Name: חומצות שומן רוויות לגרום מוות תאי מקרופאג Ceramide-הקשורים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: למד כיצד לגרום למוות תאי מקרופאג מעצם עכברים באמצעות חומצות שומן רוויות ולמדוד צבירת Ceramide. שיטה זו מספקת גישה פשוטה לחקר דלקת מטבולית ומנגנוני מוות תאי במחקרים עתידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי ראשונית אוניברסיטת לואיוויל ומענקים המכון הלאומי לסרטן (בת'סדה, מרילנד) R01CA177679, R01CA180986.

הפרוטוקול אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת לואיוויל.
 1. עכבר מח עצם נגזר מקרופאגים (BMDMs) <ol><li>Euthanize עכבר 6 עד 8-בת, בריא פראי סוג באמצעות CO 2. להצמיד אותו למטה לוח קצף, תשפריץ עם אתנול 70% עד שהכל רטוב. הסר את עצמות השוקה/עצם הירך עם מלקחיים ומספריים. להכניס אותה צלחת פטרי עם 5 מ ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). ביצוע כל ההליכים בתנאים סטריליים.</li>
	<li>לפתוח בשני הקצוות של עצם השוקה/הירך עם מספריים בשכונה תרביות רקמה סטרילי. לשטוף את העצם עם מחט 25 גרם עם PBS + 2% סרום שור עוברית (FBS) לתוך צינור 15 mL-</li>
	<li>Centrifuge התאים במח העצם ב 500 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא במאגר פירוק תאי הדם האדומים 1 מ"ל ל lyse תאי דם אדומים (RBC) עבור פחות מ 1 מינימלית Dilute מיד עם PBS 1 x 9 מ. צנטריפוגה שוב כמו שלב 1.3. Decant supernatants.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב- PBS 1 x 10 מ"ל, לסנן התליה תא דרך רשת ניילון סטרילי μm 40 לתוך צינור אחר 15 מ"ל להסיר תא פסולת/גושים. צנטריפוגה שוב כמו 1.3. Decant supernatants.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב 15 מ"ל רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) 1640 עם 5% FBS ו 10 גנטמיצין μg/mL, צלחת שהתאים בקערה תרביות רקמה 100-מ מ- 37 חממה o C עבור 60 דקות מערבולת בעדינות את המנה להוציא הצפים תאים, ולספור אותם.</li>
	<li>צלחת 6 x 10 6 תאים בצלחת 100-מ מ עם 12 mL מקרופאג המבדילים מדיה (RPMI 1640 עם 5% FBS ו גנטמיצין μg/מ"ל, מעורבב עם 30% L929 media ממוזגים 10) עם 10 ננוגרם למ"ל העכבר רקומביננטי מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (M-CSF) במשך יומיים.</li>
	<li>לאחר culturing 2 ימים בחממה 37 ° C עם 5% CO 2, להאכיל כל מנה עם 6 מ ל מקרופאג טריים המבדילים מדיה עם 10 ננוגרם למ"ל M-נוזל מוחי-שדרתי.</li>
	<li>ביום 5, לקחת 8 מ של אמצעי התקשורת הישנים החוצה מבלי להפריע את התאים ולהוסיף 10 מ"ל מקרופאג טריים המבדילים מדיה עם 10 ננוגרם למ"ל M-נוזל מוחי-שדרתי.</li>
	<li>ביום 7, לקצור את מח העצם, נגזר המקרופאגים (BMDMs) באמצעות של מרים תא. 
	הערה: מקרופאגים המצורף יכול גם להיות חלופה מועדפת עם 5 מ ל 1 מ"מ EDTA ב- PBS 1 x 5-10 דקות לאחר הסרת התאים צפים ושטיפת צלחת פעמיים עם PBS 1 x מ. Centrifuge התאים כמו שלב 1.3. resuspend אותם ב מקרופאג טריים המבדילים מדיה, נספור hemocytometer.
