ניתוח של תאים חיסוניים העצבים ממוגלה יחיד, גנגליון העזוב השורש של עכבר אחת באמצעות Cytometry זרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג מספיק תאים מגנגליוני שורש גב ועצבים סיאטיים מעכבר בודד כדי להיות מסוגל לבצע ניתוח זרימה ציטומטרית של התאים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שחומר עצבי היקפי מייצר כמויות גדולות של פסולת בעת העיכול. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שניתן להשתמש במספר סמנים בו זמנית לזיהוי סוגי תאים מרובים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון דלקת ואימונופתולוגיה במהלך נוירופתיה. בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנה למודלים של עכברים, ניתן ליישם אותה גם על אורגניזמים אחרים, כגון עצבים אנושיים וחזירים, עם שינויים קלים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה יתקשו בגלל כמויות הפסולת הגדולות שנוצרות על ידי העיכול.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לבצע את שלבי הדיסקציה והדיסוציאציה של התאים מכיוון שהחומר העצבי לכל עכבר מגביל. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר ראינו פרוטוקול המבודד תא ברבור מהעצב הסיאטי מהמעבדה של סטיב לקרואה. כדי להתחיל, הכינו את העכבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה ומקמו אותו עם הצד הגחוני כלפי מטה תוך מתיחת הגפיים התחתונות.

לאחר מכן, השתמש בזוג מלקחיים כדי לנתח באופן דו-צדדי את כל העצבים הסיאטיים. התחל בהפרדת רקמת השריר מהירך הגבית העליונה ועקוב אחר העצב למעלה לאורך עמוד השדרה. חותכים את העצב במקום בו הוא יוצא מעמוד השדרה ומיד מעל הברך בקצה השני.

לאחר מכן העבירו את העצבים שנכרתו לצינור של 1.5 מיליליטר המכיל 1 מיליליטר של PBS קר כקרח. אחסן את העצבים על קרח. לאחר מכן, בודד את גנגליון השורש הגבי.

התחל בחיתוך הצלעות במקביל וקרוב לעמוד השדרה משני הצדדים. לאחר מכן, חתכו לרוחב את עמוד השדרה בגובה עצם הירך בצד האחורי וקרוב לגולגולת בצד הקדמי. הסר את עמוד השדרה והשתמש במספריים לקשתית כדי לחתוך את כל השרירים, השומן והרקמות הרכות האחרות מעמוד השדרה.

לאחר מכן, הניחו את עמוד השדרה כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה ופתחו אותו החל מקצה הזנב על ידי החלקת קצה אחד של המספריים לתוך תעלת החוליות במצב השעה 12 וחיתוך העצם. המשך עד לחיתוך כל עמוד השדרה, חזור על הליך זה במצב השעה שש עד שעמוד השדרה נחתך בחצי. הפרד את שני חצאי עמוד השדרה, ולאחר מכן הנח את הדגימה מתחת למיקרוסקופ דיסקציה.

הסר את חוט השדרה כדי לחשוף את עצבי עמוד השדרה, ולאחר מכן אתר והסר את גנגליוני השורש הגבי המותני על ידי משיכה עדינה של השורש הגבי כדי למשוך אותו לתעלות החוליות. לאחר מכן, השתמש במספריים לקשתית כדי לקצץ את העצבים ורקמת החיבור סביב גנגליון השורש הגבי. בעזרת מלקחיים מעבירים את גנגליוני השורש הגבי לצינור של 1.5 מיליליטר ומאחסנים אותם על קרח.

כדי לאתר את גנגליוני השורש הגביים, לחלץ אותם מבלי לפגוע בהם ולשחרר אותם מעצב עמוד השדרה, נדרש תרגול ומיומנות. הכינו אמצעי עיכול, הוסיפו לו מאה מיקרוגרם למיליליטר דאוקסיריבונוקלאז ואחסנו אותו על קרח. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של אמצעי עיכול לכל אחד מהצינורות עם העצבים הסיאטיים וגנגליוני השורש הגביים.

עבור העצבים הסיאטיים, קוצצים את החומר 15 עד 20 פעמים בעזרת מספריים קפיציים, ולאחר מכן מדגרים את מתלי הרקמות בחממה רועדת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בתסיסה עדינה. לאחר הדגירה, יש לשלש שוב ושוב את תרחיף התאים דרך קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי לנתק מכנית כל רקמה מעוכלת שלא בשלמותה. חזור על הטריטורציה דרך קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.

לאחר מכן דגרו את הדגימה למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה. הכן את מאגר ה-FACS הקר כקרח והשתמש בו כדי לשטוף ולהשרות מסך נירוסטה בגודל רשת של 140 מיקרון בצלחת פטרי של 60 מילימטר על קרח. לאחר מכן, השתמש במלקחיים קהים כדי להחזיק את מסנן המסך של 140 מיקרון מעל צלחת הפטרי ולהעביר שוב ושוב את מתלי הרקמה דרך המסנן.

