Name: DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: למד שיטת צביעת DNA בג'לים באמצעות SYBR Green I ו-NBT עם חשיפה לאור כחול. שיטה זו מאפשרת כימות DNA באמצעות סורק רגיל ומתאימה לעבודת שדה עם ציוד מינימלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Fondo נאסיונאל דה Desarrollo y אזור Tecnológico (Fondecyt), צ'ילה, פרויקט 11130263 (ל CW), פרויקט CONICYT + NERC + פרוגרמה דה Colaboración אינטרנסיונל PCI-PII20150073 (ל CW) ו- U-inicia מדה Vicerrectoría Investigación אוניברסידאד דה צ'ילה (ל CW).
תודה על טטיאנה נאראנחו-פלמה על העזרה בשלב הראשוני של הפרויקט, ד ר חורחה Babul, דייגו קירוגה-רוג'ר לדיון מועיל, רוברט Lesch עבור תיקון של כתב היד, Dirección דה extensión דה לה Facultad דה y Químicas עצמה Farmacéuticas מ אוניברסידאד דה צ'ילה. תודות גם מרסלו Pérez עבור עריכת הוידאו וסטיבנס ניל שתיקנת את הטקסט ואת ארול ווטסון למתן הקריינות.

1. הכנת ויפעילו את הג'ל
<ol><li>הכינו את הלא-denaturing 12% ג'ל לזיהוי ג'לים בעזרת המתכון נתרן Dodecyl סולפט-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) נמצא Sambrook וראסל14 אך באמצעות מים במקום מרחביות.<ol>
<li>כדי להכין 5 מ ל ג'ל לפתרון, השתמש 1.7 מ ל מים מזוקקים, 2 מ של אקרילאמיד/bis אקרילאמיד (30/0.8% w/v), מ 1.3 ל 1.5 M טריס pH 8.8, מ 0.05 ל 10% קירור ו 0.002 מ"ל של TEMED.</li>
		<li>להכין 2 מ ל ג'ל הערימה להשתמש 1.5 מ ל מים, 0.33 מ של אקרילאמיד/bis אקרילאמיד (30/0.8% w/v), 0.25 mL של 1 מ' טריס pH 6.8, מ 0.02 נקודות ל 10% קירור ו 0.002 מ"ל של TEMED. הממדים של הג'ל הם 7.3 ס מ x 8.2 ס מ x 0.075 ס"מ (l x ע w x). הערה: משתמש במסרק טוב 15 של 0.75 מ מ עובי על הרגישות הכי טוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף את כמויות מתאימות של 6 x טעינת מאגר ודגימת דנ א כדי צינור microcentrifuge 1.5 mL (למשל שימוש 1 µL x 6 טעינת מאגר כדי µL 5 של דנ א).</li>
	<li>מקם את הג'ל בבית הבליעה אלקטרופורזה אנכי.<ol>
<li>למלא את החדר עם 750 מ ל 1 מאגר x TAE לבדוק 2 משטחים. להכנת 1 ליטר של 50 x TAE, השתמש g 442 בבסיס טריס, 57.1 מ ל חומצה אצטית קרחונית, 100 מ של 0.5 M EDTA pH 8. להוסיף מים מזוקקים נפח סופי של 1 ל'</li>
		<li>לטעון את הדגימות הג'ל. הפעל את הג'ל ב- 100 וולט כבר שעתיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלופין, להכין 1 x TAE agarose ג'ל באמצעות מתכון שנמצאו Sambrook14.<ol>
<li>להוסיף 300 מ של 1 x TAE אל התא אלקטרופורזה אופקית. הפעל את ג'ל למשך 45 דקות ב- 100 וולט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NBT-SG אני מכתימה (איור 1).
<ol><li>
ג'ל אקרילאמיד מכתים.
	<ol>
<li>להכין את הפתרונות: 0.1% w/v NBT ו- 1.2 x ג אני. הערה: ניתן להשתמש אתידיום ברומיד, GelRed וזהב SYBR במקום ס ג אבל ג היה לי את הביצועים הטובים ביותר.</li>
		<li>יוצקים 16.75 מיליליטר 1.2 x SYBR ירוק אני הפתרון לתוך מיכל בגודל המתאים. הערה: . היינו המכסה של תיבה עצה פיפטה כגורם מכיל, אמצעי אחסון אלה מחושבים כדי לכסות את הג'ל משתמשים במיכל הזה; המימדים הם 11.6 ס מ x 7.6 ס"מ x 2.6 ס"מ (l x ע w x).</li>
		<li>מקם את הג'ל הפתרון. להוסיף 3.25 מ של 0.1% w/v NBT פתרון לתת 0.2 מ מ NBT ו- x 1 (שקול ל- 2.0 מיקרומטר) ס ג אני ריכוזים הסופי.</li>
		<li>לאטום את המיכל עם הסרט פלסטיק, לחלוטין לעטוף את המכולה ברדיד אלומיניום, כדי לחסום את כל אור מקיף. הערה: הסרט פלסטיק משמש למניעת ניתזים וכדי למנוע תגובה של רדיד האלומיניום עם הפתרון מוכתמים.</li>
		<li>לנער 25 דקות על תפקודי לב / נשימה-60 סל ד.</li>