	<ol><li>אשר BMDMs &#39; פנוטיפ מאת cytometry זרימה כמו שמתואר 5. להכין העכבר נגזר מקרופאגים בריכוז מסוים עבור המחקרים הבאים.</li>
	</ol></li></ol> 2. הכנה נזווג חומצת שומן BSA <ol><li>להכין 2 מ מ BSA ב- PBS סטרילי. לדוגמה, שוקל 6.65 g BSA, להוסיף 30 מ ל 1 x PBS להתמוסס, ואז להוסיף PBS יותר עד 50 מל ', קנה מידה של רכיבים כדי להפוך 2 מ מ BSA PBS 1 x.</li>
	<li>הכן 5 מ מ מלח נתרן בודדים של חומצות שומן ב- 2 מ מ BSA. מחממים עד 37 מעלות צלזיוס או יותר, אם יש צורך בכך, sonicate התערובת של 2 מ מ BSA ומלח נתרן של חומצות שומן עד מתקבל פתרון ברור. 
	הערה: בהשוואה חומצות שומן בלתי רוויות, חומצות שומן רוויות צריך טמפרטורה גבוהה יותר וזמן sonication יותר בשביל המסת.</li>
	מסנן <li>מסנן הפתרון שומן-חומצה-BSA דרך 0.22 μm, aliquot אותו microcentrifuge סטרילי 1.5 mL צינורות, ואחסן אותם ב 4 ° C לשימוש לטווח קצר או ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך. אין משקעים להתייחס לאחר אחסון ב 4 ° C במקרר.</li>
</ol> 3. רוויות חומצות שומן זירוז תא מותו של עכבר מח עצם נגזר מקרופאגים <ol><li>צלחת את BMDMs בצלחת תרביות רקמה 24-ובכן עם 0.4 x 10 /mL 6 ב מקרופאג המבדילים מדיה.</li>
	<li>פנקו את התאים עם חומצה פלמיטית 0.4 מ מ, חומצה סטארית עבור 16 עד 24 h בחממה 37 ° C עם 5% CO 2. השתמש BSA של הפקד שלילי.</li>
	<li>לקצור את התאים עם מרים תא לאחר הטיפול, ספין למטה התאים ב 500 g x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק.</li>
	<li>מכתים את התאים עם Annexin V-Alexa 488 ו- 7-aminoactinomycin D (7-מ) 100 μL annexin V מאגר איגוד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לדלל את הדגימה עם 200 µL מאגר מחייב annexin, מערבבים בעדינות, ואז שומרים את הדגימות על הקרח לאחר תקופת הדגירה.</li>
	<li>לנתח את התאים מוכתם בהקדם האפשרי על ידי cytometry זרימה 5. Annexin V-Alexa 488 מזוהה בערוץ FITC, 7-מ ומתגלה בערוץ PerCP/PerCP-Cy5.5.</li>
</ol> 4. צביעת Ceramide תאיים <ol><li>לאחר טיפול חומצת שומן, לקצור את התאים כמו שלב 3.3. אז תתקן את התאים ב- 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות</li>
	<li>לרחוץ את הדגימה עם PBS 1 x 1 מ"ל, ספין למטה כמו 3.3, ולקבל את תגובת שיקוע decant.</li>
	<li>כתם התאים עם נוגדן anti-ceramide הראשי (דילול 1:200) במאגר 100 μL 1 x permeabilization במשך 30 דקות</li>
	<li>שטיפת ו ספין למטה את התאים שוב כמו שלב 4.2.</li>
	<li>כתם התאים עם אנטי-העכבר IgM משני נוגדנים (דילול שבערך) במאגר 100 μL 1 x permeabilization במשך 30 דקות</li>
	<li>שטיפת ו ספין למטה שוב כמו שלב 4.2 התאים. להוסיף 250 μL 1 x PBS ולנתח את התאים מוכתם על ידי cytometry זרימה 5. 
	הערה: ראה את הרשימה ריאגנט מפורט בטבלה של ציוד, ריאגנטים.</li>
</ol>

