שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans
February 19th, 2018
כלים חדשים למחקר mechanobiology יש צורך להבין כיצד מכאניים מפעילה מסלולים ביוכימיים, מעורר תגובות ביולוגיות. כאן, אנחנו ראווה שיטה חדשה עבור סלקטיבית גירוי מכני של חיות קיבוע עם מלכודת microfluidic ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא למדוד כיצד נמטודות והנוירונים שלהן מגיבים לגירויים מכניים חיצוניים באמצעות מערך שבב מיקרופלואידי, עם מפעילי לחץ. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחומי המכנוביולוגיה והביולוגיה החושית כגון כיצד תאים, רקמות ובעלי חיים מגיבים לגירוי מכני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מפחיתה מספיק את ניידות התולעת בצורה לא פולשנית כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה תוך גישה לקוטיקולה של התולעת לגירוי מכני.
ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור את ההשפעה של רמזים מכניים על ההתפתחות. ניתן אפילו ליישם אותו על מערכות אחרות כגון ex vivo organ exponse או בעלי חיים אחרים בגודל דומה ל-C.Elegans. הקמת מערכת מיקרוסקופ לעירור בו זמנית של GCaMP ו-RFP.
אפשרות אחת היא מקור אור דיסקרטי המעביר רק אור ציאן וצהוב. לצפייה, השתמש במטרה של פי 10 ובמטרה בהגדלה גבוהה. כמו כן, שלח את התמונה למחשב באמצעות מצלמה דיגיטלית.
לאחר מכן, כלול קוביית תפרחת, ובמידת הצורך, מסנן עירור. הוסף מראה דיכרואית לקובייה המשקפת אור ציאן וצהוב ומעבירה אור ירוק ואדום. הגדר מפצל אלומה עם מראה דיכרואית ארוכת טווח עם חתך ב-570 ננומטר.
כמו כן, ספקו מסנן פליטת פס-פס לאור ירוק ב-525 ננומטר ברוחב של 50 ננומטר ומסנן פליטת פס-פס לאור אדום ב-632 ננומטר ברוחב 60 ננומטר. הקרן את שתי הקרניים לשדה הראייה של המצלמה. ודא שהחלק הירוק מוקרן לחצי העליון של המסך, והחלק האדום לתחתית.
השתמש תמיד בשבבים מיקרופלואידיים בני פחות מחודש. לצורך ההגדרה, טען תחילה את מאגר זרימת הכבידה עם M9 מסונן. מקם את המאגר כ- 60 סנטימטרים מעל השבב וחבר אותו לשקע שבבים. לאחר מכן, חבר את השקע השני למיכל פסולת עם שתי כניסות, וחבר את הכניסה השנייה למיכל הפסולת למשאבה פריסטלטית.
צור את כל החיבורים עם צינורות פוליאתילן. לאחר מכן, הרכיבו חיבורים, אורכי צינורות של 50 מילימטר עם מחברי צינורות מתכת בשני הקצוות. לחץ וחבר על כל אחת משש אצבעות ההפעלה ולתוך כניסת התולעת.
כעת, מקם את השבב מתחת לאופטיקה. הקפד להשאיר את החיבורים מחוברים לשבב מכיוון שה-PDMS יתבלה במהירות עם מניפולציות חוזרות ונשנות. חיוני שמפעיל ה-PDMS והצינור המחבר את השבב למאגר האוויר יהיו אטומים כראוי כדי להבטיח הפעלה כרומטית טובה של הסרעפת.
לפני העמסת בעלי חיים, בדוק אם יש אובדן לחץ בשבב המיקרופלואידי. מדוד את סטיית הסרעפת על ידי ביצוע מספר מחזורי הפעלה בלחץ הרצוי. לאחר מכן, השווה את הערכים הכמותיים עם תחזיות תיאורטיות.
אם הערכים הנמדדים אינם כצפוי, בדוק אם יש נזילות במחברי הצינורות או הצינורות. ל-PDMS עשויה להיות גם גמישות שונה עקב יחס חלופי של פולימר בסיס וחומר ריפוי, או שמסת ה-PDMS יכולה להיות ישנה ומקושרת יתר על המידה. הכינו C.elegans מסונכרנים לפי גיל למבוגרים צעירים או למבוגרים מהיום הראשון כפי שתוארו על ידי Porta-de-la-Riva ושות' בפרסום שלהם ב-Jove משנת 2012.
כעת, בחרו שניים עד חמישה בוגרים צעירים או הרמפרודיטים בני יום אחד. בחירת בעלי חיים בגודל הנכון היא קריטית. בעלי חיים קטנים לא יילכדו בתעלה, ובעלי חיים גדולים מדי יהיו קשים להסרה ויכולים לסתום את המכשיר.
