Name: דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי Pentylenetetrazole (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למד כיצד ליצור מודל עכברים לאפילפסיה באמצעות Pentylenetetrazole לחקירת שינויים התנהגותיים ונוירולוגיים. השיטה מאפשרת ניתוח מעמיק של התקפים ופגיעה בזיכרון חברתי בעכברי 129 SV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו חלקית נתמך על ידי מספרים גרנט JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, ו- 17 K 07086, מספרים גרנט MEXT KAKENHI 25110737, 23110525, AMED גרנט מספר JP18ek0109311, ואת קרן מחקר רפואי SENSHIN את יפן אפילפסיה של קרן המחקר.

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של טוקיו מטרופוליטן המכון הרפואי למדע. 8 לאחר הלידה - מומלץ בן 16 בשבוע עכברים. כל זן המפגרים מקובל לניסוי. C57BL/6 עכברים הם עמידים יותר בפני PTZ, ואילו עכברים לבקן BALB/c ושווייץ רגישים יותר PTZ. C57BL/6 השתמשו במחקר זה. פגיעות PTZ תלויה גם הגיל של העכבר. בהשוואה לעכברים צעירים, עכברים בוגרים הם יותר דברים מעוותים PTZ35. מספר החיות לשימוש בשיטה זו יכול להשתנות, אבל לפחות 6-10 חיות נדרשים עבור כל תנאי.
1. הכנת PTZ
<ol><li>לפזר 2 מ"ג/מ"ל PTZ סטרילי 0.9% (w/v) NaCl. להכין PTZ ביום של שימוש.</li>
</ol>2. הזרקה של PTZ
<ol><li>ביצוע ניסויים כל בין 9:00 ל- 12:00 (בצהריים).</li>
	<li>מודדים משקל הגוף של בעל החיים.</li>
	<li>מקם את החיה חדר התצפית עבור habituation.</li>
	<li>במהלך תקופת habituation (3 דקות), לחשב את עוצמת הקול של פתרון PTZ הזריקה מבוסס על משקל הגוף של בעל החיים והמנה הזרקת נקבע בעבר. הערה: לדוגמה, בעת 35 מ"ג/ק"ג PTZ, 0.875 מ"ג PTZ נדרש לעכבר השוקל 25 גרם (35 מ"ג / ק"ג x 0.025 ק ג = 0.875 מ"ג). לכן, צריך להיות מוזרק 437.5 μL של פתרון PTZ 2 מ"ג/מ"ל (0.875 mg/2 מ"ג / מ"ל = 0.4375 מ"ל). המינון הזרקה של PTZ תלוי גנוטיפ העכבר ואת המתח. עבור פראי-סוג עכברים C57BL/6, מנה של 30-35 מ"ג PTZ/ק"ג משקל גוף מומלץ במשפט הראשון. רגישות PTZ תלוי העכבר זן המשמש36,37. הזרקת מינון משתנה על פי מטרת הניסוי.</li>
	<li>להזריק PTZ intraperitoneally עם מזרק 1-mL המצורפת מחט 27-מד לתוך המשולש השמאלי או הימני של הבטן של החיה. הימנע הזרקת בקו האמצע.<ol>
<li>הימנע זריקות חוזרות במיקום זהה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לצפות בהתנהגויות בעלי חיים במשך 30 דקות לאחר PTZ המינהל (איור 1 א'), לסווג, ציון התנהגות חריגה כפי שמוצג להלן. במידת האפשר, לשמור על החיות תחת השגחה 24 שעות ביממה, או לפחות h 6-10 נוספים לאחר זריקה, במיוחד לאחר התוצאה חומרת ההתקף מגיע ל- 3 ומעלה.<ol>
<li>הערה כל התקפים קלים או שינויים התנהגותיים בבעלי החיים מעבר למשך 30-מין התבוננות. זה ממושך תצפית תקופה רשאי לפנות בעל השפעה חשובה במיוחד ושלמה של מנה subconvulsive של PTZ דור של התקפים התגרות כרונית של אפילפסיה.</li>