<ol><li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+%28J774%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li>
<li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li>
<li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock%3A+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li>
<li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+as+fatty+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li>
<li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+%28sterol+carrier+protein-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li>
<li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים כספיים.

הכנה נכונה של חומצת שומן פתרון יש חשיבות קריטית כדי ללמוד את התפקוד הביולוגי של חומצות שומן. הניטרול של חומצת שומן מעלה מסיסות שלה ב תמיסה מימית. עם זאת, מלחי נתרן של חומצות שומן, בעיקר חומצות שומן רוויות, הן עדיין של מסיסות נמוכה במים או PBS הבחנו. שיטה אחת היא להשתמש אתנול 95-100% כדי לסייע לפזר את חומצת שומן1. באמצעות שיטה זו, רעילות גבוה יותר לתאים ייבחנו אפילו בריכוזים נמוכים עבור חומצות שומן בלתי רוויות פחות רעיל. דרך נוספת להכין פתרון חומצת שומן היא לנצל מתיל-β-cyclodextrin כמערכת משלוח כך ...

חומצות שומן לשחק תפקיד חיוני לחילוף חומרים של אנרגיה, הסינתזה של קרום phospholipids סוגים שונים של תאים. חומצות שומן יש המסיסות מימית נמוכה. הכנה מתאימה של חומצות שומן יש חשיבות קריטית ללמוד על תפקודים ביולוגיים של חומצות שומן בתאי יונקים. כאשר חומצות שומן מוכנים עם אתנול, חומצות שומן רבים עשוי להראות השפעתם רעילים סבון (דטרגנטים) על קרום התא, אפילו בריכוזים נמוכים יחסית1. בתור נהג טבעי, רס ן עבור חומצות שומן בחינם בהסרום, אלבומין נחשב נשאית טוב של חומצת שומן משלוח במבחנה חומצת שומן פונקציה מבחני2,3,4. עם זאת, הפרטים של הכנת המספר המשלים חומצת שומן, אלבומין בדרך כלל אינם זמינים אף-על-פי פורסמו עבודות מחקר רבות באמצעות חומצות שומן.
מקרופאגים לבטא מאוד אפידרמיס חומצת שומן מחייב חלבון ואת אדיפוז חומצת שומן מחייב חלבון5,6,7,8. הם באופן פעיל ספיגת רווי, חומצות שומן בלתי רוויות אשר ייתכן לווסת פונקציות החיסונית שלהם. לחקור את ההשפעה של חומצות שומן על מקרופאגים ותאים אחרים, שיטות שונות של הכנת חומצות שומן היו יישומית1,7,9. באמצעות חומצת שומן מוכן כראוי/סרום אלבומין conjugates לחקור את ההשפעה של חומצות השומן על תפקוד מקרופאג יש חשיבות קריטית בקבלת נתונים משמעותיים מבחינה ביולוגית. מחקרים על ההשפעה של חומצות השומן על תפקוד מקרופאג יכול לספק ידע בסיסי פוטנציאלים טיפולית הנוגעים מטבוליזם חומצות שומן מעורב מקרופאג מחלות.

<table><tbody><tr><td>אמבט אולטרסאונד CPX&nbsp;</td><td>Bransonic</td><td>דגם 2800</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלמיטט (PA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1109</td><td>M.W. 278</td></tr><tr><td>נתרן סטארט (SA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA), ללא חומצות שומן</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>גורם מגרה מושבת מקרופאגים של עכבר (mM-CSF)&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות סלולרי, &nbsp; בע"מ</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי נגד סרמיד (IgM של עכבר)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>שיבוט: MID 15B4</td></tr><tr><td>נוגדן IgM נגד עכבר, ומיקרו; שרשרת, FITC מאגר</td> קיבוע <td>מצומד Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פרמביליזציה</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה של תאי דם אדומים&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Binding Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>תאי L929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; מרים תאים&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>הערה: M.W. מיועד למשקל מולקולרי.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חומצות שומן רוויות לגרום מוות תאי מקרופאג ceramide-הקשורים

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

מקרופאגים לבטא מאוד אפידרמיס חומצת שומן מחייב חלבון ואת אדיפוז חומצת שומן מחייב חלבון. הם באופן פעיל ספיגת רווי, חומצות שומן בלתי רוויות, אשר עשויים לשחק תפקיד קריטי בוויסות פונקציות החיסונית שלהם. מחקרים רבים הראו כי חומצות שומן שונות, רווי או במאי רוויים, בעלי השפעות שונות על צמיחת תאים ותפקוד. עם זאת, הגישות המשמש להכנת חומצת שומן משתנים, אשר עלול להוביל לתוצאות שאינן-פיזיולוגיים. אלבומין, נשאית הטבעי של חומצות שומן בדם היקפי יונקים, מומלצת ויוצרים את המספר המשלים מורכבים עם מלח הנתרן של חומצות שומן כדי לחקור פונקציה חומצת שומן בתאי יונקים, ובכך לחסוך הרעילות של חומצת שומן סבון. לפיכך, פשוט, מהיר יחסית חימום, sonicating שיטה שפותחה, המובאת כאן על היווצרות תרכיב חומצה BSA-שומן. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות חומצות שומן רוויות, חומצות סטארית במיוחד כדי לגרום מוות תאי חמור ב העכבר מח נגזר מקרופאגים. נדגים בהמשך כי מות תאים הנוצרות על-ידי חומצות שומן רוויות קשורה באופן חיובי ceramide הסלולר שהצטברו רמות. בשיטה זו ניתן להרחיב ללימודי ההשפעה של חומצות השומן בתאי יונקים אחרים.

