Name: ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: חקור שינויים מורפולוגיים דינמיים בהסתעפות אקסונים ויצירת סינפסות בפרויקציות תלמוס-קורטיקליות באמצעות תרביות קו-אורגנוטיפיות של תלמוס וקורטקס ממוח עכברים בני יומיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים גם גבריאל היד לקריאה ביקורתית.

כל הניסויים בוצעו בהתאם לקווים המנחים שנקבעו על-ידי הוועדות רווחת של אוניברסיטת אוסקה, יפן Neuroscience החברה.
1. Organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח
הערה: לקבלת ההליך מפורט, עיין המקורי פרסומים7,8,13. כל ההליכים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים. ספראג-Dawley (SD) עכברים משמשים תרבויות עצביים.
<ol><li>
ההכנות של ריאגנטים הערה: כרכים ריאגנטים הבאות הן עבור מוח עכברוש אחד.<ol>
<li>
הכן 10 x תוספת N2 ששונה 13: אינסולין (50 μg/mL), פרוגסטרון (200 ננומטר), הידרוקורטיזון (200 ננומטר), סודיום סלניט (300 ננומטר), transferrin (1 מ"ג/מ"ל), putrescine (1 מ מ), גלוקוז (60 מ"ג/מ"ל)</li>
		<li>
הכן סרום המכיל תרבות בינוני (10 מ"ל): 85% DMEM/F12, תוספת N2 10 x שונה של 10%, 5% סרום שור עוברית (FBS)</li>
		<li>
הכן ללא סרום תרבות בינוני (20 מ ל): 90% DMEM/F12, 10% x 10 ששינה N2 תוספת</li>
		<li>להכין עכבר זנב קולגן פתרון (0.5 מ"ל). בקיצור, קח במכרז סיבי זנב העכברוש בתנאים סטריליים, דגירה תמיסת חומצה אצטית בן לילה. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את תגובת שיקוע (כמה מ"ג/מ"ל) ולאחסן במקרר13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת מאכלים תרבות
	<ol>
<li>למקם את הוספה ממברנה של 35 מ מ פטרי.</li>
		<li>להוסיף 40-50 μL של עכבר זנב קולגן פתרון למוח, להפיץ את הפתרון קולגן סביב המרכז.</li>
		<li>האוויר יבש קרום לחלוטין ב ספסל נקי.</li>
		<li>מכניסים 1.5-2 מ"ל של המדיום תרבות סרום המכיל המנה, כך הקרום ספוגה עם המדיום.</li>
		<li>מקם את המנה תרבות בתוך אינקובטור (37 ° C, humidified אוויר 95% ו- 5% CO2) לפני ציפוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת פרוסות בקליפת המוח
	<ol>
<li>לעקר כל מכשירי ניתוח עם אתנול 70% במשך 10 דקות או יותר.</li>
		<li>לנתח את זה. במהירות של יום לאחר הלידה (P) 2 עכברוש בהרדמה כקרח (שקוע בתוך קוביות קרח לכמה דקות).</li>
		<li>המקום המוח לתוך 100 מ מ פטרי המכיל 100 מ של הנקס קר מאוזנת תמיסת מלח.</li>
		<li>הסר את העניין פיא המוח עם מלקחיים בסדר, חותכים פרוסות בקליפת המוח (300-400 μm עובי) מאזור הקליפה חזותי, המגע עם מספריים המיקרוכירורגית (לפרטים, ראה איור 1). הערה: עובי הפרוסות בקליפת המוח מוערך בערך לפי קנה המידה של רשתות תחת מיקרוסקופ דו-עינית. הערה: לחלופין, פרוסות בקליפת המוח יכולה להתבצע באמצעות vibratome בתנאים סטריליים.</li>
		<li>העברת כמה פרוסות בקליפת המוח על גבי קרום המכסה מול פיפטה פלסטיק חד פעמיות.</li>
		<li>להתאים את העמדות של הפרוסות ליד המרכז של תרבות הקדמי עם פיפטה פסטר מלוטשים אש (לפרטים, ראה8,13) ולהסיר עודפי בינוני מהמכסה. הערה: להתאים את רמת של המדיום מעט מתחת לפני השטח הפרוסות כך הפרוסות יכול לקבל אספקה מספקת של גז והן בינוני. דבר זה חיוני עבור תא הכדאיות.</li>
		<li>לשמור את הפרוסות במדיום תרבות סרום המכיל ב 37 ° C בסביבת humidified 95% אוויר ו-5% CO2, והתרבות לבד יום אחד לפני בלוק דפנות התלמוס הוא נלקח והניח לידו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה של דפנות התלמוס בלוקים
	<ol>
<li>לעקר כל מכשירי ניתוח עם אתנול 70% במשך 10 דקות או יותר.</li>
