Name: היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: למדו כיצד לבודד ולגדל אקספלנטים של AGM לחקר מולדות תאי גזע המטופויאטיים. שיטה זו מאפשרת זיהוי גורמים רגולטוריים קריטיים באמצעות ניתוח ביטוי DNA ומבחני יצירת מושבות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Suwei גאו לעזרה בהכנה איור. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81530004, 31425016) ואת משרד המדע הטכנולוגיה של סין (2016YFA0100500). J.L. לבצע את הניסויים, ניסח את כתב היד; F.L. לערוך את כתב היד. שני מחברים לקרוא ואושר היצירה הסופית.

כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת ביקורת אתית המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, בייג'ינג, סין.
 1. הכנת חומר <ol><li>Sterilize 0.65 מסננים מיקרומטר עם אולטרה סגול קרני מיוצר תחת אולטרה סגול ריי המנורה על הספסל נקייה במשך 4 שעות, להסגיר את המסננים לאחר הסימן 2 h. 
	הערה: בעת עבודה עם אור UV, לענוד הגנה הולמת.</li>
	<li>לחטא את רשתות נירוסטה עם המעקר אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 mins. 
	הערה: גובה מסוים של רשת נירוסטה יש צורך לתמוך את מסנני-הממשק אוויר נוזלי, זה יכול להתממש עם החוט על רשת השינוי פלדה ( איור 1 א').</li>
	<li>פלואוקסטין לדלל את ריכוז סופי של 10 מיקרומטר לתוך M5300 לטווח ארוך תרבות בינונית, מערבבים באופן שווה. 
	הערה: על צלחת שש-. טוב, 2 מ"ל M5300 התרבות ארוכת טווח בינוני מתאים מכל קידוח. הידרוקורטיזון-10 -6 מ' יכול להיות סלקטיבי מדולל המדיום.</li>
	<li>להעביר את המדיום בתוספת פלואוקסטין-10 מיקרומטר. ובכן שש צלחות או מנות והכניסו את רשתות נירוסטה סטיריליים המדיום.</li>
	<li>לרחוץ את המסננים 0.65 מיקרומטר עם מים רותחים פעמיים במשך 3 דקות בכל פעם בצלחת תרבות תא זכוכית עבור עיקור. לאחר כל הכביסה, מכניסים את המסננים פוספט buffered מלוחים (PBS) במשך 2 דקות, במקום רטובה מסננת על גבי הנירוסטה רשתות שינוי עומדים על הממשק אוויר נוזלי כפי שמוצג באיור 1 A [סכמטי במרכז]. 
	הערה: מים רותחים יכול להיווצר עם המעקר החיטוי כדי להשיג את asepsis ואת הציוד צריך להילקח מתוך אוטוקלב מעקר במועד כדי למנוע ירידה בטמפרטורה.</li>
</ol> 2. AGM Explant תרבות <ol><li>הפרד בזהירות את האזורים AGM מן העוברים E10.5 או E11 עם מלקחיים.
	<ol><li>להסיר את uteruses של עכברים בהריון עם המספריים ויבתר, להפריד את העוברים uteruses.</li>
		<li>לנגב את שק החלמון הטבור, מעיים בגוף העובר.</li>
		<li>הסר בזהירות את רקמות עצב הגבי ואת הרקמות הסובבות שרירים.</li>
		<li>גזור הרקמות עם המלקחיים באתר של הגפיים הקדמיות, האחוריות לסירוגין להפריד את אזור AGM בגוף העובר. 1 דמויות B-C להראות הסמלית של המורפולוגיה של ביתור AGM-</li>
	</ol></li> <li>Explant את AGMs גזור בנפרד על גבי מסנני אוויר נוזלי ממשק ( איור 1 א'), תרבות 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. 
	הערה: לא למקם את AGM גזור על החוט של רשת השינוי פלדה ולוודא שהמסננים הינם הממשק אוויר נוזלי במהלך תרבות. חוץ ומזכיר האסיפה, שק החלמון והכבד בעובר יכול גם להיות תרבותי עם זו מערכת 7.</li>
</ol> 3. ניתוח ביטוי <ol><li>ברמת mRNA <ol><li>לאסוף את AGMs בתרבית לתוך 1 מ"ל PBS, צנטריפוגה ב 4 ° C, g x 310 עבור 6 מינימלית</li>
		<li>לאחר הסרת את תגובת שיקוע, RNA הכולל מופק מן AGMs שנאספו עם פתרון monophasic של פנול, על פי היצרן &#39; הוראות s.</li>