		<li>הסר אלומיניום מכסה פלסטיק. לחשוף אור מקסימלית 90 דקות. בדוק כל 5 דקות עד להופעת הלהקה עניין.</li>
		<li>כדי להשתמש אור כחול, להכין את protoboard עם 3 דיודות פולטות אור (LED) ומניחים על הנוריות כ- 5 מ"מ מהמשטח ג'ל (בדוק ההכתמה באופן רציף, משך הזמן הדרוש יהיה תלוי האינטנסיביות של מקור האור LED).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ג'ל Agarose מכתים.
	<ol>
<li>לאחר הכנת והפעלה של agarose 1% ג'ל כמתואר בסעיפים 1.4 (הממדים הם 1 ס מ x 6.2 ס מ x 7 ס מ; l x w x d), בצע את הצעדים אותם כמו 2.1 עם שינויים אלה:</li>
		<li>יוצקים 41.9 מיליליטר 1.2 x ג אני פתרון למכסה של תיבה עצה פיפטה; המימדים הם 11.6 ס מ x 7.6 ס"מ x 2.6 ס"מ (l x ע w x). הוסף 8.1 מ של 0.1% NBT פתרון.</li>
		<li>לאטום את המיכל עם הסרט פלסטיק ולאחר מכן לחלוטין לעטוף את המכולה ברדיד אלומיניום, כדי לחסום את כל תאורת.</li>
		<li>לנער h 1 ב תפקודי לב / נשימה-60 סל ד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. נתונים ניתוח.
<ol><li>
NBT-SG אני עקומות כיול.
	<ol>
<li>לקבל תמונות ג'ל על-ידי סריקה ברזולוציה של 1200 dpi.</li>
		<li>תוכנה פתוחה עבור ניתוח תמונות. יישר את התמונות באמצעות עורך תמונות. הפעל את densitometry של התמונה.</li>
		<li>לחשב את השטח מתחת לעקומה. הכינו את גרף של האות/אותמקס לעומת ריכוז ה-DNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DNA השחזור.
<ol><li>הכנת ג'ל agarose 1% 1 x TAE בעזרת המתכון שנמצאו Sambrook14.</li>
	<li>להוסיף 300 מ של 1 x TAE אל התא אלקטרופורזה אופקית. לטעון µL 4 של 100 ng/µL pDJ10015 פלסמיד, סולם הדנ א בעקבות ערכת נתון באיור2. הפעל את הג'ל מאובטח ב- 100 וולט.</li>
	<li>מארק, שוקל שני צינורות microcentrifuge 2 מ"ל.</li>
	<li>חותכים את הג'ל למטה באמצע כדי שיהיה זהה לשני חצאים. כל אחד צריך להכיל את הסולם, על פלסמיד מדגם להשוות את טכניקות צביעת שונים. ייצוג סכמטי הוא באיור2.</li>
	<li>כתם אחד חצי עם NBT-SG. אני כמו שלב 2.<ol>
<li>לגזור את הלהקה פלסמיד באמצעות אזמל נקי. להציל את החתיכה ג'ל בצינור אחד ומשקלו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כתם החלק השני של הג'ל עם ס ג אני עם 50 מ של 1 x ג אני הפתרון וללחוץ לאט (60 סל ד) את הג'ל על 1 h בחשכה.<ol>
<li>להניח את הג'ל על transilluminator ולחשוף עבור 2 דק לחתוך את הלהקה פלסמיד באמצעות אזמל נקי.</li>
		<li>לשמור את החתיכה ג'ל בצינור השני, שוקל. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה תוך שמירה על הצינורות ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע את החילוץ פלסמיד באמצעות ערכת חילוץ ג'ל מסחרי.</li>
</ol>5. פלסמיד נורמליזציה.
<ol><li>צינור microcentrifuge 1.5 mL, להוסיף 10 µL של פלסמיד שחולצו µL 60 סוג אני מים. מיקס להעביר cuvette קוורץ 60 µL או להשתמש 2 µL ישירות Nanodrop.</li>
	<li>למדוד את ספקטרום בליעה בין 230 ל 320 ננומטר. חישוב פלסמיד הריכוז של המדגם באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq1v3.jpg"> איפה D הוא הגורם לדילול חלה (במקרה הזה זה 70/10), Ax הוא קליטה ב- x nm ו- 50 הוא פקטור המרה µg/mL עבור dsDNA.</li>
	<li>לדלל דגימות 9.1 ng/µL.</li>
	<li>שינוי צורה Escherichia coli (e. coli) המוסמכת תאים (למשל XL10 זהב) בעקבות ה ינו טרנספורמציה הליך-16 באמצעות µL 5 שתדללו מדגם.</li>
	<li>לספור את מספר מושבות על בצלחות פטרי ושים לב הדילול. לחשב את המושבה יוצרי יחידות (CFU) עם הבאים נוסחה17: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq2v2.jpg"> איפה D היא הגורם דילול מאובייקט התרבות הראשונית.</li>
	<li>לבצע מבחן-t אינטראקצית.</li>
</ol>

