נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול
12 במרץ 2018
פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.
המטרה הכוללת של בדיקת פלישה זו היא לכמת את יכולות הנדידה והפולשניות של תאים נדירים ורגישים בסביבה תלת מימדית מבלי לעקור את התאים מסביבת המיקרו שלהם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הסרטן לגבי יכולת הפלישה של אירועים רגישים ואירועים, כגון תוצר היתוך תאים סרטניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתאים מנותחים במיקרו-סביבה המקורית שלהם באמצעות הגדרה תלת מימדית.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסרטן מכיוון שניתן להשתמש בה לבדיקת חומרים פרמקולוגיים המסוגלים לעכב פלישת תאים סרטניים וגרורות. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית. שאיפה בטמפרטורה וב-pH של תערובת הקולגן משפיעים על הפילמור שלה וטיפול גס גורם להתנתקות הג'ל.
התחל בטיפול בצלחת תרבית 35 מילימטר עם באר תחתית זכוכית של 10 מילימטר עם מיליליטר אחד של חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת כדי להוריד את ההידרופוביות של הזכוכית. לאחר 15 דקות יש לשטוף את הצלחת פעמיים עם מיליליטר PBS אחד לכל כביסה, ולאחר מכן שטיפה אחת עם מיליליטר אחד של 70% אתנול. לאחר מכן, יש לשטוף את הצלחת במיליליטר אחד של מדיום תרבית ספציפי לתאים המעניינים לשימוש.
ולזרוע את הצלחת עם התאים המעניינים. לאחר מכן הניחו את הצלחת בחממת תרבית תאים. כאשר התאים מגיעים ל-100% מפגש משלבים 114.5 מיקרוליטר של קולגן זנב עכברוש טרי, 16.6 מיקרוליטר של מדיום 10 X DMEM ו-33.1 מיקרוליטר של מדיום תרבית בתוספת מושך כימותרפיה מעניין בצינור מיקרו-צנטריפוגה על קרח.
נטרלו את תערובת הקולגן עם 14 מיקרוליטר נתרן ביקרבונט וכסו את התאים ב -80 מיקרוליטר ג'ל. אפשר לקולגן להתפלמר באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לאחר מכן שכבו שני מיליליטר של מדיום תרבית תאי סרום מופחת בשני אחוזים מעל הג'ל והחזירו בזהירות את התאים לאינקובטור לפרק הזמן הניסיוני המתאים מבלי לעקור את הקולגן.
בתום הדגירה יש להסיר בעדינות את המדיום ולשטוף בזהירות את הג'ל עם מיליליטר PBS. תקן את התאים עם מיליליטר אחד של ארבעה אחוז פרפורמלדהיד למשך 15 דקות ואחריו שתי שטיפות במיליליטר אחד של PBS לכל שטיפה. לאחר מכן סמן את התאים בתמיסת DAPI למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ודמיין את פלישת הקולגן התלת מימדית במבחנה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
כאן, מוצג כימות של פלישת ג'ל הקולגן על ידי קו תאי סרטן השד ותוצרי היתוך תאי סרטן השד בתגובה למושך כימותרפיה לאורך תקופת נדידה של 48 שעות. יש לציין כי נצפתה גם נדידה של מוצרי איחוי תאי סרטן שד נדירים לג'ל הקולגן בתגובה למושך הכימותרפיה. התאים נשארים בריאים לאורך כל ניסוי ג'ל הקולגן, כפי שמעידים השמירה על מספר התאים החזק והמורפולוגיה שלהם 48 שעות לאחר פילמור הג'ל.
בדיקת ג'ל קולגן אנכית זו מאפשרת גם לנתח את הקינטיקה של נדידת התאים בעת הפלישה, על ידי הדמיית נדידת התאים בסדרת Z וכן את המורפולוגיה של התאים הנודדים שיילכדו באתרם. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בצלחת תרבית התואמת למיקרוסקופ שלך. בעקבות הליך זה, ניתן להציג משתנים אחרים כמו שינוי חוזק הקולגן או שימוש במושכים כימותרפיים שונים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ההשפעות של מעורבות ECM על פלישת תאים או של מושכי כימותרפיה שונים על פלישת תאים, בהתאמה.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה והסרטן לסנן מעכבים פרמקולוגיים של גרורות וכן לחקור ריפוי פצעים בכל התגובות הדלקתיות in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את יכולת הנדידה והפולשנית של תאים נדירים ורגישים, בסביבה תלת מימדית, מבלי לעוות את התאים במעורבות המיקרו. אל תשכח שהליכה עם תאי סרטן אנושיים, חומצה הידרוכלורית, פרפורמלדהיד ו-DAPI עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון שימוש בארון ביו ספיגה מספר שתיים והחזקת אדים בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר בדיקת פלישה אנכית הפוכה המכמתת את יכולות הנדידה והפלישה של תאים נדירים ורגישים בסביבה תלת-ממדית, תוך שימור המיקרו-סביבה התאית. שיטה זו רלוונטית במיוחד למחקר בתחום הסרטן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- נדידה של תאים
- מחקר סרטן
- בדיקות פלישה (Invasion assays)
רקע
- הבדיקה מאפשרת ניתוח של תאים בסביבתם המיקרוסקופית המקורית.
- היא מיועדת לתאים נדירים ורגישים.
- הבנת פלישת תאים היא קריטית לפיתוח טיפולים בסרטן.
- הדגמה חזותית של הטכניקה חיונית לביצוע נכון.
מטרת המחקר
- לכימות היכולות הנדידיות והפולשניות של תאים.
- לבחינת יכולת הפלישה של תאים רגישים.