משוך את התולעים שנקטפו בטיפה של M9 מסונן. לאחר מכן, משוך אותם לאורך צינור באמצעות מזרק של מיליליטר מבלי למשוך אותם לגוף המזרק עצמו. לאחר מכן, חבר את הצינור לחיבור בכניסת התולעת של השבב. לאחר מכן, הפעל את זרימת הכבידה על ידי פתיחת השסתום למאגר והפעלת המשאבה.
כעת, התבונן בתעלת הלכידה בהגדלה של פי ארבעה ודחף בעדינות את החיות לתוך המכשיר. לאחר העמסת החיות לתא ההמתנה, השתמש בבוכנה כדי להזרים בעדינות אחד מהם לקדמת תעלת הלכידה כך שראשו ייכנס לצורה המחודדת של התעלה. אם התולעת אינה ממלאת את כל חתך התעלה מהאף ועד קרוב לקצה הגוף, הסר את התולעת.
פעמים רבות, תולעים קטנות מדי יעברו ישר דרך השבב מבלי להילכד. אם יש צורך להסיר בעל חיים שנתפס בתעלת הלכידה, פשוט לחץ על הבוכנה של המזרק עד שהתולעת נעלמת מהתעלה ואז טען תולעת חדשה. לאחר שתולעת נטענת כראוי, עבור למצב פריחה, והגדל את ההגדלה.
כדי למנוע רוויה, הקפד להתאים את עוצמת העירור על סמך עוצמת הפריחה. בדוק אם הנויריט של נוירון מעניין נמצא על פני הסרעפת של אחד המפעילים. המפעיל הזה חייב להיות גם קדמי לגוף התא של הנוירון.
אם לא, התאם את מיקום החיה על ידי משיכה או דחיפה של הבוכנה. אם זה לא עוזר, הסר את התולעת וטען אחת חדשה. כמו כן, אם במקרה יש אוטופלואורסצנטיות סביב תא העצב, החליפו את התולעת.
לאחר שתולעת נטענת כראוי, התמקד בגוף התא של הנוירון המבוקש, ולאחר מכן קבע איזה מפעיל נמצא השבב בצד הקדמי שלו וחבר את המפעיל הזה למשאבת הלחץ הניתנת לתכנות באמצעות החיבור המשויך. אם הניסוי דורש מדידת המרחק בין המפעיל לנוירון יש להתאים את שניהם לשדה הראייה כאשר דופן התעלה מקבילה לקצה העליון והתחתון של התמונה. לאחר מכן, הגדר פרוטוקול לחץ באמצעות משאבת הלחץ הניתנת לתכנות.
התחל תמיד בצילום לפחות 50 תמונות באפס קילופסקל כדי להגדיר קו בסיס. לאחר מכן, תכנת את צורת הגל והלחץ של הגירוי. כעת, הפעל את פרוטוקול ההדמיה והלחץ.
בזמן ההקלטה, תא העצב המעניין חייב להיות הנקודה הבהירה ביותר באזור של 10 פיקסלים מרובעים. הוא לא יכול להזיז יותר מ-10 פיקסלים בשתי תמונות עוקבות, והוא חייב להישאר בשדה הראייה. בזמן ההקלטה, אתה עשוי להבחין בשינויים בעוצמת הפריחה כאשר הלחץ והמפעילים משתנים.
זה מצביע על גירוי מוצלח של הנוירונים. בין גירויים, כלול 10 שניות בלחץ קבוע של אפס קילופסקל. אפשר להקליט בו זמנית אותות ממספר נוירונים בשדה הראייה כל עוד הם מופרדים על ידי לפחות 10 פיקסלים במהלך כל ההקלטה.
כדי לשמור על תולעים למחקר נוסף, נתק את שקעי השבב לכיוון זרימת הכבידה ומיכל הפסולת. לאחר מכן, לחץ בעדינות על הבוכנה עד שהתולעת כולה נדחפת דרך תעלת הלכידה לתוך תעלת הזרימה, והמשך ללחוץ על הבוכנה עד שהחיה מופיעה בטיפה מחוץ לשבב. כעת, נתק את המזרק עם הצינור ושאף את התולעת בטיפה לצלחת אגר
.כדי להסיר ולהקריב תולעת בתעלה, לחץ על הבוכנה עד שהתולעת כולה נדחפת דרך תעלת הלכידה לתוך תעלת הזרימה. לאחר מכן, התולעת תזרום מהשבב לתוך מיכל הפסולת. לאחר הגדרת השבב המיקרופלואידי, נבדקה סטיית הסרעפת.
הערכים שנמדדו היו ניתנים לשחזור עם שונות קלה שלא תעלה על מיקרון אחד בלחץ של 450 קילופסקל. לאחר החדרת התולעים לתוך כניסת השבב, עור של חיה בודדת בתוך תעלת הלכידה הוצג לששת המפעילים. עם תכנון זה, בדרך כלל לא ניתן לשתק את נוירון ה- PLM לחלוטין, כך שהוא חופשי לנוע לרוחב ואנכית.