		<li>סה כ RNA (2 µg) הוא אז הפוך עיבד באמצעות M-קמפנילה MLV רוורס טרנסקריפטאז כדי להשיג cDNA כתבנית. מבחני ה-PCR כמותי בזמן אמת מתבצעות עם SYBR Green ו- Gapdh משמש את בקרה פנימית-</li>
	</ol></li> <li>רמת חלבון <ol><li>לאסוף את AGM בתרבית כמתואר לעיל בשלב 3.1.1.</li>
		<li>להכין את החלבון ומזכיר האסיפה תרבותי עם המאגר פירוק התא (10 מ מ טריס-HCl, 10 מ מ NaCl ו- 0.5% NP-40) המכיל מעכבי פרוטאז ושימוש עבור סופג המערבי כדי לזהות את רמת החלבון כפי שצוין בעבר תיאר 13.</li>
	</ol></li></ol> 4. המושבה יוצרי יחידות וזמינותו תרבות (CFU-C) <ol><li>לאחר culturing במשך 2-3 ימים, לאסוף את האזורים AGM 1 מ"ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) לתוך צנטריפוגה ב 4 ° C, g x 310 עבור 6 דקות ו מביצועם עם collagenase µL 200 (0.1% ב- PBS)-37 מעלות צלזיוס 
	הערה: הזמן הדרוש עבור collagenase ליצור תא יחיד-המתלים הוא כ-20 דקות. טלטול את הצינור המכיל AGM כל 5 דקות יכול להאיץ את תהליך העיכול. 200 µL 0.1% collagenase משמש עבור כל AGM ו 200 סרום 10% µL משמש כדי לעצור את התגובה.</li>
	<li>תרבות תא יחיד-המתלים M3434 בינוני ב מצורף נמוך במיוחד טוב 24 צלחות. 
	הערה: כדי למנוע זיהום, פניצילין-סטרפטומיצין הפתרון ניתן באופן סלקטיבי להוסיף לתוך האמצעי. מכיוון המדיום M3434 צמיגה, מזרק cc 1.0 בלי מחט משמשת כדי לערבב את התאים ואת בינונית.</li>
	<li>לאחר 7 - 10 ימים culturing-37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, את המספר עבור כל סוג של מושבות כולל פרץ ויוצרים יחידה - erythroid (BFU-E), CFU-granulo-מונוציט (CFU-GM) ו- CFU-גרנולוציט, כדוריות דם אדומות, macrophage, מגקריוציט (CFU-GEMM) הם מכובדים התבסס על המורפולוגיה וכבש עם מיקרוסקופ הפוכה ( איור 2 ג).</li>
</ol> 5. אין ויוו השתלת Assay <ol><li>המושבה יוצרי assay יחידות-הטחול (CFU-S) <ol><li>לאחר 2 - 3 ימים של explant culturing, לאסוף את AGMs ולהכין תא יחיד-המתלים מאת המקננת עם collagenase µL 200 (0.1% ב- PBS) 20 הגבלת</li>
		<li>לבצע הקרנה קטלני (9 Gy של צילומי רנטגן) של 8 עד 10 - בן שבועיים עכברים C57BL/6 זכרים 4-5 שעות לפני הזרקת תא.</li>
		<li>להכניס את העכבר לקרינה restrainer להגביל את פעילותה-</li>
		<li>לנגב את הזנב באמצעות מקלון צמר גפן ספוגים 75% אלכוהול כדי לקדם את vasodilatation של הווריד של.</li>
		<li>להזריק 0.5 העובר המקביל (ee) או יחידה להנדסת חשמל 1 תא-המתלים של AGM לווריד לתוך וריד הזנב העכבר לקרינה עם מזרק cc 1.0. 
		הערה: תאים מושעים עם PBS, 0.5 mL PBS לכל נמען הוא אמצעי מתאים. מחט של מד 25 או 26 מד בגודל משמש הזרקה בעזרת מזרק cc 1.0. אין אוויר שיוכל להיכנס לתוך המזרק. הקש ההזרקה עם ספוגית חיטוי כדי לעצור את הדימום.</li>
		<li>אחד עשר ימים פוסט ההשתלה, לאסוף ולתקן את טחולים של העכברים הנמען ב Bouin &#39; s פתרון (תמיסה מימית של חומצה Picric 1.22% רווי 15 mL, 2 mL 40% מתנול ו 1 מ"ל חומצה אצטית) 1-2 ימים לשטוף עם 80% אלכוהול עוד 1-2 ימים. לספור את המושבות גלוי בהטחול בעין בלתי מזוינת, לקבוע את מספר מושבות לכל ee. 
		&#8203; הערה: Bouin &#39; s מקבע, ללבוש הגנה הולמת.</li>
	</ol></li> <li>Assay השתלת לטווח ארוך <ol><li>אחרי 2-3 ימים explant culturing, לאסוף את AGMs ולהכין תא יחיד - המתלים מאת המקננת עם collagenase µL 200 (0.1% ב- PBS) במשך 20 דקות</li>