<ol><li>LePecq, J. B., Paoletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+complex+between+ethidium+bromide+and+nucleic+acids%3A+physical-chemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization.</a> J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).</li>
<li>Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SYBR+Green+I+nucleic+acid+gel+stain+mutagenicity+and+ethidium+bromide+mutagenicity+in+the+Salmonella%2Fmammalian+microsome+reverse+mutation+assay+%28Ames+test%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test).</a> Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).</li>
<li>Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYBR+Green-I%3A+a+new+fluorescent+dye+optimized+for+detection+picogram+amounts+of+DNA+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels.</a> Biophys. J. 66 (A150), (1994).</li>
<li>Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+agarose+gels+stained+with+methylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue.</a> Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).</li>
<li>Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterion-dye+staining+method+for+DNA+in+agarose+gels+using+crystal+violet+and+methyl+orange%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange.</a> Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).</li>
<li>Yang, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+using+a+visible+dye%2C+Nile+blue%2C+in+electrophoresed+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels.</a> Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).</li>
<li>Santillán-Torres, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+stain+for+DNA+in+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel stain for DNA in agarose gels.</a> Trends Genet. 9 (2), 40(1993).</li>
<li>Adkins, S., Burmeister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+in+agarose+gels+as+migrating+colored+bands%3A+applications+for+preparative+gels+and+educational+demonstrations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations.</a> Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).</li>
<li>Cong, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visible+dye-based+staining+method+for+DNA+in+polyacrylamide+gels+by+ethyl+violet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet.</a> Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).</li>
<li>Altman, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+salts+and+formazans%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium salts and formazans.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).</li>
<li>Nineham, A. W. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr50002a004">The chemistry of formazans and tetrazolium salts.</a> Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).</li>
<li>Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+imidazole-%2C+imidazolium%2C+and+tetrazolium-containing+compounds+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).</li>
<li>Paredes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+visible+and+selective+DNA+staining+method+in+gels+with+tetrazolium+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts.</a> Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a Laboratory Manual</a>. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3009026">In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor.</a> Cell. 45 (3), 397-406 (1986).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+M+%22Brock+biology+of+microorganisms%22">Brock biology of microorganisms</a>. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הרומן ורגיש DNA מכתים שיטה מבוסס על הפחתת NBT השימוש של ס ג. הוצגתי במאמר זה. השלב הקריטי של פרוטוקול זה הוא זמן הדגירה של הג'ל ב NBT-ס ג אני פתרון וריכוז NBT. הזמן מוכתמים agarose ג'ל הוא ארוך יותר עבור אקרילאמיד ג'לים בשל עובי גדול יותר agarose ג'ל. שיטה זו אינה פועלת היטב בנוכחות מרחביות כפי NBT ארגונייט שוקע במגע עם זה. אם הג'ל משיג רקע סגול, אנו ממליצים על כך עוד ג'ל להיות מוכן כדי לצמצם את זמן חשיפה קלה. אם ג'ל agarose היא מוכתמת, ואין רגישות מספיק, מומלץ להגדיל את הזמן לאור החשיפה. אם יש חוסר הרגישות התמיסה שאדרה ...

