במבחנה אנזים המדידה לנקודת מבחן תגובתיות המלווה תרופתי פאברי, מחלת הפומפה

יש דרישה לעשות ניסויים פרה-קליניים של בדיקות עבור מחלקה הרומן של תרופות היתום"בשם מלווים תרופתי לשחזור, מהיר ויעיל. פיתחנו assay המבוסס על תרבות של תאים פשוטים מאוד מתוקננת, תכליתי למסך המטופלים זכאים, כמו גם רומן המלווה תרופתי סמים.

המטרה הכוללת של פרוטוקול תרבית תאים מתוקן זה היא לספק הערכה פנוטיפית מהירה של שונות אללית במחלת פברי ופומפה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות אגירה ליזוזומליות, כגון תוצאות פרוגנוסטיות והחלטות טיפוליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת לשחזור מאוד ושהיא יכולה לסייע בפיתוח תרופות חדשות, כגון פרמקו-מלווים.

כדי לבצע מוטגנזה מכוונת אתר, התחל בשימוש ברצפי הייחוס NM 00169.2 ו-NM 00152.4 כתבניות למוטגנזה של גנים GLA ו-GAA, בהתאמה. השתמש בכלי החינמי Primer Design כדי לתמוך בעיצוב פריימר. לאחר מכן, יש קבוצה של פריימרים בעלי טוהר גבוה ונטולי מלח המסונתזים על ידי ספק מסחרי, עם פריימרים חישה ואנטי-סנס הנושאים את אחד משינויי הרצף המתאימים, מרכזיים באורכם, כדי להציג את המוטציה בנפרד.

מכינים את תערובת התגובה בנפח של 50 מיקרוליטר ומפעילים את תוכנית ה-PCR בתנאים סטנדרטיים המסופקים על ידי היצרן וכמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר PCR, הוסף מיקרוליטר אחד של אנזים הגבלה Dpn1 והמשך לדגור על בקבוקוני התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הפיכת ה-DNA של הפלזמה לתאי E.coli מוכשרים והכנת פלסמידים של הטרנספורמציה הרצויה על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בכלי ביולוגיה מולקולרית מתאים לניתוח הרצף.

כאשר מתגלה המוטציה הרצויה ולא נראית חריגה נוספת ברצף בהשוואה ל-NM 000169.2 עבור אלפא-גלקטוזידאז A או NM 000152.4 עבור חומצה אלפא-גלקטוזידאז, בחר את השיבוט לטיהור פלסמיד בדרגת טרנספקציה. קבע את טוהר ה-DNA על ידי מדידת הספיגה בספקטרופוטומטר. לאחר גידול תאי HEK293H בבקבוק תרבית T75 על פי פרוטוקול הטקסט, 24 שעות לפני הטרנספקציה, השתמש ב-PBS ללא סידן או מגנזיום כדי לשטוף את התאים פעם אחת.

עם 0.05% טריפסין-EDTA, קצרו את התאים ובחללים של צלחת תרבית של 24 בארות השתמשו ב-500 מיקרוליטר של DMEM בתוספת 10% FBS כדי לזרוע 1.5 פעמים 10 לחמשת התאים. בצע העברת תאים על פי מדריך היצרן. שימוש בתערובת של מיקרוגרם אחד של DNA פלסמיד מומס ב -100 מיקרוליטר של DMEM נטול סרום ו -2.5 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה.

דגרו את התמיסה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ואז הוסיפו אותה לתאים בצורה טיפתית. לאחר תקופה של ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, הסר את המדיום המכיל את מגיב הטרנספקציה והוסף 500 מיקרוליטר של DMEM טרי עם 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. כאופציה במהלך שלב זה, הוסף DGJ או DNJ למדיום התרבית היכן שתוכנן.

ביום הקציר, הוציאו את התאים מהחממה. לאחר מכן שאפו את המדיום והשתמשו ב- PBS עם סידן ומגנזיום כדי לשטוף בזהירות את התאים פעמיים. שלב זה הוא קריטי מכיוון ש-DGJ ו-DNJ הם מעכבים של שני האנזימים, ולכן כל שאריות יפסלו את הבדיקה.

לאחר הכביסה, הוסף 200 מיקרוליטר מים נטולי יונים ישירות על גבי התאים. לאחר מכן שוטפים את התאים מהצלחת ומעבירים אותם לצינור תגובה של 1.5 מיליליטר. הנח את הדגימות במדף קצף מתאים ומערבל אותן למשך חמש שניות כדי להפוך את הליזיס ליעיל יותר.

לאחר מכן החליפו את הדגימות בין חנקן נוזלי למשך 10 שניות לאמבטיית מים בטמפרטורת החדר עד להשלמת ההפשרה. לאחר חזרה על הליך ההומוגניזציה חמש פעמים, סובב את הדגימות למשך חמש דקות ב-10,000 גרם. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור תגובה חדש.