		<li>לבצע הקרנה קטלני (9 Gy של רנטגן) של 8 עד 10 - בן שבועיים עכברים C57BL/6 זכרים 4-5 שעות לפני הזרקת תא.</li>
		<li>להכניס את העכבר לקרינה restrainer להגביל את פעילותה-</li>
		<li>לנגב את הזנב באמצעות מקלון צמר גפן ספוגים 75% אלכוהול כדי לקדם את vasodilatation של הווריד של.</li>
		< lאני > להזריק 0.5 העובר המקביל (ee) או הנדסת חשמל 1 יחיד תא-המתלים של AGM לווריד לתוך וריד הזנב העכבר לקרינה עם מזרק cc 1.0. AGM מוזרקים במינון של הנדסת חשמל 1 לכל נמען עם × 10 2 5 תאים במח העצם (CD45.1 ברקע). 
		הערה: אין אוויר שיוכל להיכנס לתוך המזרק. הקש ההזרקה עם ספוגית חיטוי כדי לעצור את הדימום.</li>
		<li>ארבעה חודשים שלאחר ההשתלה, לאסוף את מח העצם של הנמען ולהשתמש בו עבור וזמינותו שיחזור על ידי FACS. רק הנמענים עם &#8805; 10% נגזר התורם chimerism נחשבים שהפגינו שיחזור מוצלח.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., Robin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+founder+of+adult+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta.</a> Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells+long-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129, 4891-4899 (2002).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86, 897-906 (1996).</li>
<li>Peeters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+embryonic+tissues+and+Hedgehog+proteins+induce+early+AGM+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development.</a> Development. 136, 2613-2621 (2009).</li>
<li>Taoudi, S., Medvinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+the+ventral+domain+of+the+embryonic+dorsal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.</a> PNAS. 104, 9399-9403 (2007).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+Hedgehog+Regulate+Distinct+AGM+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).</li>
<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stromal+clones+reveal+developmental+regulators+of+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells.</a> PNAS. 104, 20838-20843 (2007).</li>
<li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells%2Fhematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region%2C+with+increased+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li>
<li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li>
<li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784(2016).</li>
<li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li>
<li>Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+swimming+test+and+fluoxetine+treatment%3A+in+vivo+evidence+that+peripheral+5-HT+in+rat+platelet-rich+plasma+mirrors+cerebral+extracellular+5-HT+levels%2C+whilst+5-HT+in+isolated+platelets+mirrors+neuronal+5-HT+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes.</a> Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).</li>
<li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood%3A+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li>
<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
<li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