		<li>עזים ומתנגד חולדה בהריון (עובריים יום 15) על ידי הזרקת פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) המכיל הרדמה בקרום הבטן.</li>
		<li>לנתח כל העובר מן הקרניים הרחם, למקם את העוברים 100 מ מ פטרי המכיל 100 מ של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס קר.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ דו-עינית, מסירים את המוח של העובר כל וחותכים בלוקים דפנות התלמוס המכילים בעיקר את גרעין הברך הצדי, מורכבים ולא לרוחב (כ 0.5 מ מ x 3) ventrobasal7 באמצעות מספריים השתלה (ראה איור 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תרבות ולשמור על organotypic cocultures
	<ol>
<li>באמצעות פיפטה של פסטר, מקם את הבלוק דפנות התלמוס לצד המשטח חדרית של הפרוסה קורטיקלית שהונחה ממברנה מסנן.</li>
		<li>לשמור את cocultures במדיום תרבות סרום המכיל ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה של אוויר 95% humidified ו- 5% CO2.</li>
		<li>להחליף חצי של המדיום עם המדיום תרבות ללא סרום אחרי יומיים בתרבות. לאחר מכן, חילופי המדיום כל 2-3 ימים. הערה: הרמה של המדיום צריך להיבדק אחרי ההחלפה בינוני, כפי שזה חשוב להישרדות התא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אלקטרופורציה
כל ההליכים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים.
הערה: לבצע אלקטרופורציה יום לאחר הכנת הבלוקים דפנות התלמוס כדי למנוע ניתוק של אבני.
<ol><li>
פלסמידים
	<ol>
<li>להכין תערובת של פלסמידים כדלקמן: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL. הערה: לטהר את פלסמידים הן באמצעות ערכת Maxiprep נטולת אנדוטוקסין ו להמיס תמיסת מלח מאוזנת של הנקס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
התקנת ציוד אלקטרופורציה צריכים להיות מחוברים כלי הנגינה חשמל כגון ממריץ ו- isolator כפי שמוצג באיור2.<ol>
<li>לחבר את ממריץ isolator biphasic.</li>
		<li>להתחבר אלקטרודה (חוט כסף 0.2 מ מ קוטר) הטרמינל השלילי isolator.</li>
		<li>להתחבר אלקטרודה (חוט כסף 1 מ"מ קוטר) בסדרת ועד 100 Ω הנגד על הטרמינל חיובי isolator.</li>
		<li>להתחבר המגבר אוסצילוסקופ לפקח אם זרמים חשמליים הם חלף על פני resistor על ידי מדידת המתח עם המגבר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת פיפטות זכוכית הערה: שני סוגים של פיפטות זכוכית משמשים עבור הוצאה של הפתרון פלסמיד ויישום של פולסים חשמליים.<ol>
<li>להפוך את פיפטות של נימים זכוכית עם פולר אלקטרודה.</li>
		<li>. שבור את הקצה על פיפטה הוצאה (הקוטר טיפ צריך להיות μm 20-50).</li>
		<li>טוחנים, לשכלל את קצה פיפטה אלקטרודה עם נייר זכוכית ואחריו (הקוטר הפנימי צריך להיות 50-200 μm) וליטוש אש. הערה: קצה האלקטרודה צריך להיות שטוח וחלק, כפי שהוא נוגע ישירות את הרקמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הליך של אלקטרופורציה
	<ol>
<li>לחבר את הפליטה, אלקטרודה פיפטות המניפולטורים.</li>
		<li>הכנס חוט כסף (0.2 מ מ קוטר) פיפטה אלקטרודה.</li>
		<li>לצרף את פיפטה הוצאה מזרק 1 מ"ל עם צינור פלסטיק.</li>
		<li>תופסים > 5 μL של פתרון פלסמיד לתוך פיפטה הוצאה על ידי שאיבה במזרק.</li>
		<li>לשים את coculture על הבמה אלקטרופורציה ולאחר הכנס האלקטרודה בקוטר 1 מ"מ המדיום תרבות.</li>
		<li>מניחים את פיפטה הוצאה על explant דפנות התלמוס.</li>
		<li>לדחוף את המזרק באופן ידני לאחר הטיפ נוגע השטח של הרחוב דפנות התלמוס. הערה: על 0.5 μL של פלסמיד פתרון משמש בדרך כלל עבור כל בלוק אחד דפנות התלמוס.</li>