		<li>בנוסף, מדד משך ההתקף כל התקף שנצפה כשינויים משך ההתקף מתייחסים חומרת ההתקף. יתר על כן, ההשהיה עד ההתקף הראשון אחרי הזריקה PTZ הוא מדד חשוב נוסף כדי לאסוף. פיקוח על בתדירות ההתקפים, ומשך השהיה הוא קריטי עבור מחקר מולקולרי שאחרי שבץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להזריק PTZ בכל יום אחר (איור 1 א'). מספר זריקות תלוי מטרת הניסוי. להלן דוגמאות מייצגות.<ol>
<li>כדי ליצור חיות לחלוטין הדולקת בפתחי הבתים, ברגע חיה חווה התקף עם ציון של 5 (תפיסה clonic), לסיים את הזריקה בתוך הממשלים שלושה נוספים. במקרה זה, להגדיל את המינון הזרקת אם הציון התקף אינה מגדילה עבור שלושה הממשלים רצופים. כל בעל חיים יכולים לקבל מנה של זריקות PTZ ומספר שונים.</li>
		<li>לתקן את המספר ואת המינון של הזרקת PTZ בכל מצב כדי להעריך את הפגיעות כדי PTZ, כולל הערכות של תרופות נגד אפילפסיה, מחקרים של פנוטיפ של עכברים מהונדסים. לתת כל בעלי מספר זהה של זריקות PTZ; סכום כולל של 8 עד 12 זריקות מומלץ. אם חיים מת, הציון התקף צריך להיות מסומן בתור 6.</li>
		<li>לקבוע את המינון הזרקה הדרושים לשמור על התקף גבוהה ציון (4 או 5) לזריקות 10 או יותר ללמוד את השינויים histopathological המתרחשות התקפים אפילפטיים. במקרה זה, המספר הכולל הזרקת צריך לנוע בין 25 ל- 30. להקטין את המינון הזרקת אם הציון התקף מגיע ל- 5. אם הציון התקף יורדת ל- 3 או נמוך יותר, להגדיל את המינון הזרקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. תפיסת ניקוד
<ol><li>לצפות את התנהגות בעלי חיים, להקליט את הציונים.<ol>
<li>לסווג, ניקוד ההתנהגויות אפילפטי כפי שמוצג להלן38,39 (איור 1B): 0: התנהגות נורמלית, אין חריגות. 1: הנייח, שוכב על הבטן. 2: ראש מיוקלונוס מהנהן, טיפול פנים, forelimb או hindlimb. 3: רציף לכל הגוף מיוקלונוס, מיוקלונית jerks, הזנב. החזיק מעמד בנוקשות. 4: התקף לגידול, טוניק, נופל על צידו. 5: תפיסה clonic, נופל על גבו, פראי ממהר וקפיצה. 6: מוות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשנות את הקריטריונים התנהגותית המבוססת על ראסין ציון40, בהתאם לתנאי הניסוי.</li>
</ol>4. תפיסת שלאחר ניתוח
<ol><li>ניתוח Immunohistopathological<ol>
<li>קיבוע זלוף<ol>
<li>הכנה<ol>
<li>להמיס 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) במאגר פוספט 0.1 M (pH 7.4). מחממים את הפתרון עד כ 70 ° C עם התוספת של טיפה של NaOH M 1 (כ 1 µL של NaOH M 1 לפתרון PFA 50 מ ל).</li>
				<li>להכין 4 קר כקרח % כדורגלן ו באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
				<li>להגדיר את משאבת סחרור, עם צינור, המחט. לרוץ כ 20 מ ל מים דרך צינור כדי לנקות את שאריות. אז, במקום את הקצה הפתוח של הצינור ב- PBS קר כקרח.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Transcardial זלוף והכנה של המוח קבוע<ol>
<li>עמוק עזים ומתנגד את העכבר עם 50% אתנול isoflurane/50% בצנצנת קטנה.</li>
				<li>לשמור את העכבר במצב פרקדן על ידי הצמדת קצות שלהם forelimbs, hindlimbs.</li>