השמנת יתר מגדילה את ריכוז חומצות השומן החופשיות בנסיוב. כמו המקצועי phagocytes, מקרופאגים פעיל לקחת את חומצות השומן כדי לשמור על הומאוסטזיס המארח. במהלך תהליכים אלה, ליפידים עומס יתר עלול לגרום מוות תאי מקרופאג. לשם כך, אנו תרבותי BMDMs במבחנה עם רמות מהשמנת יתר של חומצות שומן תזונתיים מוות תאי מקרופאג נמדד באמצעות זרימת cytometric מכתים. בהשוואה הפקד BSA, חומצות שומן רוויות, בפרט חומצות סטארית, המושרה בתא משמעותיים מות BMDMs. תאים מתים הוצגו כמו אוכלוסיות חיובית כפולה מוכתמת Ann...

אנחנו להמחיש שיטה ישר קדימה כדי להפיק מאתר ראשי מקרופאגים מתאי מח עצם, שיטה פשוטה להכנת BSA-חומצות conjugates. ואז נדגים כי חומצות שומן רוויות יכול לגרום מוות תאי מקרופאג, כגון מוות של תאים קשורה באופן חיובי הסלולר הצטברות ceramide רמות.

חומצות שומן רוויות לגרום מוות תאי מקרופאג Ceramide-הקשורים

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה, שבו מטפלים במקרופאגים בחומצות שומן רוויות, היא להוכיח כי מוות תאי מקרופאגים המושרה על ידי חומצות שומן רוויות קשור לרמות תאיות מצטברות של סרמידים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדלקת המטבולית. כגון: מוות ודלקת תאים הנגרמת על ידי חומצות שומן רוויות.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לספק גישה פשוטה אך מפורטת להנעת מצומדים של חומצות שומן BSA. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שזה מאתגר להכין תמיסה מצומדת חומצת שומן BSA יציבה ומדויקת עם תוצאות עקביות. התחל הליך זה בהסרת עצמות השוקה ועצם הירך מעכבר בר בריא בן שישה עד שמונה שבועות שהורדם, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.חותכים את שני קצוות עצמות השוקה ועצם הירך בעזרת מספריים ומכסה מנוע סטרילי לתרבית רקמות. שטפו את העצמות עם מחט בגודל 25 עם PBS בתוספת שני אחוז סרום בקר עוברי לתוך צינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את תאי מח העצם ב -500 גרם, ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מאגר ליזה של תאי דם אדומים כדי ליז כדוריות דם אדומות למשך פחות מדקה אחת. מדללים את התאים מיד עם תשעה מיליליטר של 1x PBS. שוב צנטריפוגה, כמו קודם, ושפכו את הסופרנטנט.השעו מחדש את גלולת התא ב-10 מיליליטר של 1x PBS. לאחר מכן, סנן את מתלה התאים דרך רשת ניילון סטרילית של 40 מיקרון לתוך צינור נוסף של 15 מיליליטר כדי להסיר פסולת תאים וגושים. לאחר צנטריפוגה כמו קודם, השעו מחדש את כדור התא ב-15 מיליליטר של מכון רוזוול פארק ממוריאל מדיום 1640 עם חמישה אחוז FBS ו-10 מיקרוגרם למיליליטר של גנטמיצין.לאחר מכן, צלחו את התאים בצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר והכניסו אותה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. סובבו בעדינות את המנה, הוציאו את התאים הצפים וספרו אותם. לאחר מכן, צלחת 6,000,000 תאים בצלחת של 100 מילימטר עם 12 מיליליטר של מדיה מבדלת מקרופאגים ו-10 ננוגרם למיליליטר של גורם מגרה מושבת מקרופאגים רקומביננטי של עכבר, או MCSF, למשך יומיים.לאחר תרבית במשך יומיים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי CO2, האכילו כל מנה בשישה מיליליטר של חומר מבדיל מקרופאגים טרי המכיל 10 ננוגרם למיליליטר MCSF. ביום החמישי, הוציאו שמונה מיליליטר מהמדיה הישנה מבלי להפריע לתאים והוסיפו 10 מיליליטר של מדיה מבדלת מקרופאגים טרייה עם 10 ננוגרם למיליליטר MCSF. ביום השביעי, קצרו את המקרופאגים שמקורם במח העצם, או BMDM, באמצעות מרים תאים.