		<li>למקם את פיפטה אלקטרודה על הבלוק דפנות התלמוס מיד לאחר משיכת פיפטה הוצאה.</li>
		<li>מספקים פולסים חשמליים (μA 50-400, 3 עד 5 רכבות של פולסים מרובע 200 משך ms 1 ב 200 הרץ). נטר את משרעת ומספר רכבות על אוסצילוסקופ. הערה: משרעת של זרמים חשמליים תלוי הקוטר הפנימי של פיפטה אלקטרודה13.</li>
		<li>. משכי את פיפטה אלקטרודה וחוזרים המנה החממה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
התבוננות מיקרוסקופית
	<ol>
<li>לשים את הצלחת תרבות שלב מיקרוסקופיים של מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף מצויד עם שתי קבוצות מסנן עבור EGFP (עירור, 488 ננומטר; פליטה, 515 ננומטר) ו DsRed (עירור, 514 ננומטר; פליטה, 565 ננומטר).</li>
		<li>קח תמונות של 10-25 סעיפים אופטי בגדלים מיקרומטר-שלב 1-7 עם 20 רב-לעבוד X עדשת מרחק אובייקטיבי. בחר בנפרד ניתן להבחנה אקסונים שכותרתו המבטאות הן DsRed והן SYP-EGFP. הערה: האזור הנצפה הינו כ 0.7 x 0.7 מ מ (המקביל 1024 x 1024 פיקסלים, כלומר, 0.68 μm לפיקסל).</li>
		<li>לכידת תמונות כל 24 שעות ביממה עבור הדמיה מדי יום. להשלים בתוך 10 דקות בטמפרטורת החדר, וחוזרים התרבויות החממה. לדימות לשגות קצר-מרווח הזמן, לשמור על התרבות כדורים תרבות, השומרת על שהסביבה של humidified 95% אוויר ו-5% CO2 ב 37 º C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat%3A+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li>
<li>Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+development%3A+how+are+we+going+to+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical development: how are we going to get there.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).</li>
<li>Espinosa, J. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the primary visual cortex.</a> Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li>
<li>Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dynamics.</a> Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+extrinsic+cortical+connections+studied+in+coculture+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations.</a> Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).</li>
<li>Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependence+of+cortical+axon+branch+formation%3A+a+morphological+and+electrophysiological+study+using+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).</li>
<li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li>
<li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li>
<li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282233732_Electroporation_Method_for_Mammalian_CNS_Neurons_in_Organotypic_Slice_Cultures">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li>
<li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li>
<li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li>
<li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בפרוטוקול הנוכחי הוא גם כלי רב עוצמה כדי ללמוד היבטים התפתחותיים של גידול אקסונים אחר מאשר של ה TC הקרנה11. למשל, שילוב של תרבות פרוסה קורטיקלית, הטכניקה אלקטרופורציה מאפשר להמחיש מורפולוגיה עצב בודדים של נוירונים בקליפת המוח, לטווח ארוך תצפית9,18.
על-ידי שימוש בפרוטוקול הנוכחי, התפקידים של גנים מעניינים במבנה מסתעף, סינפסה האקסון יכול גם להיות נותחו על ידי שותף ביטוי של חלבונים פלורסנט, הגנים ריבית. בדרך כלל, מ...