				<li>לחתוך האמצע הגחון של הבטן ולחשוף את הסרעפת.</li>
				<li>חותכים את הסרעפת לאורך השוליים costal. לאחר מכן, לחתוך משני צדי הצלעות ועל הגוף. קמצוץ הסרעפת מאת המלקחיים נעילה ו אוורט הצלעות. לשמור על המיקום של הסרעפת על-ידי הצמדתה עם מחט או לצבוט את זה עם מלקחיים. לחשוף את הלב.</li>
				<li>הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ולעשות חתך ב אטריום ימין באמצעות מספריים. להיות מודע לא לדחוף את המחט רחוק מדי לתוך הלב, כמו זה יכול לחדור קיר פנימי.</li>
				<li>מתחילים זרימה קבועה של PBS קר כקרח דרך המחט לשטוף את הדם (כ 15-20 mL/min).</li>
				<li>כאשר הדם נוקתה מן הגוף, להעביר את הצינור פתרון paraformaldehyde 4% (כ- 60 מ"ל) ללא התוספת של בועות. אז תפסיק את זלוף.</li>
				<li>לחתוך את אחורי הצוואר ועמוד השדרה, קילוף העור הראש ואת החלק הגבי של הגולגולת עם לנתח מספריים.</li>
				<li>לחתוך את העצם premaxillary בין מסלולים העין, להסיר לחלוטין את החלק הגבי של הגולגולת.</li>
				<li>ליצור פער בין המוח לבין עצם ג'וגל האנסראג מן הצד האחורי וחותכים את המשולש העצבים ואת הצנטר מתחת המוח. בזהירות מסירים את המוח ואז למקם אותו בקבוקון המכיל 4% מחברים. פוסט-לתקן את המוח ב 4 ° C עבור h 12-16.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>המוח פרוסה הכנה<ol>
<li>להעביר את המוח קבועה 20% סוכרוז/PBS עד המוח שוקעת לתוך הפתרון כדי לאפשר cryoprotection.</li>
			<li>לחתוך את המוח קבוע בהתבסס על פרוסה נדרשת התמצאות החלק הנדרש של המוח.</li>
			<li>הגדר את cryomicrotome. להגדיר את הלהב בעמדה ולתחזק את הבמה מיקרוטום בטמפרטורה מתחת-20 ° C.</li>
			<li>למקם את המוח חתוכות מראש על הבמה, להרגיע את המוח עם 20% סוכרוז/PBS. הפתרון סוכרוז/PBS יהיה להקפיא בהדרגה, המכסים את המוח על הבמה, עד המוח לגמרי שמוטבע קפוא 20% סוכרוז/PBS.</li>
			<li>פורסים את המוח (עובי 30 מיקרומטר) על-ידי הזזת הלהב דרך הרקמות. להעביר את הפרוסות לתוך PBS ולשמור אותם ב 4 º C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>אימונוהיסטוכימיה פלורסנט<ol>
<li>לשטוף את הפרוסות הדרושות ב- 0.1% X-100/PBS טריטון (PBST) למשך 10 דקות, 3 פעמים בטמפרטורת החדר (RT).</li>
			<li>לחסום את הפרוסות על-ידי המקננת בהם ב- PBST עם 2% עז סרום או 5% שור אלבומין (BSA) עבור h 1-2-RT.</li>
			<li>דגירה הפרוסות ב פתרון נוגדנים עם ריכוז נוגדן ראשוני ב- PBST עם 2% עז סרום או 5% BSA מתאימים עבור לינה 1-7-4 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>לשטוף את הפרוסות ב- PBST 10 דקות, 3 פעמים. ב RT.</li>
			<li>דגירה הפרוסות בפתרון נוגדנים משניים עם הריכוז מתאים של נוגדנים משניים ב- PBST עבור 1-2 h ב- RT, המוגן על-ידי אור.</li>
			<li>לטעון את הפרוסות על גבי מדרון זכוכית ולכסות עם הרכבה בינונית עם כיסוי זכוכית.</li>
			<li>לבחון את הפרוסות עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>מבחן 3 תאיים<ol>
<li>הכנה<ol>