אשר את הפנוטיפ של BMDMs על ידי Flow Cytometry, כפי שמוזכר בפרוטוקול הטקסט. להכנת מצומד חומצות השומן BSA, הכינו מלח נתרן בודד של חמישה מילי-מולרי של חומצות שומן ב-BSA של שתי מילי-מולריות. מחממים את התערובת ל-37 מעלות צלזיוס ומעלה במידת הצורך.לאחר מכן, סוניק מחממים את התערובת של שני מילי-מולרי BSA ומלח נתרן של חומצות שומן עד לקבלת תמיסה ברורה. לאחר סוניקציה, סנן את תמיסת BSA של חומצת השומן, דרך פילטר של 0.22 מיקרון. לאחר מכן, ציטט את התמיסה המסוננת לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר.אחסן את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס לשימוש קצר טווח, או במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. אין להקפיד על משקעים לאחר האחסון בארבע מעלות צלזיוס במקרר. צלחת את ה-BMDM בצלחת תרבית רקמה של 24 בארות עם 0.4 מיליון תאים למיליליטר במדיה מבדלת בין מקרופאגים.טפל בתאים עם חומצה פלמיטית של 0.4 מילי-מולרית וחומצה סטארית במשך 16 עד 24 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי CO2. השתמש ב-BSA כביקורת שלילית. קצרו את התאים בעזרת מרים תאים לאחר הטיפול.לאחר מכן, סובב את התאים ב -500 גרם, ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. צבעו את התאים עם Annexin V-Alexa 488 ו-7-AAD ב-100 מיקרוליטר של מאגר מחייב Annexin-V למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מדללים את הדגימה עם 200 מיקרוליטר של מאגר מחייב אנקסין ומערבבים בעדינות.שמור את הדגימות על קרח לאחר תקופת הדגירה. נתח את התאים המוכתמים בהקדם האפשרי על ידי ציטומטריית זרימה. נספח V-Alexa 488 מזוהה בערוץ FITC ו-7-ADD מזוהה בערוץ PerCP PerCP-Cy5.5.לאחר טיפול בחומצות שומן, קצרו את התאים כמו קודם. לאחר מכן, תקן את התאים בארבעה אחוזים פרפורמלדהיד למשך 30 דקות. שטפו את הדגימה במיליטר אחד של 1x PBS לפני שתסובבו את הדגימה כמו קודם.לאחר הסרת הסופרנטנט, יש לצבוע את התאים בנוגדנים ראשוניים נגד סרמיד ב-100 מיקרוליטר של מאגר חדירות 1x למשך 30 דקות. לאחר שטיפה וצנטריפוגה של התאים כמו קודם, יש לצבוע את התאים בנוגדנים משניים IgM נגד עכבר ב-100 מיקרוליטר של מאגר חדירות 1x למשך 30 דקות. שוטפים וסובבים את התאים שוב כמו קודם.לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר של 1x PBS ונתח את התאים המוכתמים על ידי Flow Cytometry. BMDMs תורבו במבחנה עם רמות השמנת יתר של חומצות שומן תזונתיות ומוות תאי מקרופאגים נמדד באמצעות צביעה ציטומטרית של זרימה. בהשוואה לביקורת BSA, חומצות שומן רוויות, במיוחד חומצות סטריות, גרמו למוות תאי משמעותי של BMDM.תאים מתים הוצגו כאוכלוסייה חיובית כפולה שהוכתמה על ידי נספח V ו-7-AAD. יתר על כן, מוות תאים המושרה על ידי חומצות שומן רווי קשור באופן חיובי לרמות סרמיד תאיות מצטברות במקרופאגים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין צימודי חומצות שומן BSA ולטפל במקרופאגים עם מצומדים של חומצות שומן BSA כדי לחקור מוות ודלקת של תאים.עם פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הדלקת המטבולית לחקור מוות תאים הנגרם על ידי חומצות שומן רוויות ודלקת בהשמנת יתר.