למרות שהפעלה מוצלחת של נוירוני PLM אפשרית, קשה להקליט מהם מעברי סידן בגלל תנועת הזנב. ברגע שהחיה הגיעה למקומה, היא עוררה באמצעות אחד מששת המפעילים שהוצבו כדי להעביר גירויים מכניים לכל אחד מששת ה-TRNs. אחד משלושת הגירויים השונים של שתי השניות הוצג.
אחיזה ב-275 קילו-פסקל, רמפה ל-275 קילו-פסקל או זמזום המורכב מ-75 קילו-פסקל סינוס של 10 הרץ המונח על גבי המדרגה של 275 קילו-פסקל. מרווחים של 10 שניות ללא לחץ הפרידו בין הגירויים. רמפות לחץ וצעדי לחץ הפעילו TRNs רק אם הגירויים השיגו לחצים מעל 400 קילופסקל, בעוד שגירוי הזמזום הפעיל בעוצמה את כל ה-TRN.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש דקות לכל תולעת. חשוב לזכור כי איטום לקוי בין השבב לכיסוי, או בין השבב למחברים יגרום למכשיר לדלוף ולהיכשל. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית מתח או מסירה ממוקדת של גירויים מכניים לנוירונים שונים על מנת לאפיין את התגובה המכנית של קולטני כאב.
כמו כן, מכיוון שניתן לשחזר את בעלי החיים בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקה כדי לסנן מוטציות פגומות בתגובתן לגירויים מכניים. אל תשכח שעבודה עם גזים וכימיקלים דחוסים עלולה להיות מסוכנת ביותר. נקוט באמצעי זהירות כגון לבישת בגדי מגן אישיים ועבודה במכסי אדים בעת הצורך כדי למנוע סכנות אלו.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
המחקר הנוכחי מציג שיטה חדשנית לגירוי מכני סלקטיבי של נמטודות מוקפאות באמצעות מלכודת מיקרו-נוזלית, מה שמאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תגובות תאיות. הדגש העיקרי הוא על הבנת האופן שבו מתח מכני משפיע על תגובות עצביות ותהליכים ביולוגיים רחבים יותר בהקשר של מכאנוביולוגיה וביולוגיה חושית.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מכאנוביולוגיה
- ביולוגיה חושית
- מדעי המוח
רקע
- מתח מכני הוא קריטי בהפעלת מסלולי ביוכימיה.
- הבנת התגובות העצביות לגירויים מכניים חיונית להבנה מכאנוביולוגית.
- השיטה מאפשרת קיבוע לא-פולשני אך יעיל של הנושאים הביולוגיים.
- הדמיה ברזולוציה גבוהה יכולה להעצים את הבנתנו של התגובות הללו.
מטרת המחקר
- לפתח טכניקה למדידת תגובות נמטודות ועצבים לגירויים מכניים.
- לחקור כיצד בעלי חיים מגיבים לגירוי מכני במכאנוביולוגיה.
- לספק תובנות לגבי ההשפעה של רמזים מכניים על התפתחות האורגניזמים.
שיטות בשימוש
- ניצל מערך שבב מיקרו-נוזלי עם מפעילי לחץ לגירוי.
- המודל הביולוגי כלל את הנמטודה C. elegans, תוך התמקדות בקיבוע והדמיה של נוירונים שלה.
- כלל התקנה מדויקת של מערכות מיקרוסקופיה להתרגשות סימולטנית של סמני פלואורסצנציה.
- שלבי הניסוי כללו העמסת הנמטודות לערוץ לכידה וביצוע פרוטוקולי הדמיה ברזולוציה גבוהה.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה סיפקה שיטה אמינה להערכת תגובות עצביות לגירויים מכניים מופעלים.
- הדמיה ברזולוציה גבוהה חשפה את הקשר בין גירוי מכני ותגובות ביולוגיות בתוך נמטודות מוקפאות.
- אפשרה תצפית על התנהגות עצבית משמעותית מבלי לפגוע בשלמות או בתנועתיות האורגניזם.
- אפשרה הערכות של שינויים מכניים בהתרגשות עצבית ופרמטרים פיזיולוגיים אחרים.
מסקנות
- שיטה זו מקדמת מחקר במכאנוביולוגיה על ידי אפשרות הדמיה ברזולוציה גבוהה של תגובות עצביות למתח מכני.
- היא מספקת תובנות חיוניות לגבי הרגישות המכנית של אורגניזמים וניתן להתאים אותה למודלים ביולוגיים דומים אחרים.
- בסך הכל, הממצאים יכולים להעמיק את ההבנה שלנו על מנגנונים עצביים והשלכות פוטנציאליות בביולוגיה התפתחותית.