- לסריקת חומרים פרמקולוגיים המעכבים פלישה וגרורות של תאי סרטן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת פלישה אנכית הפוכה (Inverted vertical invasion assay)
- תרבית תאים תלת-ממדית
- ניתוח תאים במיקרו-סביבתם
- הערכת השפעות הטמפרטורה וה-pH על פולימריזציה של קולגן
תוצאות עיקריות
- הדגמה של היכולת לנתח התנהגות תאים בסביבה תלת-ממדית.
- הדגשת החשיבות של שמירה על המיקרו-סביבה התאית.
- מתן תובנות לגבי יכולת הפלישה של תאי סרטן.
- הצגת פוטנציאל לסריקת חומרים טיפוליים.
מסקנות
- הבדיקה היא כלי בעל ערך למחקר סרטן.
- היא משמרת את המיקרו-סביבה של תאים רגישים.
- עשויה לסייע בפיתוח טיפולים המכוונים נגד פלישת סרטן וגרורות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מאפשרת לצוותי מחקר ופיתוח בביופארמה להעריך את הפוטנציאל הפולשני של מודלים של תאים נדירים ורגישים בסביבה מיקרו-סביבתית תלת-ממדית רלוונטית פיזיולוגית, מבלי להפריע לאינטראקציות הטבעיות בין התאים ל-ECM. על ידי שימור הנישה התאית המקורית, השיטה תומכת בהסרת סיכונים מכניסטית של מטרות הקשורות לגרורות ומשפרת את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים. היא נותנת מענה לפער קריטי בסריקה פרה-קלינית, שבה בדיקות מסורתיות פוגעות בשלמות המיקרו-סביבה, ובכך היא משפרת את הרציפות התרגומית משלב הגילוי ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הערכת פלישה במודלים של תאים נדירים או תאים המופקים מהיתוך, תחת תנאי מיקרו-סביבה טבעיים.
- ערך תפעולי: מפחית שונות ארטיפקטואלית הנגרמת מהעתקת תאים, ובכך משפר את השחזוריות של פנוטיפים של פלישה בין ניסויים שונים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות על ידי קישור הפרעות מולקולריות לתוצאות פונקציונליות של פלישה בהקשר תלת-ממדי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת מדדי פלישה כמותיים וסטנדרטיים התואמים لديמות בעלת תוכן גבוה (high-content imaging) ולזרימות עבודה של ניתוח אוטומטי.
- שחזוריות: מצמצמת את השונות בין הבארות על ידי מניעת שיבוש מכני של שכבות התאים במהלך הגדרת הבדיקה.
- ניתנות להרחבה: תואם לריכוזי קולגן ולחומרים מושכי כימיקלים (chemoattractants) משתנים, מה שמאפשר מחקרי קשר מבנה-פעילות (SAR) עבור מעכבי גרורות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה פלישה של סרטן אנושי באמצעות תאי היברידיים של פיברובלסט-אפיתל המשקפים אינטראקציות בין הסטרומה לגידול in vivo.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים in vitro לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על רמזי מיקרו-סביבה קריטיים להתנהגות פולשנית.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק נתוני פלישה פונקציונליים לתיעדוף מטרות או תרכובות, תוך הפחתת הסבירות לכישלון בשלבים מאוחרים עקב מידול לקוי של המיקרו-סביבה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומציעה חלופה השומרת על המיקרוסביבה למערכות Boyden Chamber או transwell בתוכניות העוסקות במטסטזה.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקה מונחית-השערה של נתיבי פלישה באמצעות הדמיית z-stack בזמן אמת של הגירה של תאים בתוך ג'לי קולגן פיזיולוגיים.
- סריקה: מספק נתוני נקודת-סיום של פלישה המתאימים לסריקת ספריות תרכובות, ובמיוחד עבור חומרים המכוונים לשכתוב ה-ECM או לאיתות כימוטקטי.
- אנליטיקה: מאפשר כימות של מספר התאים הפולשים ואנליזה מורפומטרית, המספקת תוצאות רב-פרמטריות לקשרי מבנה-תפקוד.
- מחקר תרגומי: מדמה פלישה המתווכת על ידי סטרומה באמצעות היברידים של MSC וסרטן, ובכך תומך במחקרים מכניסטיים הקשורים לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להסתגל לסוגי סרטן שונים ולתרביות משותפות של סטרומה, מה שמעודד שימוש חוזר בפלטפורמה בתוכניות למחקר גרורות וריפוי פצעים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מהפרעה של המיקרו-סביבה.
- ערך תפעולי: משפר את חוסנו של המבחן באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של פולימריזציית ג'ל וכיסוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים רלוונטיים פיזיולוגית על פלישה בשלב מוקדם של מסלול הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מרובד-סיכונים של מעכבי גרורות בהתבסס על פרופילים פונקציונליים של פלישה בתלת-ממד (3D).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים בתלת-ממד ובמיקרוסקופיה קונפוקלית לצורך כימות מדויק של הפלישה.
- תלוי בבקרה מדויקת של הטמפרטורה וה-pH במהלך הכנת הקולגן כדי להבטיח פולימריזציה עקבית של הג'ל.
- מחייב מינון סטנדרטי של חומרי משיכה כימיים (chemoattractants) ותנאי מדיום עם רמות סרום מופחתות כדי להשיג תגובות כימותקטיות הדירות.
- התאמה לחלבוני ECM חלופיים (למשל, Matrigel, פיברין) עשויה לדרוש אופטימיזציה של קינטיקת הג'לציה והריכוז.
- מוגבל לתאים הדבקים או חצי-הדבקים המסוגלים לפלוש כלפי מעלה דרך שכבת ג'ל; תרחיפי תאים שאינם הדבקים עשויים לדרוש התאמה של הפרוטוקול.