<li>להכין לפחות 2 2 - בת 6 חודשים 129/Sv עכברים מאותו המין כמו עכברים הנושא להיות "העכבר זר". Habituate כל עכברים בכלוב לפני הניתוח. עבור כל אימון, מקם את העכבר בתוך הכלוב ולהשאיר את העכבר למשך 15 דקות.</li>
			<li>לפני כל שלב habituation עם העכבר נושא, לנקות את כל המתקן ואת שני כלובים על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.</li>
			<li>מקם את הכלובים ריק בנבכי דו צדדי המנגנון 3-הקאמרית ופתח את הדלתות בין התאים.</li>
			<li>Habituate את העכבר נושא, במקום עכבר הנושא בבית הבליעה מרכז ולאפשר את העכבר כדי לנוע בחופשיות ברחבי המנגנון עד העכבר כי נחקרו שני כלובים, בתוספת חיות נושא 5 דק נוספות שעשויות להיות הנוראית של הכלוב אינם לחקור את הכלוב כעשרים דקות ולא צריך לשמש לניתוח זה. חיות כאלה למנוע את הכלוב ובאים רק לעתים רחוקות מספיק לכלוב.</li>
			<li>אחרי החיה נעה אל מרכז החדר, סגור את הדלתות ולתת העכבר לנוע בחופשיות בבית הבליעה מרכז במשך 5 דקות. במהלך תקופה זו, לשים אחד מהעכברים 129/Sv בכלוב כדי habituate לכלוב.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניתוח sociality<ol>
<li>לבצע ניתוח זה מיד לאחר תקופת habituation של העכבר נושא.</li>
			<li>למקם את הכלוב המכיל עכבר 129/Sv, כינה "זר 1 בכלוב" באחד התאים בצד ומניחים את הכלוב ריק, כינה "אובייקט בכלוב", בחדר בצד השני.</li>
			<li>פתח את הדלת, לפקח על אופן הפעולה של מצביע העכבר נושא.</li>
			<li>לאפשר את העכבר נושא כדי לנוע בחופשיות למשך 10 דקות ולהקליט את הפרמטרים הבאים התנהגותית. אם העכבר נושא מפחד העכבר בכלוב 1 זר, כמצוין על-ידי עכבר הימנעות הכלוב זר 1, נותר בפינה של אחד התאים, צריך החיה לא לשמש לניתוח. a) הזמן בילה כל תא, תא 1 זר, אובייקט קאמרית ו מרכז קאמרית. b) הזמן בילה חוקרים כל הכלוב, הכלוב זר 1 ועל הכלוב אובייקט. (העכבר מסווג כ חוקר את הכלוב אם העכבר מרחרחת או פרא העכבר או כלוב) ג) מספר כניסות לתא כל (אופציונלי) ד) המרחק הכולל נסע (אופציונלי)</li>
			<li>לאחר העכבר זז אל מרכז החדר, סגור את הדלתות</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניתוח החדשנות החברתית<ol>
<li>לבצע ניתוח זה מיד לאחר הניתוח sociality.</li>
			<li>נגב שני כלובים עם 70% אתנול.</li>
			<li>הנח את העכבר 129/Sv אחר באחד הכלובים, כינה את "כלוב זר 2" ואת הכלוב במקום ה 2 זר באחד התאים. הנח את העכבר 1 זר בכלוב השני, הנקרא "בכלוב זר 1" ולמקם את הכלוב זר 1 בחדר השני.</li>
			<li>פתח את הדלת, לפקח על אופן הפעולה של מצביע העכבר נושא.</li>
			<li>לאפשר את הנושא העכבר כדי להזיז בחופשיות למשך 10 דקות, ומדידת באותם פרמטרים ההתנהגות המתוארת על הניתוח sociality. הערה: העכבר זר 1 ו- 2 זר צריך להיבחר באקראי. תא 1 זר אובייקט קאמרית וכן קאמרית זר 1 ואת 2 זר קאמרית צריך להיקבע באופן אקראי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>פחד הקשרי אפליה<ol>
<li>מיזוג<ol>
<li>לפני כל משפט מיזוג לנקות את המנגנון ניסיוני על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.</li>