התחזית thalamocortical (TC) במוח של יונקים היא מערכת מתאימה לחקור מנגנוני הדרכה האקסון ומיקוד. במהלך הפיתוח, אקסונים סנסוריים TC לגדול צלחת בקליפת המוח, ואת הטופס סניפים, הסינפסות מעדיפים בתוך שכבה IV של אזורי החישה העיקרי קליפת המוח1,2. גם לאחר הקמתה של חיבורי היסוד, עצב ובשבילים ומסופי סינפטית הם השתקם בהתאם שינויים סביבתיים3,4. עם זאת, איך TC האקסון המורפולוגיה היא שונה באופן דינמי הוא ממעטים להבין. אחת הסיבות העיקריות היא חוסר טכניקה נאותה לבחון שינויים מבניים ברמה תא בודד. למרות ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופ, כגון מיקרוסקופ שני הפוטונים, אפשרו בהתבוננות ישירה של החיים נוירונים בקליפת המוח ויוו, ישנן מגבלות טכניות עדיין עבור לכידת הכוללת TC מסלולים5, 6. לכן, במבחנה שיטות הדמיה חיה של אקסונים TC יספק כלים רבי-עוצמה עבור ניתוח מבנה של האקסון מסעף סינפסה היווצרות.
הקבוצה שלנו בפעם הראשונה הוקמה שיטה התרבות פרוסה סטטי עם קרום חדיר7. באמצעות שיטה זו, פרוסה קורטיקלית חולדה היה cocultured עם בלוק דפנות התלמוס חושית, חיבורים TC פרופריה ספציפי היו recapitulated הזה7,cocultures organotypic8. תיוג דליל עם החלבון הניאון עוד מותר לנו להתבונן סניף היווצרות9,10,11וצמיחה של האקסון TC. לאחרונה, פיתחנו שיטה עבור הדמיה סימולטני של הסתעפות, סינפסה היווצרות אקסונים TC בודדים ב- organotypic cocultures12. להמחיש TC אקסונים ואתרים presynaptic בו זמנית, DsRed ו מתויג EGFP synaptophysin (SYP-EGFP) היו transfected משותפת למספר קטן של נוירונים דפנות התלמוס מאת אלקטרופורציה של coculture organotypic. השיטה הנוכחית מקלה על ניתוח מורפולוגי של אקסונים TC ומאפשר התבוננות ארוכת טווח, אשר יכול לשמש כדי להראות את הקשר הסיבתי בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>Nissui</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396-03</td><td>אינסולין היקלון</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא& נ.ב.פ;</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>Wako Pure תעשיות כימיות</td><td>192-10843</td><td></td></tr><tr><td>טרנספרין&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>פוטרסין&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Wako תעשיות כימיות טהורות</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ פטרי צלחות</td><td>פלקון</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM להכניס</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ פטרי צלחות</td><td>BIO-BIK</td><td>I-90-20</td><td>פטרי צלחת סטרילית</td></tr><tr><td>HiPure פלסמיד Maxiprep ערכת</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>K210006</tr><tr><td>פיפטות פלסטיק סטריליות חד פעמיות</td><td></td><td>202-IS</td><td>פיפטות העברה סטריליות</td></tr><tr><td>נימי זכוכית: OD 1.2 מ"מ</td><td>Narishige</td><td>&nbsp; קוטר פנימי G-1.2</td>, <td>1.2 מ"מ</td></tr><tr><td>חוט כסף: 0.2 ו-1 מ"מ&nbsp;</td><td>Nilaco</td><td>AG-401265 (קוטר, 0.2 מ"מ), AG-401485 (קוטר, 1.0 מ"מ)מזרק</td><td></td></tr> <tr><td>1 מ"ל</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>סטימולטור&nbsp;</td><td>A.M.P.I</td><td>מאסטר 8</td><td></td></tr><tr><td>מבודד דו-פאזי&nbsp;</td>מגבר <td>BAK אלקטרוניקה</td><td>BSI-2</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>A-M Systems</td><td>דגם 1800</td><td></td></tr><tr><td>אוסילוסקופ</td><td>היטאצ'י</td><td>VC-6723</td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>MO-10</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ&nbsp;</td><td>מעמד אוניברסלי אולימפוס</td><td>SZ40</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td>מערכת תאורת <td>אור אולימפוס</td><td>SZ-STU2</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>חולץ אלקטרודות <td>אולימפוס</td><td>LG-PS2, LG-DI, HLL301</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>ניקון</td><td>ליקוי דיגיטלי C1 לייזר</td><td></td></tr><tr><td>x20 אובייקט</td><td>Nikon</td><td>ELWD 20x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>תא תרבות</td><td>Tokai Hit</td><td>בריטניה A16-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) חולדה</td><td>יפן SLC ומספריים מיקרו-כירורגיים Nihon-Dobutsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Natsume&nbsp;</td><td>MB-54-1</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של האקסון thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה organotypic cocultures

