ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures
28 במרץ 2018
פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה סימולטני של thalamocortical האקסון מסעף סינפסה היווצרות של organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח. Thalamocortical בודדים אקסונים ומסופי presynaptic שלהם הם דמיינו ידי טכניקה אלקטרופורציה תא בודד עם DsRed ו מתויג GFP synaptophysin.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לחקור שינויים מורפולוגיים דינמיים של הסתעפות אקסונים והיווצרות סינפסות בהקרנה התלמוקורטיקלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון היווצרות מעגלים עצביים חדשים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תצפית בו זמנית על צמיחת האקסונים והיווצרות הסינפסות בתאים חיים בודדים.
שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הקשר בין הסתעפות אקסון להיווצרות סינפסות בהקרנות התלמוקורטיקליות. ניתן ליישם אותו גם על מעגלים עצביים אחרים, כגון חיבור פנימי בקליפת המוח. כדי להתחיל בהליך זה, יש לעקר את כל מכשירי הניתוח עם 70% אתנול למשך 10 דקות או יותר.
לאחר מכן, נתחו את כל המוח במהירות מחולדה שלאחר הלידה ביום השני תחת הרדמה קרה כקרח. לאחר מכן, הניחו את המוח בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר המכילה 40 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק. תחת מיקרוסקופ דו-עיני, הסר את חומר ה-pia בזהירות בעזרת מלקחיים עדינים, וחתוך את קליפת המוח הראייתית והסומטוסנסורית הראשונית לפרוסות בעובי של 300 עד 400 מיקרון באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיים.
לאחר מכן, העבירו את פרוסות קליפת המוח אל פילטר הממברנה של תוספת התרבות באמצעות פיפטה פלסטיק חד פעמית. התאם את מיקומי הפרוסות ליד מרכז תוספת התרבית עם פיפטת הפלסטיק החד פעמית, והסר עודפי מדיום מהתוספת. שמרו את הפרוסות במדיום התרבית המכיל סרום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ותרבו אותן לבד למשך יום אחד לפני שמניחים לידו גוש תלמי מעובר E15.
התאם את מפלס המדיום מעט מתחת לפני השטח של הפרוסה, כך שהפרוסות יוכלו לקבל אספקה מספקת של הגז וגם של המדיום. זה חיוני לכדאיות הפרוסות. בשלב זה, הכינו את נימי הזכוכית בעזרת מושך אלקטרודות.
ואז שוברים את קצות נימי הזכוכית להזרקת פלסמיד. עבור פיפטות האלקטרודות, טוחנים ומלטשים את קצות נימי הזכוכית בנייר זכוכית. ואז ללטש אותם באש כדי להשיג קוטר פנימי של 50 עד 200 מיקרון.
לאחר מכן, חבר את פיפטת האלקטרודה ואת פיפטת הפליטה למניפולטורים. העבירו חמישה מיקרוליטר תמיסת פלסמיד לצלחת פטרי. ואז משוך את התמיסה לתוך פיפטת האלקטרודה בפעולה נימית.
הכנס את האלקטרודה בקוטר 0.2 מילימטר לתוך פיפטת האלקטרודה. לאחר חיבור פיפטת הפליטה למזרק של מיליליטר עם צינור פלסטיק, העבירו שוב חמישה מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד לצלחת פטרי. לאחר מכן משוך לאט את התמיסה לתוך פיפטת הפליטה באמצעות המזרק.
לאחר מכן, העבירו את הקוקולטורה בשלב האלקטרופורציה והכניסו את האלקטרודה בקוטר מילימטר למדיום התרבית. לאחר מכן, הנח את פיפטת הפליטה על גוש התלמוס המתורבת. דחוף את המזרק ידנית לאחר שהקצה נוגע במשטח גוש התלמוס.
הנח את פיפטת האלקטרודה על הגוש התלמי מיד לאחר נסיגת פיפטת הפליטה. כעת, העבירו את הפולסים החשמליים. עקוב אחר המשרעת ומספר הרכבות באוסילוסקופ.