עם ההתקדמות לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית, מחקרים שכללו דנ א דרושים טכניקות טובות יותר כדי לנתח את הדנ א. השיטה הראשונה עבור ה-DNA מכתים היה כסף מכתים, הרגישה מאוד אבל חסר סלקטיביות, אינו מאפשר שחזור הדגימה. מאוחר יותר, ההתפתחות של צביעת DNA פלורסנט מותר כימות סלקטיבי של ה-DNA עם האפשרות של שחזור הדגימה. אחד צבעי פלורסנט הראשון משמש DNA כימות היה אתידיום ברומיד1, אשר הוא מוטגניות2. עם זאת, כעת ישנם צבעי פלורסנט משופרת, כי הם יותר רגישים, כגון GelRed ו- SYBR Green ובטוחה אני (SG אני)3; אבל כל אלה צבעי פלורסנט מחייבות השימוש של אולטרה סגול (UV) transilluminator או fluorimeter.
ישנן טכניקות אחרות עבור בעליל מכתים ה-DNA, כגון מתילן כחול4 וקריסטל ויולט5,6,7,8,9, אך כל אלה סובלים רגישות מופחתת, סלקטיביות. המלחים tetrazolium הן תרכובות אורגניות רגישים צמצום, כאשר זה קורה הם יוצרים לא מסיס, formazan צבעוניים לזרז10,11. לאחרונה, כמה מלחים tetrazolium טרינארית הוכחו לאגד DNA עקב שלהם טבעות חיובי tetrazolium12.
האחרונות הפרסום13, הוצע טכניקה גלויה חדשה כדי להכתים ולכמת DNA ב לזיהוי ג'לים, באמצעות הפחתת מלח tetrazolium טרינארית בשם ניטרו כחול tetrazolium (NBT) ו צבעי פלורסנט כמו אתידיום ברומיד, GelRed, SYBR ירוק אני וזהב SYBR. התגובה הזו עבד בנוכחות אור כחול או אור שמש ואיפשר שחזור הדגימה עם איכות משופרת בהשוואה לשימוש של ס ג אני transilluminator UV. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט לשיטת ההגדלה באמצעות tetrazolium מלחי.