saturated-fatty-acids-induce-ceramide-associated-macrophage-cell-death

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כדי לבדוק את האינטראקציה של חלבון עם שומנים היעד השתמשנו macs ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים שלפוחית ​​השומנים מסונתז מ השומנים היעד Annexin V-מחייב phosphatidylserine. חלבונים חייב השומנים היעד הם שיתוף מטוהרים ונותחו לאחר elution מן החרוזים.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

סרטון זה מדגים את ההפעלה של חלבוני קספז במקרופאגים אנושיים באמצעות חלבוני כתב משלים פלואורסצנטיים דו-מולקולריים. הפרו-תחומים של קספאז-1 מתמזגים עם מקטעים לא פלואורסצנטיים של חלבוני ונוס, המגויסים לקומפלקסים דלקתיים. הקרבה של inflammasomes גורם refolding ו fluorescence של שברי נוגה, המאשר הפעלת קספז במקרופאגים.

הדמיה של הפעלת קספז במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

סרטון זה מדגים את ההערכה של הפעלות קספז מרובות במקרופאגים שמקורם במח עצם באמצעות גירוי עם נגיף השפעת. בעקבות ליזה מקרופאגים, נטרול חום של ליזט וצנטריפוגה, נאספים קספזות תוך תאיות לניתוח חיסוני עוקב.

הערכת ההפעלה של קספזות מרובות במקרופאגים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת אירועי איתות תוך-תאיים המושרים בתאים ברי קיימא על ידי אינטראקציה פיזית עם תאים מתים או גוססים סמוכים. הפרוטוקול מתמקד באירועי איתות המושרים על ידי זיהוי בתיווך קולטנים של התאים המתים, בניגוד לספיגה הפגוציטית שלהם או שחרור של מתווכים מסיסים.

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

פרוטוקול זה מאפשר חוקר לבודד ולאפיין רקמות תושב מקרופאגים שונות הולמרק רקמות מודלק שחולצו מן הדיאטה-induced מודלים של הפרעות מטבוליות.

בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

אנו מתארים את הגילוי של הפעלת inflammasome NLRP3 על בסיס הסלולר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, צביעת עבור קספאז פעיל-1 ואת המתאם, עולה. Assay שחרורו לקטט דהידרוגנאז מוצג כדי לזהות פירוק pyroptotic על בסיס האוכלוסייה. טכניקות אלו ניתן להתאים ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה inflammasome.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה להשגת מקרופאגים שמקורם במונוציטים (MDM) מדגימות דם אנושיות, שיטה פשוטה להחדרה יעילה של כתבי השלמה פלואורסצנטית דו-עינית (BiFC) של קספאזה דלקתית ל-MDM אנושי מבלי להתפשר על הכדאיות וההתנהגות של התאים, וגישה מבוססת הדמיה למדידת הפעלת קספאזה דלקתית בתאים חיים.

הדמיה של קספאזות דלקתיות המושרות קרבה במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה מקיפה להערכת הפעלת קספאז (קספאז-1, קספאז-3, קספאז-7, קספאז-8, קספאז-9 וקספאז-11) בתגובה הן למודלים במבחנה והן ב-in vivo (בעכברים) של זיהום, עלבונות סטריליים וסרטן כדי לקבוע את התחלתם של מסלולי מוות תאי, כגון פירופטוזיס, אפופטוזיס, נקרופטוזיס ו-PANoptosis.

הערכת הפעלת קספז להערכת מוות מולד של תאי מערכת החיסון

פרוטוקול זה מבוסס על LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V ו-7-AAD כדי לזהות מוות תאי, תוך שימוש בתא כולו ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצפות במורפולוגיה של קרום התא.

LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA ותיקופו

Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

למד כיצד לגרום למוות תאי מקרופאג מעצם עכברים באמצעות חומצות שומן רוויות ולמדוד צבירת Ceramide. שיטה זו מספקת גישה פשוטה לחקר דלקת מטבולית ומנגנוני מוות תאי במחקרים עתידיים.

חומצות שומן רוויות לגרום מוות תאי מקרופאג Ceramide-הקשורים

גלה סרטונים נוספים