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

האקסון מסעף סינפסה היווצרות הן תהליכים חיוניים להקמת מעגלים עצביים מדויק. במהלך הפיתוח, אקסונים סנסוריים thalamocortical (TC) טופס סניפים, הסינפסות בשכבות ספציפיות של קליפת המוח. למרות קורלציה מרחבית ברורה בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות, הקשר הסיבתי בין אותם ממעטים להבין. כדי לטפל בבעיה זו, לאחרונה פיתחנו שיטת הדמיה סימולטני של הסתעפות סינפסה היווצרות של אקסונים TC בודדים ב- organotypic cocultures.
פרוטוקול זה מתאר שיטה אשר מורכב של שילוב של organotypic coculture ושל אלקטרופורציה. Organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח להקל על מניפולציה ג'ין והתבוננות של תהליכים עצב, שימור מבנים אופייניים כגון תצורת למינריות. שני פלסמידים שונים קידוד DsRed ו מתויג EGFP synaptophysin (SYP-EGFP) היו transfected משותפת למספר קטן של נוירונים דפנות התלמוס על ידי טכניקת אלקטרופורציה. שיטה זו אפשרה לנו לדמיין מורפולוגיות עצב בודדים של נוירונים TC ואתרים presynaptic שלהם בו זמנית. השיטה זמינה גם תצפית לטווח ארוך אשר חשף את הקשר הסיבתי בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות.

הניסוי המתואר כאן שואף לחשוף את הקשר בין TC האקסון מסעף סינפסה היווצרות. במקביל להמחיש מסלולים עצב, מיקומי אתרי presynaptic, אחד או כמה דפנות התלמוס בתאים organotypic cocultures היו transfected עם פלסמידים 2 קידוד SYP-EGFP ו DsRed באמצעות אלקטרופורציה. במהלך השבוע השני בתרבות, בבירור עם תווית אקסונים TC בנפרד ניתן להבחנה על-ידי DsRed (איור 3). רק האקסונים אשר הציג DsRed ו- SYP-EGFP נבחרו להשגחה. אקסונים TC שכותרתו פלשו הפרוסה קורטיקלית ויצרו סניפים בעיקר בשכב...

פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה סימולטני של thalamocortical האקסון מסעף סינפסה היווצרות של organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח. Thalamocortical בודדים אקסונים ומסופי presynaptic שלהם הם דמיינו ידי טכניקה אלקטרופורציה תא בודד עם DsRed ו מתויג GFP synaptophysin.

ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לחקור שינויים מורפולוגיים דינמיים של הסתעפות אקסונים והיווצרות סינפסות בהקרנה התלמוקורטיקלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון היווצרות מעגלים עצביים חדשים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תצפית בו זמנית על צמיחת האקסונים והיווצרות הסינפסות בתאים חיים בודדים.שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הקשר בין הסתעפות אקסון להיווצרות סינפסות בהקרנות התלמוקורטיקליות. ניתן ליישם אותו גם על מעגלים עצביים אחרים, כגון חיבור פנימי בקליפת המוח. כדי להתחיל בהליך זה, יש לעקר את כל מכשירי הניתוח עם 70% אתנול למשך 10 דקות או יותר.לאחר מכן, נתחו את כל המוח במהירות מחולדה שלאחר הלידה ביום השני תחת הרדמה קרה כקרח. לאחר מכן, הניחו את המוח בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר המכילה 40 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק. תחת מיקרוסקופ דו-עיני, הסר את חומר ה-pia בזהירות בעזרת מלקחיים עדינים, וחתוך את קליפת המוח הראייתית והסומטוסנסורית הראשונית לפרוסות בעובי של 300 עד 400 מיקרון באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיים.לאחר מכן, העבירו את פרוסות קליפת המוח אל פילטר הממברנה של תוספת התרבות באמצעות פיפטה פלסטיק חד פעמית. התאם את מיקומי הפרוסות ליד מרכז תוספת התרבית עם פיפטת הפלסטיק החד פעמית, והסר עודפי מדיום מהתוספת. שמרו את הפרוסות במדיום התרבית המכיל סרום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ותרבו אותן לבד למשך יום אחד לפני שמניחים לידו גוש תלמי מעובר E15.התאם את מפלס המדיום מעט מתחת לפני השטח של הפרוסה, כך שהפרוסות יוכלו לקבל אספקה מספקת של הגז וגם של המדיום. זה חיוני לכדאיות הפרוסות. בשלב זה, הכינו את נימי הזכוכית בעזרת מושך אלקטרודות.ואז שוברים את קצות נימי הזכוכית להזרקת פלסמיד. עבור פיפטות האלקטרודות, טוחנים ומלטשים את קצות נימי הזכוכית בנייר זכוכית. ואז ללטש אותם באש כדי להשיג קוטר פנימי של 50 עד 200 מיקרון.לאחר מכן, חבר את פיפטת האלקטרודה ואת פיפטת הפליטה למניפולטורים. העבירו חמישה מיקרוליטר תמיסת פלסמיד לצלחת פטרי. ואז משוך את התמיסה לתוך פיפטת האלקטרודה בפעולה נימית.הכנס את האלקטרודה בקוטר 0.2 מילימטר לתוך פיפטת האלקטרודה. לאחר חיבור פיפטת הפליטה למזרק של מיליליטר עם צינור פלסטיק, העבירו שוב חמישה מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד לצלחת פטרי. לאחר מכן משוך לאט את התמיסה לתוך פיפטת הפליטה באמצעות המזרק.לאחר מכן, העבירו את הקוקולטורה בשלב האלקטרופורציה והכניסו את האלקטרודה בקוטר מילימטר למדיום התרבית. לאחר מכן, הנח את פיפטת הפליטה על גוש התלמוס המתורבת. דחוף את המזרק ידנית לאחר שהקצה נוגע במשטח גוש התלמוס.הנח את פיפטת האלקטרודה על הגוש התלמי מיד לאחר נסיגת פיפטת הפליטה. כעת, העבירו את הפולסים החשמליים. עקוב אחר המשרעת ומספר הרכבות באוסילוסקופ.לאחר מכן, החזר את פיפטת האלקטרודה והחזיר את המנה לחממה. כדי להתבונן בדגימה, הנח את צלחת התרבות על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף המצויד בשני ערכות סינון עבור EGFP ו-DsRed. לאחר מכן צלם תמונות של 10 עד 25 מקטעים אופטיים, בגדלים של צעד אחד עד שבעה מיקרון, עם עדשת אובייקט למרחק עבודה ארוך פי 20.בחר אקסונים מסומנים הניתנים להבחנה בנפרד, המבטאים גם DsRed וגם Syp-EGFP. מוצגת כאן קוקולטורה אורגנוטיפית של פרוסות תלמוס וקליפת המוח לאחר 12 DIV. הנה תמונה מוגדלת של האזור הסגור.והנה תא תלמי עם תווית DsRed שמרחיב אקסון לתוך הפרוסה בקליפת המוח, ויוצר ענפים בשכבות העליונות. תמונות אלה מציגות את האקסון התלמוקורטיקלי המסומן ב-DsRed ואת הפונקטה Syp-EGFP. הצטברות בדידה של Syp-EGFP נצפתה לאורך אקסון תלמוקורטיקלי יחיד.פלסמידים DsRed בתוספת Syp-EGFP הוכנסו לתאי תלמוס מתורבתים ב-DIV אחד באמצעות אלקטרופורציה. אקסון זה צולם מדי יום במשך ארבעה ימים. הסתעפות האקסונים והיווצרות הסינפסות היו דינמיים, עם הוספה וחיסול.בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע אלקטרופורציה עם גנים מעניינים יחד עם Syp-EGFP ו-DsRed על מנת לחקור את תפקיד הגן בהסתעפות אקסונים ובהיווצרות סינפסות. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור את מנגנוני השינויים הדינמיים של מעגלים עצביים.