המחברים יש אינטרסים כלכליים לא סותרים.

זה ידוע כי HSCs בוגרת במח העצם לשקם מערכת הדם של נמענים לקרינה. בניגוד HSCs פונקציונליים אלה, HSCs המתעוררים ב ומזכיר האסיפה של העכבר העוברים הן ילדותי. השתלת ישירה התוצאות הראו סוג זה אני (VE-cad+ CD45– CD41+) לבין סוג II (VE-cad+ CD45+) טרום-HSCs בעלי אין יכולת שיחזור20. ניצול של מערכת התרבות explant AGM, HSCs המתהווה באזור AGM יכול לשקם את הנמענים4,assay השתלת20. יתר על כן, בשל התפת...

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאי גזע בוגרים רקמות ספציפיות כי בעלי פוטנציאל multilineage כולל erythroid, מיאלואידית, ו הלימפה התאים, כמו גם לחדש את עצמי. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי HSCs המוקדם התעוררו מתוך אוכלוסיה אנדותל מיוחדים, המכונה אנדותל hemogenic (HE), דרך אנדותל המעבר hematopoietic (בובה) בכותל הגחון של אבי העורקים הגבי1,2 3, ,4. לאחר שהוקמה באזור אבי העורקים-בלוטת המין-mesonephros (AGM) מעובריים (E) 10.5 כדי E12.5 העובר העכבר, HSCs נודדים אל הכבד העוברי של הרחבה, בסופו של דבר ליישב את מח העצם כדי לשמור על hematopoiesis למבוגרים לאורך החיים של הפרט 5 , 6. למרות זה נחקר במשך שנים רבות, המנגנון הבסיסי של מועדון הכדורגל מונפלייה הופעתה ופיתוח נשארים שהיישום מובן.
בניגוד הפריה במבחנה ופיתוח של דג זברה עוברי, פיתוח תוך רחמי העוברים העכבר הופך המחקר של hematopoiesis מוחלטת בזמן מופרה הרבה יותר נוח. למרות ניסויים גנטיים באמצעות הסתרה (KO) עכברים שאינם מנוצלים בדרך כלל, חוסר של עכברים KO מסוימים מגביל גם את השימוש בשטח המחקר hematopoietic. בנוסף, אין ויוו הצלה ניסויים לא בקלות מבוצעות בעכברים KO. מאז 1996, התרבות explant AGM פותחה ללימודי hematopoietic על ידי חלוצי בתעשיית השדה7. בעזרת מערכת זו תרבות, רקמות הגחון של האזור AGM זוהו לקדם פעילות מועדון הכדורגל מונפלייה, ואילו רקמות הגבי מפעילים של8,מול אפקט9. מערכת התרבות explant AGM הוחל גם כדי לקבוע את התפקידים של סרוטונין, הרישיון הציבורי של מוזילה, SCF, BMP וקיפוד איתות HSC פיתוח10,11,12,13, 14. חשוב, זה גם שיטה פופולארית נהגה להציל פגמים hematopoietic עוברי מוטציה13,15.

<table><tbody><tr><td>דוראפור 0.65 ומיקרו; m מסננים</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>AGM תרבית אקספלנט</td></tr><tr><td>M5300 תרבית לטווח ארוך</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>5300</td><td>AGM תרבית אקספלנט</td></tr><tr><td>טריזול&nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>RNA extration</td></tr><tr><td>M-MLV reverse transcriptase</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>שעתוק הפוך</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>מעכב פרוטאז PCR קוונטי בזמן אמת</td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>55622</td><td>תוספת חלבון</td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>עיכול רקמות AGM</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 טכנולוגיות</td><td>תאי גזע</td> בינוניות <td>3434</td><td>CFU-C מבחן</td></tr><tr><td>חיבור נמוך במיוחד 24 בארות צלחות</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>CFU-C מבחן</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.2 עכברים</td><td>בייג'ינג HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>CFU-S מבחן</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1 עכברים</td><td>בייג'ינג HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>השתלת</td></tr><tr><td>פוספט לטווח ארוך חוצץ</td><td>מלח Life Technologines</td><td>8115284</td><td>AGM Collection</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM תרבית אקספלנט</td></tr><tr><td>אנטי-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>השתלה לטווח ארוך</td></tr><tr><td>נגד CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>השתלה לטווח ארוך</td></tr><tr><td>מנורת UV</td><td>בייג'ינג ג'יאנגמורנינג יואן ביו-טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>039-14402</td><td>הספק: 30W</td></tr><tr><td>רשת נירוסטה</td><td>כאחת תאגיד שנחאי</td><td>2-9817-10&nbsp;</td><td>קוטר צמצם: 2.5 מ"מ</td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא</td><td>H0396</td><td>מדולל באופן סלקטיבי למדיום M5300</td></tr></tbody></table>

