למשך שש שעות. חימום כלי אטום גורם להצטברות לחץ.

ודא שפקק הזכוכית רופף כדי לאפשר שחרור לחץ עודף. לאחר שש שעות מסירים את תערובת התגובה מהאש. ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך ארבעה ימים כדי להניב תמיסה ירוקה כהה.

כדי לטהר את הטרנס-דיאקווה אוקטו אמין mu-oxo diruthenium pentachloride המתקבל על ידי כרומטוגרפיה של חילופי קטיונים, השעו תחילה חמישה גרם של שרף חילופי קטיון רשת ב-10 מיליליטר של 0.1 HCL מולארי בכוס של 25 מיליליטר. טען את התרחיץ הזה לתוך עמודה של 10 מיליליטר המודבקת במאגר ממס של 50 מיליליטר. שטפו את השרף עם כ-20 עד 30 מיליליטר של 0.1 HCL מולארי עד שהנוזל חסר צבע.

לאחר מכן, הוסיפו HCL מרוכז לתמיסת התגובה הירוקה שבודדה קודם לכן כדי להתאים את ה-PH לשניים, ובשלב זה צבע התמיסה משתנה לחום. טען את התמיסה המחומצת הזו לעמוד שרף חילופי הקטיונים על ידי פיפטינג בעדינות על גבי השרף. תן לאלוט להתנקז לחלוטין והמשיך לטעון את התמיסה.

חזור על תהליך זה עד להוספת הפתרון כולו. החלק העליון של השרף יהיה חום כהה או שחור. השרף יקטן מעט בנפח.

לאחר מכן, כסו את החלק העליון של השרף בחרוזי זכוכית כדי למנוע את הפרעת השרף בעת הוספת פתרונות חדשים. הסר את העמוד עם 20 מיליליטר של HCL טוחנת אחת. לאחר מכן יש להוציא את העמוד עם 50 מיליליטר של ריכוז HCL מוגבר של 1.5 טוחנת.

תמיסה צהובה תתחיל לרדת מהעמודה. לאחר מכן, הגדילו את ריכוז ה-HCL לשתי טוחנות והמשיכו לנבול עם 150 עד 200 מיליליטר. הנוזל יתחיל כצהוב חיוור מאוד ויעבור לצהוב בוהק.

המתן עד שהנוזל המגיע מהעמוד שוב חיוור מאוד. סבלנות היא קריטית בשלב זה. הנוזל חייב להיות חיוור מאוד.

הגדל את ריכוז ה-HCL עוד יותר ל-2.5 טוחנות. אסוף את הנוזל כשברים במבחנות. לבסוף הגדל את הריכוז לשלוש HCL מולארי.

המוצר ייפלט מהעמוד כפתרון ירוק-חום. שבר אדום-חום עשוי גם להתחיל לרדת מהעמוד. שברים אלה הם זיהומים חומים רותניום ואין לאגד אותם עם השברים הירוקים-חומים.

כדי לבדוק את כל השברים על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis, הוסף 100 מיקרוליטר של שבר נתון לשני מיליליטר של אמוניה מולארית. לאחר מכן נתח את התערובת על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis. לשברים המכילים מוצר טהור תהיה רצועת ספיגה גדולה ב-360 ננומטר וספיגה פחות אינטנסיבית ב-600 ננומטר.

ספיגה ב-480 ננומטר מעידה על חום רותניום וספיגה ב-533 ננומטר מייצגת זיהומים אדומים של רותניום. זיהומים אחרים נראים בספיגה של פחות מ-300 ננומטר. שברים המכילים מוצר טהור ומאדים את התמיסה ליובש על ידי אידוי סיבובי לפני ניתוח הדגימה במצב מוצק על ידי ספקטרוסקופיה IR.

המשך להעריך את עיכוב ספיגת הסידן המיטוכונדריאלי על ידי ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית כמפורט בפרוטוקול הטקסט. ספקטרום UV-Vis של טרנס-דיאקווה אוקטו אמין מו-אוקסו דירותניום פנטכלוריד מטוהר מאופיין בספיגה העיקרית והמינורית ב-360 ננומטר ו-600 ננומטר בהתאמה. לעומת זאת, תערובת לא טהורה מציגה רצועות ספיגה ב-533 ננומטר מזיהומים אדומים רותניום וב-275 עד 300 ננומטר מחומר המוצא.

לאפיון מצב מוצק באמצעות ספקטרוסקופיה אינפרא אדום יש את המתיחות הצפויות מהאמינים. כמו גם רותניום חמצן רותניום נמתח ב-850 סנטימטרים הפוכים. תאי HeLa שעברו פרמבל שטופלו בצבע פלואורסצנטי רגיש לסידן וטרנס-דיאקווה אוקטו אמין mu-oxo diruthenium pentachloride מראים עיכוב של ספיגת סידן למיטוכונדריה.

בזמן ניסיון ההליך, חשוב לזכור לאפשר לשברים להתרוקן לחלוטין. סבלנות תניב מוצר טהור. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז, לטהר ולאפיין את אנלוגי רותניום 360 החזק הזה.

רמות הסידן במיטוכונדריה מווסתות מגוון רחב של תהליכים בין-תאיים, כולל ביו-אנרגטיקה ומוות תאי מבוקר. ניתן ליישם את המעכב המופק משיטה זו במחקרים כדי להבין את תפקידה של ביולוגיה של סידן מיטוכונדריאלי בתיווך תהליכים ביולוגיים אחרים. אל תשכח שעבודה עם חומצות ובסיסים מרוכזים היא קורוזיבית ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת PPE מתאים בעת ביצוע הליך זה.