כדי לבצע את בדיקת ה-BCA, הכינו צינור טרי לכל דגימה המכילה 40 מיקרוליטר של H20 נטול יונים והוסיפו 10 מיקרוליטר דגימה. מערבבים כל תמיסה על ידי מערבולת קצרה ומעבירים 10 מיקרוליטר מכל דגימה בשלוש עותקים לחללים של צלחת של 96 בארות. להכנת עקומה סטנדרטית, יש לדלל תמיסת מלאי BSA של 2 מיליגרם למיליליטר ו-H2O נטול יונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

לאחר שילוב מגיב A ומגיב B, התחל את התגובה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של תמיסת ריאגנט BCA ודגירה על הדגימות בחושך ב-37 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד על שייקר מסלולי למשך שעה. לאחר מכן מדוד את הספיגה ב-560 ננומטר בקורא צלחות. הדגימות מכילות בדרך כלל בין 1 ל-1.5 מיקרוגרם חלבון למיקרוליטר.

יש לדלל את הכמות המחושבת של כל דגימה ולהכניס אותה לצינורות תגובה טריים של 1.5 מיליליטר כדי לקבל 0.05 מיקרוגרם של אלפא-גלקטוזידאז A או 0.5 מיקרוגרם של חומצה אלפא-גלוקוזידאז למיקרוליטר תמיסה. מערבל שוב את הדגימות למשך חמש שניות ופיפטה 10 מיקרוליטר מהדילול הזה בשכפול לתוך צלחת של 96 בארות. התחל את התגובות על ידי הוספת 20 מיקרוליטר מתמיסת המצע המתאימה.

עבור אלפא-גלקטוזידאז A, הוסף שני מילי-מולרית 4-methylumbelliferyl alpha-D galactopyranoside, או 4-MU-gal, במאגר פוספט-ציטראט 0.06 מולרי, pH 4.7. עבור חומצה אלפא-גלוקוזידאז, הוסף 2 מילי-מולרית 4-methylumbelliferyl alpha-D גלוקופירנוזיד, או 4-MU-glu, ב-0.025 נתרן אצטט מולארי, pH 4.0. דגרו את תגובות האנזים למשך שעה אחת בחושך ב-37 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד על שייקר מסלולי.

לאחר מכן סיים את התגובה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 1.0 מולארי pH 10.5 מותאם גליצין נתרן-הידרוקסיד. הכן עקומה סטנדרטית של 4 MU ממלאי של 0.01 מיליגרם למיליליטר על פי פרוטוקול הטקסט ופיפטה 10 מיקרוליטר מהתמיסות בשכפול לתוך צלחת של 96 בארות. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר נתרן-הידרוקסיד גליצין 1.0 מולרי לכל באר על מנת להתאים את הנפח וה-pH.

לבסוף, מדוד את פעילות האנזים בקורא תפרחת המצויד בערכת המסננים המתאימה. ולנתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה למכשיר קורא הקרינה. כדי להעריך את היעילות של מוטגנזה של גן GLA, המוטציות סווגו לשלוש קטגוריות וגילו כי כ-66.5% הושגו בניסיון הראשון.

ניתן היה להשיג 25% נוספים לאחר PCR שני שונה מעט. בקטגוריה השלישית, היה צורך להשקיע מאמץ רב יותר, כגון עיצוב מחדש של פריימר, כדי להניב את השיבוט הרצוי. טבלה זו מתייחסת לתוצאות מדידת פעילות האנזים עבור שלוש מוטציות אלפא-גלקטוזידאז A ושלוש מוטציות אלפא-גלוקוזידאז חומצה שלא טופלו או טופלו ב-DGJ ו-DNJ.

הנתונים מוצגים כערכים מוחלטים עבור תחלופת הסובסטרט ויש להם ערכים יחסיים מנורמלים לאנזים מסוג בר. נתוני פעילות האנזים האבסולוטית תוקנו עבור פעילות אנזימים אנדוגנית של תאי HEK293H באמצעות תאים שהועברו עם וקטור PCDNA 3.1 ריק. ערכי פעילות האנזים נורמלו לאנזים מסוג פרא מניסויים מקבילים, מה שמסביר את הסטייה של הערכים היחסיים בין המוטציות השונות.

לאחר השליטה, החלק שלאחר תרבית התאים בניסוי זה, המייצג את רוב הזמן המעשי, יכול להיעשות תוך ארבע שעות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות אגירה ליזוזומליות לחקור מתאמים גנוטיפיים-פנוטיפיים במחלת פברי ופומפה. פרוטוקול זה יכול לסייע בפיתוח תרופות חדשות במחלות אגירה ליזוזומליות.