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros explant התרבות hematopoiesis התפתחותית

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

המגבלה של שימוש בעכבר העוברים ללימודי hematopoiesis היא הנוחיות הנוספת במבצעים, אשר נובע במידה רבה התפתחות העובר תוך רחמי. למרות משכנעים מידע גנטי של עכברים knockout (KO), זה לא מציאותי ליצירת עכברים KO עבור כל הגנים כנדרש. בנוסף, ביצוע ויוו הצלה ניסויים כדי לאחד את הנתונים המתקבלים KO עכברים אינה נוחה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, התרבות explant של אבי העורקים-בלוטת המין-Mesonephros (AGM) פותחה כמערכת המתאימה ללמוד פיתוח תאי גזע hematopoietic (HSC). במיוחד לניסויים הצלה, זה יכול לשמש כדי לשחזר את hematopoiesis לקוי בעכברים KO. על ידי הוספת כימיקלים המתאימים לתוך האמצעי, האיתות לקוי ניתן להפעיל מחדש או מסלולים מוסדר למעלה ניתן והשרירי אותו. עם השימוש בשיטה זו, ניסויים רבים שניתן לבצע כדי לזהות הרגולטורים קריטיים של התפתחות מועדון הכדורגל מונפלייה, כולל מועדון הכדורגל מונפלייה הקשורים גנים ב mRNA ורמות החלבון, המושבה היווצרות יכולת והקיבולת הכינון. זו סדרה של ניסויים יהיה מועיל בהגדרת המנגנונים המשמשת כבסיס חיוני לפיתוח HSC ביונקים.

פרסום האחרונה דיווחו סרוטונין נגזר תא אנדותל מקדם ההישרדות של HSCs על ידי עיכוב מסלול פרו-אפופטוטיים להיפגע AGM13. כדי לאשר את ההשפעה קידום של סרוטונין על פיתוח HSC, נכללה פלואוקסטין. כמו מעכב ספיגת סרוטונין בררניים (SSRI), פלואוקסטין הוכח לעכב ספיגת סרוטונין מחדש רקמות היקפיים16,17,18. באמצעות ומזכיר האסיפה explant מערכת תרבות, ההשפעה של פלואוקסטין על פיתוח HSC נבחנה על-י...

פרוטוקול זה מתאר שימוש בתרבית העורקים-בלוטת המין-Mesonephros עבור הביטוי ניתוחים, יחידות המושבה יוצרי תרבות, הטחול ולאחר שיחזור לטווח ארוך כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים רגולטוריים, איתות המסלולים על גזע hematopoietic תא פיתוח. זה הוכח כמו מערכת יעילה ללמוד ביולוגיה של התא גזע hematopoietic ותפקוד.