visualization-thalamocortical-axon-branching-synapse-formation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה לייצר פרוסות organotypic מן המוח התיכון E12.5 העוברי Murine מתואר. תרבויות פרוסה organotypic ניתן להשתמש כדי לבחון את התנהגות של נוירונים דופאמינרגיים או נוירונים המוח התיכון הגחון.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

מקור: Winkle, C. C., et al. שימוש במתודולוגיות משולבות להגדרת תפקיד אספקת קרום הפלזמה במהלך הסתעפות אקסון ומורפוגנזה עצבית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאלית (DIC) כדי לצפות בהסתעפות אקסונלית בזמן אמת בנוירונים בקליפת המוח. סרטוני זמן-lapse לוכדים את ההשפעות של טיפול ב-netrin-1, מולקולת איתות הגורמת לאקסוציטוזיס מקומי וסידורים מחדש של שלד התא באקסונים. תהליכים אלה יוזמים בליטות ממברנה, המתפתחות לענפים אקסונליים בוגרים, ומספקים...

הדמיה בזמן אמת במבחנה של הסתעפות אקסונלית בנוירונים בקליפת המוח של עכבר

Coculture פרוסת מוח organotypic עם קרצינומה של תאים מאפשר לדמיין שינויים מורפולוגיים על ידי הקרינה וכן בתחום בהיר מיקרוסקופיה (וידאו) במהלך התהליך של פלישת תא קרצינומה של רקמת המוח. מערכת מודל זה מאפשרת גם להחלפת תאים וחידוש גישות ומציעה מגוון רחב של מניפולציות וניתוחים.

מערכת Coculture עם מוח פרוס Organotypic ו3D אליפטית של קרצינומה של תאים

באמצעות מספר זוויות לחתוך את מוח גור עכבר, אנחנו לשפר פרוסת מוח חריפה שתואר אשר לוכדת את הקשרים בין רוב מבני המוח התיכון והמוח הקדמי השמיעתיים המרכזיים.

שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על פרוסות חוט השדרה בתרבית על מערכים רב-אלקטרודה ללמוד התחדשות פונקציונלית של קשרי propriospinal במבחנה.

חוקר התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה שיתוף תרבויות Organotypic גדלו על מערכים רב-אלקטרודה

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט כדי להשיג מקטעים וצורניים שעברו שיטוח של יונקים cortices והמחש מודולים בקליפת המוח באמצעות פתולוגיה ושיטות immunohistochemical.

ויזואליזציה של מודולי קורטיקליים Cortices יונקים שעברו שיטוח

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

האינטראקציות הנוירוניות-גליאליות בניוון עצבי אינן מובנות היטב בשל כלים ושיטות לא מספקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים ממוטבים להשגת תאי עצב מושרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומספקים דוגמאות לערכים של שיטות אלה בהבנת תרומות ספציפיות לסוג התא במחלת אלצהיימר.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

אזורים חושיים ראשוניים בניאוקורטקס מפגינים פעילויות ספונטניות ייחודיות במהלך ההתפתחות. מאמר זה מתאר כיצד לדמיין פעילויות נוירונים בודדות ואזורי חישה ראשוניים כדי לנתח פעילויות סינכרוניות ספציפיות לאזור בעכברים ילודים in vivo.

בהדמיה של פעילות ספונטנית בקליפת המוח החושית של עכבר יילודים ברזולוציה של נוירון יחיד

חקור שינויים מורפולוגיים דינמיים בהסתעפות אקסונים ויצירת סינפסות בפרויקציות תלמוס-קורטיקליות באמצעות תרביות קו-אורגנוטיפיות של תלמוס וקורטקס ממוח עכברים בני יומיים.

ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures

גלה סרטונים נוספים