<table><tbody><tr><td>מגיב ניטרו כחול טטרזוליום</td><td>זהב ביוטכנולוגיה</td><td>298-83-9</td><td>המשמש במגיב הצביעה</td></tr><tr><td>SYBR Green I 10000X</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S7563</td><td>המשמש בערכת מיצוי</td></tr><tr><td>ג'ל</td> הצביעה <td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>המשמש לחילוץ פלסמיד מהג'ל בסולם בדיקת תקינות</td></tr><tr><td></td><td>DNA Thermo-Fisher</td><td>SM 1331</td><td>משמש לייצור עקומות כיול וכהתייחסות לרצועת חיתוך בבדיקת תקינות</td></tr><tr><td>אגר אגר</td><td>מרק</td><td></td><td>שימש לייצור לוחות תרבית LB-אמפיצילין&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Merck</td><td>משמש 1064045000</td><td>לייצור לוחות תרבית LB-אמפיצילין&nbsp;</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>המשמשת לייצור צלחות תרבית LB-ampicillin&nbsp;</td></tr><tr><td>פפטון</td><td>Merck</td><td>72161000</td><td>המשמש לייצור צלחות תרבית LB-אמפיצילין&nbsp;</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>761</td><td>משמש לייצור ג'ל פוליאקרילאמיד</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Calbiochem</td><td>2310</td><td>משמש לייצור ג'ל פוליאקרילאמיד</td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>invitrogen</td><td>15512-023</td><td>משמש לייצור ג'ל פוליאקרילאמיד</td></tr><tr><td>ביסקרילאמיד</td><td>SIGMA</td><td>146072</td><td>משמש לייצור ג'ל פוליאקרילאמיד</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Merck</td><td>1083821000</td><td>משמש לייצור מאגר TAE וג'ל פוליאקרילאמיד שאינו דנטורינג מאגר tris-HCl מאגר EDTA</td></tr><tr><td></td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td>משמש לייצור מאגר TAE</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Merck</td><td>1,000,632,500</td><td>משמש לייצור מאגר TAE</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Merck</td><td>16802</td><td>המשמש לייצור</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td> מאגר TAE <td>Tecan</td><td>אינסופי 200 pro</td><td>המשמש לכימות פלסמיד DNA</td></tr><tr><td>יחידת טיהור מים</td><td>Merck</td><td>Elix 100</td><td>משמשת לייצור מים מסוג 1 (ASTM) המשמשים בספקטרופוטומטריה ודילול DNA\</td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td></td><td></td> <td>המשמשים בג'לים, מדיום תרבית, מכתים ופתרונות כלליים</td></tr><tr><td>HCl</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-03</td><td>המשמש לייצור ג'ל פוליאקרילאמיד ללא דנטורציה tris-HCl מאגר 6X</td></tr><tr><td>צבע טעינת DNA</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R0610</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"מ LED כחול</td><td>Jinyuan אלקטרוניקה</td><td>SP-021</td><td>מקור אור המשמש בבדיקת תקינות</td></tr><tr><td>protoboard</td><td>KANDH</td><td>KH102</td><td>תמיכה ומעגל מקור אור&nbsp;</td></tr><tr><td>סוללת 9 וולט</td><td>Duracell</td> <td>משמשת</td> <td>להפעלת תא האלקטרופורזה האופקי של ה-LED</td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>1704486EDU</td><td>משמש לייצור והפעלה של ג'ל אגרוז בערכת</td></tr><tr><td>אלקטרופורזה אנכית</td><td>לבדיקת תקינות Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>המשמש להפעלת ג'לים פוליאקרילאמיד בעקומות כיול</td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>Biorad</td><td>1645050&nbsp;</td><td>משמש להפעלת האלקטרופורזה</td></tr></tbody></table>

dna מכתים שיטה המבוססת על משקעים formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

שיטות מכתימים DNA חשובים מאוד למחקר ביורפואי. תיכננו שיטה פשוטה המאפשרת ויזואליזציה DNA בעין בלתי מזוינת על ידי היווצרות התמיסה צבעוניים. זה עובד על ידי השריה של אקרילאמיד או agarose DNA ג'ל בריכוז של 1 x (שקול ל- 2.0 מיקרומטר) SYBR Green אני (SG אני), מ מ 0.20 ניטרו כחול tetrazolium שמייצר סגול לזרז של formazan כאשר הם נחשפים לאור השמש או אור כחול במיוחד. בנוסף, בדיקות דנ א השחזור בוצעו באמצעות פלסמיד עמיד אמפיצילין ב ג'ל agarose צבעונית עם השיטה שלנו. מספר גדול יותר של המושבות הושג בשיטה שלנו מאשר עם מסורתיים מכתים באמצעות ג. אני עם תאורה אולטרה סגולה. השיטה המתוארת הוא מהיר ספציפיים, שאינם רעילים עבור זיהוי ה-DNA, המאפשר ויזואליזציה של מולקולות "בעין בלתי מזוינת" בלי transilluminator, והוא מתאים לשימוש שדה וזולה. מסיבות אלו, יש DNA החדש שלנו מכתים שיטה היתרונות הפוטנציאליים לפעילות המחקר והתעשייה.