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להשתמש בתרבית אקספלנט של אבי העורקים-גונד-מזונפרוס כדי לחקור את הרגולטורים הקריטיים של התפתחות תאי גזע המטופויאטיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה והתפקוד של HSC כיצד לזהות את הגורמים המעורבים בוויסות התפתחות HSC ביונקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לאמת את הרגולטורים הללו באמצעות ניתוח ביטוי DNA ויכולת היווצרות המושבה ויכולת הבנייה מחדש של HSC.בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שההפרדה המדויקת של AGM מהרקמות הסובבות באזור תא המטען דורשת תרגול כדי לשלוט בהם. לפני תחילת ההליך, הנח רשתות נירוסטה לבארות בודדות של צלחת בת שש בארות המכילה שני מיליליטר של מדיום טרי בתוספת פלואוקסטין לכל באר. הנח מסנן אחד מעוקר UV של 0.65 מיקרוליטר לכל באר ניסוי לתוך צלחת תרבית תאי זכוכית המכילה מים רותחים טריים למשך שתי שטיפות של שלוש דקות, וטבל את המסננים במיכל PBS בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות לאחר כל שטיפה.לאחר מכן הנח מסנן אחד על כל רשת פלדה בממשק האוויר-נוזל של כל באר. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי להפשיט את הרחם מעכברה בהריון עוברי ביום ה-11 ולקצור את העוברים מהרחם. בעזרת מספריים מנתחים הסר את שק החלמון, חבל הטבור והקרביים מגוף העובר.והסר בזהירות את רקמות העצב הגבי ורקמות השרירים שמסביב. בעזרת מלקחיים מסירים את הרקמות מהגפיים הקדמיות והאחוריות. ולהפריד את אזור ה- AGM מגוף העובר.לאחר מכן הנח כל AGM על מסנן יחיד בממשק האוויר-נוזל של כל באר. מקמו את התרביות בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר יומיים-שלושה, העבירו את דגימות ה-AGM לצינורות מיקרו-צנטריפוגות בודדים של 1.5 מיליליטר המכילים 200 מיקרוליטר קולגנאז לפירוקם ב-37 מעלות צלזיוס למשך כ-20 דקות עם ניעור כל חמש דקות.בסוף העיכול יש לעצור את התגובות עם 200 מיקרוליטרים של סרום לכל אקספלנט. העבירו את כל התוכן של כל צינור לבארות בודדות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד של 24 בארות המכילה 500 עד 600 מיקרוליטר של מדיום M3434 לבאר. מערבבים את התאים בכל באר עם מזרק מיליליטר ללא מחט.מניחים את הצלחת בחממת תרבית התאים. לאחר מכן ניתן לנקד את מספר היחידות היוצרות מושבה בתוך כל באר לאחר שבעה עד 10 ימי תרבית. עבור השתלת AGM in vivo לאחר יומיים-שלושה של תרבית AGM כפי שהודגם זה עתה, יש להשליך באופן קטלני שישה עכברים שחורים C57 זכרים בני שמונה עד 10 שבועות עם תשעה אפורים של קרינה.ארבע עד חמש שעות לאחר מכן יש להפריד את הצמחים שנקטפו ב-200 מיקרוליטר קולגנאז לכל דגימות כפי שהודגם. עומס של 0.5 עד עובר אחד שווה ערך לתרחיפי התא הבודד המתקבלים למזרק אחד של מיליליטר לכל בעל חיים מקבל. הנח את העכבר המוקרן הראשון לתוך מסנן ונגב את הזנב עם צמר גפן ספוג אתנול 75% כדי לקדם הרחבת כלי דם של וריד הזנב.יש להזריק לווריד את כל תכולת מזרק אחד לווריד זנב מורחב. השתמש במקלון חיטוי כדי לעצור את הדימום לאחר הסרת המחט. לאחר מכן החזירו את החיה לכלוב שלה, והזריקו את החיה הבאה.11 ימים לאחר ההעברה לאימוץ ניתן לקבע את הטחול בתמיסה של בואן לספירה מקרוסקופית של מושבות הטחול הנראות לעין. תרביות AGM בתוספת פלואוקסטין מדגימות ביטוי מוגבר של Runx1, גן מרכזי להתפתחות HSC ברמות ה-mRNA וביטוי החלבון. פלואוקסטין יכול גם להגדיל משמעותית את יכולת היווצרות המושבה של HSC ב-AGM כולל אריתרואידים של יחידות יוצרות פרץ, מונוציטים גרגירים של יחידה יוצרת מושבה וגרנולוציטים יוצרי מושבה, אריתרוציטים, מקרופאגים ומגקריוציטים.יתר על כן, השתלה in vivo של HSC שטופל בפלואוקסטין שבודד מצמחי AGM מביאה למספר מוגבר של מושבות בטחול של בעלי חיים בוגרים מוקרנים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את ה- AGM ולבצע תרבית אקספלנט AGM לזיהוי הרגולטורים הקריטיים של התפתחות HSC בתוך ה- AGM.

application-aorta-gonad-mesonephros-explant-culture-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

mStrawberry OP9 התאים מאפשרים הערכה מלאה של הצאצאים ES-derived כל מתרבות משותפת.

השתנה ES / OP9 שותף לתרבות פרוטוקול מספקת שירותי אפיון משופר צאצאיהם hematopoietic

מערכת התרבות 3D עבור hematopoiesis מתואר באמצעות דם טבורי האדם הנגועים מוח העצם. השיטה מבוססת על שימוש פוליאוריטן נקבובי הפיגום הסינתטי מצופה חלבונים תאי מטריקס. פיגום זה ניתנת להתאמה להכיל מגוון רחב של תאים.