לאחר מכן, החזר את פיפטת האלקטרודה והחזיר את המנה לחממה. כדי להתבונן בדגימה, הנח את צלחת התרבות על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף המצויד בשני ערכות סינון עבור EGFP ו-DsRed. לאחר מכן צלם תמונות של 10 עד 25 מקטעים אופטיים, בגדלים של צעד אחד עד שבעה מיקרון, עם עדשת אובייקט למרחק עבודה ארוך פי 20.
בחר אקסונים מסומנים הניתנים להבחנה בנפרד, המבטאים גם DsRed וגם Syp-EGFP. מוצגת כאן קוקולטורה אורגנוטיפית של פרוסות תלמוס וקליפת המוח לאחר 12 DIV. הנה תמונה מוגדלת של האזור הסגור.
והנה תא תלמי עם תווית DsRed שמרחיב אקסון לתוך הפרוסה בקליפת המוח, ויוצר ענפים בשכבות העליונות. תמונות אלה מציגות את האקסון התלמוקורטיקלי המסומן ב-DsRed ואת הפונקטה Syp-EGFP. הצטברות בדידה של Syp-EGFP נצפתה לאורך אקסון תלמוקורטיקלי יחיד.
פלסמידים DsRed בתוספת Syp-EGFP הוכנסו לתאי תלמוס מתורבתים ב-DIV אחד באמצעות אלקטרופורציה. אקסון זה צולם מדי יום במשך ארבעה ימים. הסתעפות האקסונים והיווצרות הסינפסות היו דינמיים, עם הוספה וחיסול.
בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע אלקטרופורציה עם גנים מעניינים יחד עם Syp-EGFP ו-DsRed על מנת לחקור את תפקיד הגן בהסתעפות אקסונים ובהיווצרות סינפסות. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור את מנגנוני השינויים הדינמיים של מעגלים עצביים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לדימוג סימולטני של התבסעות אקסונים תלמו-קורטיקליים ויצירת סינפסות בתרביות משותפות (cocultures) אורגנוטיפיות של התלמוס ושל קליפת המוח. המחקר מתמקד בשינויים מורפולוגיים דינמיים בהקרנה התלמו-קורטיקלית, ומספק תובנות על היווצרות מעגלים עצביים חדשים ועל הקשר בין צמיחת האקסונים לפיתוח הסינפסות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- נוירוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- הקרנות תלמו-קורטיקליות ממלאות תפקיד קריטי בעיבוד חושי.
- הבנת התבססות האקסונים ויצירת סינפסים חיונית להשגת תובנות על היווצרות מעגלים עצביים.
- לשיטות הנוכחיות יש מגבלות בתצפית על שינויים אלו בו-זמנית ברמה התאית.
- המחקר מקדם טכניקות לדימות בהקשרי תאים חיים.
מטרת המחקר
- לבחון שינויים מורפולוגיים דינמיים במהלך התבסעות אקסונים ויצירת סינפסים.
- לספק שיטה המאפשרת תצפית על תאים חיים בודדים בתרבית משולבת (coculture).
- להעריך את הקשר בין צמיחת אקסונים לבין התפתחות סינפטית בנוירונים תלמו-קורטיקליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש בתרביות שותפות (cocultures) אורגנוטיפיות של פרוסות תלמיות וקורטיקליות.
- רקמה מחולדה ביום שני לאחר הלידה שימשה ליצירת המודל הביולוגי.
- בוצע תהליך אלקטרופורציה להחדרת סמנים פלואורסצנטיים לצורך דימות.
- התרביות הוחזקו בטמפרטורה של 37 °C ונצפו בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות.
- הדימות בוצע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לתעד את הדינמיקה האקסונלית.
תוצאות עיקריות
- נצפו שינויים דינמיים בהסתעפות האקסונים ובהיווצרות סינפסים, המדגישים פלסטיות בהשלכות התלמו-קורטיקליות.
- הבחינה העלתה הצטברות נפרדת של סממנים סינפטיים לאורך האקסונים, דבר המצביע על התפתחות סינפטית מתמשכת.
- הטכניקה אפשרה תצפית בזמן אמת על שינויים מורפולוגיים בתאים בודדים.
- הממצאים מדגישים את הפוטנציאל לחקירת תפקידי גנים בדינמיקה של אקסונים וסינפסים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה חדשנית לחקר דינמיקה ופלסטיות של מעגלים עצביים.