התמיסה formazan סגול מופיע היכן ממוקם ה-DNA (נבדק על ידי ספקטרומטר מסה13). בניסוי, סולם הדנ א נטען לבצע עקומת כיול (איור 3). הפרוטוקול פועל עבור ג'לים אקרילאמיד והן agarose, אך יש עוצמה נמוכה יותר והוא לוקח זמן רב יותר agarose. עם זאת, השימוש agarose ג'ל מאפשר ההתאוששות של המדגם באמצעות ערכת זמינים מסחרית, זה לא מפריע החילוץ. הדגימות התאושש באמצעות שיטה זו עם נוריות כחולות יש איכות טובה יותר בהשוואה לס ג אני משתמש של transilluminator (...

שיטה זו מאפשרת מכתים סלקטיבית, כימות של ה-DNA של ג'לים למסמס את הג'ל ירוקה SYBR אני / ניטרו Tetrazolium כחול פתרון וחשיפת אז זה אור שמש או מקור אור כחול. זה מייצר את התמיסה גלוי ודורשת כמעט ללא ציוד, שהופך אותו אידיאלי לשימוש שדה.

DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

לפרוטוקול צביעת ה-DNA יש שלושה שלבים כלליים. הראשון הוא לשים את הג'ל בתמיסה של SYBR Green I ו-nitro blue tetrazolium, הידוע גם בשם NBT. לאחר מכן מערבבים את הג'ל במשך 25 דקות אם מדובר בג'ל פוליאקרילאמיד ושעה אם מדובר בג'ל אגרוז.השלב האחרון הוא לחשוף את הג'ל למקור אור כחול כגון נוריות LED כחולות או אור שמש. במהלך שלב זה מופיעות כמה רצועות משקעים. לרצועות אלה יש מתאם ישיר עם ריכוז ה-DNA ולאחר מכן ניתן לבצע דיגיטציה של הג'ל בסורק משרדי על מנת לכמת את ה-DNA.לג'ל הפוליאקרילאמיד מכינים ג'ל פוליאקרילאמיד שאינו מנטור. לאחר מכן הג'ל נטען בדגימות ותהליך האלקטרופורזה מתחיל. SYBR Green I מדולל ל-1.2X ותמיסות NBT של 20 מילי-מולר מוכנות כעת.הג'ל מוכנס למיכל פלסטיק ומוסיפים 16.75 מיל של ה- SYBR Green I המדולל ו -325 מיל של ה- NBT ב -20 מילימולר. לאחר מכן מכוסה המיכל בפרפילם ונייר אלומיניום ומערבבים ב 60 סל"ד למשך 25 דקות. לבסוף מסירים את רדיד האלומיניום והפרפילם והג'ל נחשף לאור השמש או למקור אור כחול.עבור עקומות כימות וכיול פס, הג'ל מוכנס לסורק משרדי, ואז התמונה מנותחת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. לבסוף, נעשה שתל של אות מנורמל לעומת ריכוז. מכינים ג'ל אגרוז.הבארות עמוסות בפלסמיד בעל עמידות לאמפיצילין והג'ל נחתך לשני חלקים, שכל אחד מהם מוכתם בכתם אחר. לאחר מכן מפיקים את רצועת הפלסמיד והופכים אותה באמצעות טרנספורמציה כימית לתאים מוכשרים עם מדיה המכילה אמפיצילין. ג'ל אגרוז 1% מוכן במאגר TAE 1X ועמוס בארבעה מיקרוליטר פלסמיד בסביבות 100 ננוגרם למיקרוליטר.לאחר מכן הג'ל בתא האלקטרופורזה מופעל ב-100 וולט למשך שעה. מחצית מהג'ל מוכתם בשיטת SYBR Green I ו-NBT והחצי השני בשיטת SYBR Green I UV. עבור ג'ל אגרוז, שיטת SYBR Green I NBT מבוצעת באמצעות SBYR Green I בריכוז של 1.2X ו-NBT בריכוז של 2 מילימולר.הג'ל מוכנס למיכל פלסטיק ונפח התמיסה מוגדלת לכיסוי הג'ל וזמן הערבוב מתארך לשעה. עבור ג'ל אגרוז, שיטת SYBR Green I הנפוצה מבוצעת על ידי כיסוי הג'ל בתמיסת 1X SYBR Green I וערבוב במשך שעה. לאחר מכן הג'ל נחשף לטרנס-מאיר UV להדמיית הלהקה למשך שתי דקות.לאחר שהג'ל מוכתם, רצועת הפלסמיד נחתכת באזמל והפלסמיד מופק בערכת מיצוי מסחרית. ה-DNA מנורמל ל-9.1 ננוגרם למיקרוליטר להפיכת חיידקי Escherichia coli XL 10 בעלי יכולת כימית. לבסוף, המושבות נספרות.היחידות היוצרות מושבה מחושבות. התוצאה מושתלת ומשווים את התוצאות המתקבלות מ-SYBR Green I NBT ו-SYBR Green I UV. משקע פורמאזאן סגול מופיע במקום בו נמצא ה-DNA.בניסוי הוטען סולם DNA כדי ליצור עקומת כיול עם מגבלת זיהוי של 192 פיקוגרמים ב-1,500 זוגות בסיסים. השימוש בג'ל אגרוז מאפשר שחזור דגימה באמצעות ערכה זמינה מסחרית ואינו מפריע למיצוי. התאוששות מסוימת בשיטה זו עם LED כחול מביאה לאיכות טובה יותר בהשוואה ל-SYBR Green I המשתמש בטרנס-תאורה.