אסוף את תרחיף התאים מצלחת הפטרי והעביר אותו לאותו צינור של 1.5 מיליליטר המאוחסן על קרח. דחף כל רקמה מעוכלת שנותרה על המסנן על ידי טריטורציה חוזרת עם קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר. לאחר מכן, שטפו את מסנן המסך פעמיים עם 500 מיקרוליטר של מאגר FACS ושלבו אותו עם מתלה התא בצינור של 1.5 מיליליטר.

אם יותר מדי מהדגימה מתעכלת באופן לא מלא ומועברת דרך רשת המתכת, עלול להתרחש אובדן תאים וניתוח ציטומטריית זרימה עשוי להיות בלתי אפשרי. צנטריפוגה את מתלי התאים והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מאגר FACS.

חזור על שלב כביסה זה פעם אחת, והשהה מחדש את גלולת התא הסופית ב-150 עד 350 מיקרוליטר של מאגר FACS. התאים מוכנים כעת לצביעה. במחשב, בחר את הערוצים המתאימים לזיהוי הפלואורופורים המעניינים, את קצב הזרימה המתאים של הדגימות ואת המספר הכולל של האירועים שיש לאסוף לכל דגימה.

מספר האירועים המינימלי צריך להיות מיליון. לאחר מכן, צור עלילות פיזור תחת גליון עבודה גלובלי של פיזור הצד A לעומת הפיזור קדימה A וכן עבור כל פלואורופור מעניין לעומת הפיזור קדימה A.כמו כן, צור תצוגה סטטיסטית שתציג את מספר האירועים ואת עוצמת הפלואורסצנט הממוצעת עבור הפלואורופורים שנבחרו. קבע את שער האב, P1, בהתבסס על תרשים פיזור מפקדי צביעה של DAPI בלבד.

צרף את הדגימה לזרימה ציטומטריה ולחץ על רכישה. התבונן בעלילת DAPI לעומת FSC והפחית את המתח של הערוץ הכחול הפסיפי של ה-DNA עד שאוכלוסיית DAPI+. בעזרת הכלי שער מלבן, צייר תיבה סביב אוכלוסיית DAPI+.

זה מייצג את שער P1. בחר את תרשימי הפיזור עבור כל אחד מהפלואורופורים והצג רק את אירועי DAPI+. זה מייצג את הקרינה ברקע עבור כל אחד מהפלואורופורים.

גם באמצעות שער המלבן, צייר תיבה בתרשים הפיזור עבור כל אחד מהפלואורופורים, החל מ-103 על ציר ה-y. שער זה מייצג את האזור שבו יש למצוא אירועים חיוביים עבור כל אחד מהסמנים המוצהרים. כוונן את המתחים עבור כל אחד מהפלואורופורים באמצעות בקרות הצביעה של DAPI בלבד.

צרף את הדגימה לזרימה ציטומטריה ולחץ על רכישה. התבונן במיקום אוכלוסיית ה-DAPI+עבור כל אחד מהפלואורופורים והתאם את המתחים המתאימים כך שהאוכלוסיות ייפלו מחוץ לשער המלבן. לאחר הגדרת ציטומטר הזרימה, הפעל את הדגימות וייצא את קבצי הפיזור קדימה להמשך ניתוח.

שטיפת כתם ה-DAPI לפני הניתוח על ידי זרימה ציטומטרית הפחיתה את עוצמת הפלואורסצנט של הפסולת הלא גרעינית. זה איפשר להוציא את החומר בקצה העליון של ציר הפיזור קדימה, המכיל רקמה מעוכלת באופן לא מלא, בבחירת אוכלוסיית הסינגלט. בסך הכל, ניתן להשיג באופן קבוע יותר מ-30,000 סינגלטים משני עצבים סיאטיים מלאים וניתן להשיג יותר מ-200,000 סינגלטים מגנגליוני השורש הגביים.

מהעצבים הסיאטיים, כ-5% מהסינגלטים ביטאו CD45 על פני השטח שלהם, בעוד שכ-5% עד 10% נמצאו כמבטאים אותו בגנגליונים של השורש הגבי ובכך הגדירו תאים אלה כלויקוציטים ממקור המטופויטי. רוב הסינגלים החיוביים ל-CD45 ביטאו גם MHC Class II בצורה הדרגתית. בגנגליוני השורש הגביים, CD11b יכול לשמש לאיתור תאים דמויי מיקרוגליה; אוכלוסיית מיקרוגליה זו נעדרת מהעצבים הסיאטיים.

בעצב הסיאטי ובגנגליון השורש הגבי, 2% עד 5% מהסינגלטים ביטאו CD68. בעצבים הסיאטיים כ-60%80% מהמקרופאגים החיוביים CD68 ביטאו CD206. בעוד שחלק קטן יותר מהחיובי CD68 ביטא במשותף CD206 בגנגליון השורש הגבי.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על טמפרטורה עקבית על מנת להבטיח תוצאה עקבית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחום הסוכרת לחקור את ההשפעות הרעילות של סטרפטוזוטוצין המשמש להשראת סוכרת בעכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ציטומטריית זרימה על רקמה עצבית היקפית.

אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות ומשקפי מגן.