- הוא מספק תובנות לגבי הזיקה בין צמיחת אקסונים להיווצרות סינפסות.
- לממצאים יש השלכות על הבנת מנגנונים של קישוריות עצבית ופלסטיות במצב בריאות ובמחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה סימולטנית של התבסעות אקסונים ויצירת סינפסות במעגלים עצביים חיים, ובכך היא נותנת מענה לפער מכניסטי מרכזי בתיקוף מטרות פיתוח עצבי. על ידי אספקת נתונים ברזולוציה של תא בודד ובאופן דינמי על פלסטיות מבנית, היא תומכת בביטחון חיזוי בשלבי גילוי מוקדמים, שבהם הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות סינפטיות היא קריטית. גישה זו מציעה רצף תרגומי מהבנה מכניסטית ועד להערכה פרה-קלינית של פנוטיפים ברמת המעגל במודלים של מחלות נוירופסיכיאטריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקושרות בין מורפולוגיה של אקסונים לבין קישוריות סינפטית במסלולים תלמו-קורטיקליים.
- ערך תפעולי: משמר את הארכיטקטורה הלמינרית ואת החיוניות הנוירונלית לצורך תצפית אורכית על שינויים מבניים דינמיים.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת קשרים סיבתיים בין צמיחה מבנית לבין סינפטוגנזה תפקודית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות ומרובות-מדדים (multiplexed) של הסתעפות אקסונית והצטברות סממנים פרה-סינפטיים לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה של מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך סריקת תרכובות בהמשך במסלולים של התפתחות נוירולוגית.
- ערך תפעולי: מקל על זרימות עבודה של דימיג ניתנות להרחבה ולשחזור, התואמות לקריאות פלואורסצנטיות מרובות-מדדים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם מערכות רלוונטיות למחלה שבהן נתק תחושתי-תחומי (thalamocortical dysconnectivity) תורם לפנוטיפים תחושתיים וקוגניטיביים.
- ערך תפעולי: מספק רציפות משלב סריקת מנגנונים של שלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התאוששות ברמת המעגלים.
- ערך מדעי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור דינמיקה מבנית לתוצאות סינפטיות תפקודיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על פלסטיות מבנית שקדמה לקריאות של בדיקות תפקודיות במודלים של מעגלים עצביים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של גנים המווסתים את הדינמיקה של הסתעפויות אקסונים ויצירת אתרים סינפטיים במעגלים חיים.
- סריקה: מספק נתונים מורפולוגיים וכמותיים של נקודות פלורסצנטיות, המוכנים לניתוח, לצורך אפיון השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של תדירות ההסתעפות וצפיפות הסינפסות בין תנאים ניסיוניים לאורך זמן.
- מחקר תרגומי: מקשר ממצאים מכניסטיים למודלים פרה-קליניים של הפרעות התפתחותיות נוירולוגיות המאופיינות בשינויים במסלול התלמו-קורטיקלי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימיון הניתנת לשימוש חוזר להערכה מרובת פרמטרים של נוריטוגנזה וסינפטוגנזה במודלים עצביים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות בקשרי מבנה-תפקוד במהלך הרכבת מעגלים עצביים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה של דימוי דו-ערוצי למעקב אורך (longitudinal) עקבי של דינמיקה אקסונית וסינפטית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת ראיות מכניסטיות למעורבות המטרה עם נתיבים של פלסטיות מבנית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון על בסיס השפעות מאומתות על צימוד אקסון-סינפסה במעגלים רלוונטיים לבני אדם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתחזוקת תרביות משולבות (coculture) אורגנוטיפיות, אלקטרופורציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תלוי במכשור כירורגי סטרילי, הכנת מיקרופיפטות ובאיכות ה-plasmid DNA לצורך טרנספקציה יעילה.
- מחייב בקרה סביבתית ב-37°C ומצע המכיל סרום כדי לשמר את חיוניות הפרוסות לאורך מספר ימים.
- הסתגלות למעגלים עצביים חלופיים מחייבת תיקוף של תאימות הרקמה ויעילות האלקטרופורציה.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות ביעילות הטרנספקציה וצורך בניתוח תמונות לאחר המקרה (post-hoc) כדי לכמת את הדינמיקה של ההסתעפויות והנקודות (puncta).