dna-staining-method-based-on-formazan-precipitation-induced-blue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

צבעים FM כבר סיוע שלא יסולא בפז בהבנת הדינמיקה הסינפטי. FMS אחריהן בדרך כלל במהלך תנאי גירוי שונים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, photoconversion של צבעים FM משולב עם מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר הדמיה של בריכות נפרדות שלפוחית ​​סינפטית, בין הרכיבים ultrastructure אחרות, boutons הסינפטי.

לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl

טכניקות להדמית cytoarchitecture רשתית ישירות בסמוך לאלקטרודות בודדות בתוך ממריץ רשתית.

טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לביצוע הכלאה של DNA פלואורסצנטי באתרו (DNA ISH) כדי לדמיין רצפים הטרוכרומטיים חוזרים ונשנים על כרומוזומים המותקנים בשקופיות. השיטה דורשת ריאגנטים מינימליים והיא רב-תכליתית לשימוש עם בדיקות קצרות או ארוכות, רקמות שונות וזיהוי עם אותות פלואורסצנטיים או שאינם מבוססי פלואורסצנטיות.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

זיהומי ביופילם מראים סבילות גבוהה לכימותרפיה. אין בדיקה אחת שתופסת את המורכבות של ביופילמים. במקום זאת, יש צורך בבדיקות משלימות. אנו מציגים פלטפורמת סינון (שפותחה עבור S. aureus) המשלבת מבחני כדאיות, ביומסה ומטריצת ביופילם. זה מאפשר גילוי תרופות אנטי-ביופילם, כולל הערכה של השפעות כימותרפיות ארוכות טווח.

פלטפורמה של מבחנים אנטי biofilm המתאים לחקירת ספריות תרכובת טבעיות

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש thiazole כתום זיהוי ה-DNA בניסויים ג'ל אלקטרופורזה. השימוש thiazole כתום מאפשר חיסול של אתידיום ברומיד, וכן זיהוי קרינה פלואורסצנטית יכולה להיות מושגת באמצעות UV או אור כחול.

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

הפרוטוקול מתאר את התיוג הספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם כתם של דנ א הזמין מסחרית, רכישת סדרה של לשגות בזמן של תאים בעלי תווית חיה על-ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SR-SIM), ומעקב אוטומטי של תנועה נוקלאואידית.

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיית סקר פלואורומטרית המותאמת לזיהוי מעכבי מוצר טבעי/מולקולות קטנות של סינתזת חלבונים. הפרקטיות שלו הופכת אותה למתאימה הן להוראה לתואר ראשון בטכניקות גילוי תרופות והן ליישום בקמפיינים של כימיה רפואית.

פרוטוקול מבוסס פלואורסצנציה לסינון ראשוני של מעכבי סינתזת חלבונים ממקורות טבעיים

למד שיטת צביעת DNA בג'לים באמצעות SYBR Green I ו-NBT עם חשיפה לאור כחול. שיטה זו מאפשרת כימות DNA באמצעות סורק רגיל ומתאימה לעבודת שדה עם ציוד מינימלי.

DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול

גלה סרטונים נוספים