			<li>הכנס עכבר מנגנון מיזוג עם תנאים מסוימים (המנגנון צורה צבע הקיר, חומר הרצפה, ריח, תאורה, עוצמת הקול רעש רקע מראש ייקבע). לדוגמה, המנגנון מיזוג המשמש כאן היה מנגנון מרובע עם פלקסיגלס ברור קירות, רצפה ברשת מתכת, ריח אתנול, בהירות 100 lux ו רעש לבן רקע 65-dB.</li>
			<li>להתנות את העכבר על ידי רגל-הלם בתזמון אקראיים מדומים של 0.1-mA זעזועים חשמליים עבור 2 s x 3 פעמים במשך 5 דקות.</li>
			<li>להחזיר את העכבר הכלוב הביתה לאחר מיזוג.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הערכת הזיכרון<ol>
<li>לפני כל הערכה, לנקות את המנגנון ניסיוני על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.</li>
			<li>למחרת מיזוג הבאים, להכניס את העכבר בתוך המנגנון אותו כתנאי הלם ומדידת הזמן קפוא במשך 5 דקות.</li>
			<li>מאוחר יותר באותו היום, מקם את העכבר מנגנון הרומן ומדידת זמן הקפאה במהלך הערכה 5-מין. מנגנון משולש עם קירות לבנים פלקסיגלס, צלחת קומה, אין ריח, בהירות לאקס 30 רעש לבן 70-dB שימש כאן.</li>
			<li>להשוות את הזמן קופא בין התנאי תנאי הרומן. העכברים עם יכולת זיכרון נורמלי יהיה להקפיא יותר באותו מצב מאשר במצב הרומן. הקפאה היא מוגדרת הקיפאון של החיה עבור יותר מ 2 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגישים נרחב להקמתה של מודל בעלי חיים תרופתי של אפילפסיה. בתיווך PTZ הצתה כימי היסטוריה ארוכה, הוא מודל שהנוהג המקובל עבור המחקר של פתולוגיה histopathology וסלולר של אפילפסיה41. הדגם הצתה כימי של אפילפסיה נצפה בעבר על-ידי Suzdak ג'נסן, 199542. אינדוקציה פרכוס תרופתי, במיוחד עם PTZ, היא שיטה פשוטה וקלה עבור לעורר התקפים חמורים. שינויים המינון הזרקת לתאם עם חומרת ההתקף. לפיכך, זיהוי את המינון המתאים לאורך כמה מחקרים על-ידי שינוי המינון PTZ, בחינת ההתנה...

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית כרונית זה מאופיין על-ידי התקפים חוזרים ונשנים ומשפיע כ- 1% של אנשים. המנגנונים שבבסיס הדור epileptogenesis ותפיסה בחולי אפילפסיה לא יכול להיות מובהר מלא במחקרים קליניים. לכן, מודל חיה המתאימה נדרש לצורך המחקר של אפילפסיה1.
מגוון רחב של מודלים חייתיים של אפילפסיה שימשו כדי לחקור את הפיזיולוגיה של אפילפסיה וכדי לזהות תרופות אנטי-אפילפטי2,3. בין אלה מודלים, תפיסת תרופתי אינדוקציה הוא שיטה נפוצה המשמשת ליצירת מודל חיה על החקירה של הפתולוגיה של אפילפסיה4. שיטה זו היא פשוטה וזולה. הצתה בתיווך אלקטרודה היא גם שיטה בשימוש נפוץ, אבל העלויות של הליך זה הן גבוהות יותר, השיטה דורשת מיומנויות כירורגית, חשמליים כדי לגרום להתקפים חוזרים5.
אינדוקציה תרופתי יש יתרון גם כי התזמון ואת מספר התקפים נשלטים בקלות. מודלים העכבר גנטי כי התערוכה התקפים ספונטנית משמשים גם במחקר של אפילפסיה. עם זאת, לחזות מתי ובאיזו תכיפות ההתקפים עולות דגמים גנטיים אלה עשוי להיות אפשרי6. מערכת ניטור נדרש כדי לצפות את ההתנהגות אפילפטיים של עכברים מהונדסים6.