Ex vivo החקיינות של hematopoiesis אנושיים בריאים חריגה

פרוטוקול זה מתאר דיסקציה של אנלאגן בלוטת התריס העוברי של עכבר ותרבית של צמחים על מסננים נקבוביים למחצה או על שקופיות פלסטיק במיקרוסקופיה. מערכת זו אידיאלית לחקר אירועים מורפוגנטיים או התמיינות המתרחשים במהלך התפתחות בלוטת התריס של עוברים מסוג בר או נוק-אאוט, והיא ניתנת לניסויים של רווח ואובדן תפקוד.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

תרבית הטיפות הזקופות ex vivo היא אלטרנטיבה לטכניקות הניסוי הנוכחיות in vitro ו-in vivo. פרוטוקול זה קל לביצוע ודורש כמויות קטנות יותר של ריאגנטים, תוך מתן אפשרות לתפעל ולחקור כלי דם עובריים, מורפוגנזה ואורגנוגנזה.

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ו culturing raniments metanephric מעוברים העכבר.

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

פרוטוקולים ללמוד העורקים מאתר של הלידה באמצעות ויוו ניתוח המשובטים, מיפוי הגורל, אבי העורקים explants שריר חלק מבודד התאים מפורטים כאן. גישות מגוונות אלה לקדם את חקירת מורפוגנזה של אבי העורקים של הלידה בהתפתחות נורמלית, בפתוגנזה של המחלה.

באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לניתוח המשובטים של תא גזע hematopoietic מבשרי במהלך התפתחות עובריים מאתר. אנו משלבים אינדקס מיון של תאים בודדים מאזור העורקים-בלוטת המין-mesonephros עובריים עם תרבות משותפת תא אנדותל והשתלות לאפיין את המאפיינים פנוטיפי ואת הפוטנציאל engraftment של מבשרי hematopoietic יחיד.

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

מאמר זה מספק גישה מעודכן למערכת כמירה שליו-עוף קלאסית ללמוד היווצרות האיברים, על ידי שילוב של הרומן במבחנה , ב ovo בצרות.

גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

עבודה זו מתארת שתי שיטות למחקר התפתחות איברים, התקנה משופרת xenotransplantation שתלת על ממברנה כוראולאנטואית (CAM) מעוברי העופות המאפשר vascularization של איברים עובריים ואורגנואידים הרומן קבוע z-כיוון שיטת תרבות האיברים עם תנאים ניסיוני שונה המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה מיקוד הזמן.

אופטימיזציה של כליות אורגאיד ותרבות אורגנותית לvascularization, פיתוח מורחב והדמיה מיקרוסקופית משופרת

כאן, ארבע שיטות ליצירת אורגנואידים אשכים מתאי אשכים מורין ילודים ראשוניים מתוארים כלומר, מטריצה חוץ תאית (ECM) וסביבות תרבות 2D ותלת-מיוד ללא ECM. טכניקות אלה יש יישומי מחקר מרובים והם שימושיים במיוחד ללימוד פיתוח האשכים ופיזיולוגיה במבחנה.

אקסטרה סלולר מבוסס מטריצה ודור נוסף ללא מטריקס סלולרי של אורגנואידים אשכים Murine

כאן, הקמנו in vivo אוסטאו-אורגנואידים המופעלים על ידי פיגומי ג'לטין טעונים בחלבון מורפוגנטי-2 עצם כדי לקצור תאי גזע / אב המטופויטיים טיפוליים לשחזור של מערכת המטופויטית וחיסונית פגומה. בסך הכל, גישה זו יכולה לספק מקור תאי מבטיח לטיפולים תאיים.

In Vivo גישת אוסטאו-אורגנואיד לקצירת תאי גזע/אב המטופויטיים טיפוליים

למדו כיצד לבודד ולגדל אקספלנטים של AGM לחקר מולדות תאי גזע המטופויאטיים. שיטה זו מאפשרת זיהוי גורמים רגולטוריים קריטיים באמצעות ניתוח ביטוי DNA ומבחני יצירת מושבות.

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

גלה סרטונים נוספים