חומצה Kainic, פילוקרפין ו- pentylenetetrazole (PTZ) נמצאים בשימוש נרחב כמו גרימת התקף תרופות7. חומצה Kainic הוא אגוניסט עבור רצפטורים גלוטמט, ומפעילה פילוקרפין קולטנים שימוש. PTZ הוא גמא בוטירית (GABA)-אנטגוניסט קולטני8. PTZ מעלימה את הפונקציה של הסינפסות מעכבות, שמוביל פעילות. עצבית מוגברת. תקנה זו גורמת מוכללת ויהיו בעלי חיים9. זריקה אחת של חומצה kainic, פילוקרפין יכול לגרום להתקפים חריפה, במיוחד סטטוס אפילפטיקוס (SE)10,11 ומקדם kainic חומצה או פילוקרפין-בתיווך SE התקפים ספונטנית ולא חוזרים ונשנים כרונית12 , 13. הקלטות electroencephalographic (EEG) וניתוח התנהגות הראו כי התקפים חוזרים ונשנים ספונטנית שנצפו חודש אחרי12,13זריקה בודדת. זריקה אחת של מנה עוויתית של PTZ גורם גם התקף אקוטי. עם זאת, התקפים ספונטנית כרונית לאחר זריקה אחת של PTZ קשים לקדם. ממשל כרונית של PTZ נדרש כדי לגרום להתקפים חוזרים14. בשיטה אחת, הדור של התקפים חוזרים הוא מסוגל לגרום מחלה דומה יותר לזה של אפילפסיה האנושית מאשר בדור של התקפים חריפה. במקרה של PTZ, כל זריקה מעורר התקף, חומרת ההתקף הופכת קשה יותר בצורה stepwise עם כל זריקה. לבסוף, זריקה אחת של PTZ במינון נמוך גורם של תפיסה clonic חמורה. בשלב זה, כל זריקה מעורר התקפים חמורים. בנוסף, תפיסת השהיה והמשך גם להשתנות לאורך המסלול של הזריקות. ההשהיה לתפיסה טוניק לעתים קרובות הופך קצר יותר בשלב האחרון של בני15. יתר על כן, עוגמת נפש ההתקף מלווה משך התקף ממושך16. חוקרים את המנגנון המולקולרי המסדיר את חומרת ההתקף, השהיה, ומשך שימושית הקרנת סמים אנטי-אפילפטי17,18,19.
התקפים הם בדרך כלל המושרה על ידי ניהול מערכתי יחידה של PTZ, ההחלמה היא מהירה מאוד, במרחק של 30 דקות4,5. לכן, מספר התקפים הוא יותר לשליטה במודל PTZ-הסקה. עם זאת, ניטור EEG ציין כי קוצים מוכללת, ניתן לראות עד 12 שעות לאחר ההתקף בתיווך PTZ20. לכן, בעלי חיים צריכים רצוי להישאר בהשגחה במשך 24 שעות לאחר ההתקף מיוקלונית או טוניק21 לניתוח מדויק יותר של מנגנוני הצתה.
הממשל של תרופות אנטי-אפילפטי, כגון ethosuximide, valproate, פנוברביטל, vigabatrin ו- retigabine3, לפני או אחרי הזרקת PTZ מפחית את הסיכון של העצבים של תפיסת חומרת3,22, 23. באופן דומה, עכברים knockout כי חוסר גנים מעורבים החרפה התקף, כגון מטריקס מטאלו-פרוטאינאז-924, FGF-2225 ו- neuritin26, הוכחו שהפגינו חומרת ההתקף מופחתת לאחר זריקות PTZ מרובים. בנוסף, צופה שינויים histopathological לאחר התקפים אפילפטיים אפשרי בשיטה זו. בחולים עם אפילפסיה, ישנם שינויים היסטולוגית טיפוסי במוח, כגון סיבים מוסי הלבלוב דופאמינרגיים astrogliosis30, גרגר חריג נוירון ההעברה29,27,28 מוות ההיפוקמפוס31,32ולאחר טרשת בהיפוקמפוס33. שינויים דומים הם נצפו בחיות מודל אפילפטיים. בין השיטות הזמינות, בתיווך PTZ הצתה כימי היא שיטה טובה, הדירים זול לייצר במודל חיה של אפילפסיה. במודל בתיווך פילוקרפין SE, תפיסת השליטה קשה, עכברים רבים מתים או לא מצליחים לפתח SE34. לעומת זאת, התמותה, חומרת ההתקף הם יותר לשליטה במודל PTZ. בנוסף, PTZ הוא זול יותר מאשר חומצה kainic, מיומנויות ניתוח מוח העכבר אינם הכרחיים לצורך והתרופות האמריקני.

<table><tbody><tr><td>Pentylenetetrazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>MANAC</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>עכבר</td><td>CLEA יפן</td><td></td><td>C57Bl/6NJcl, לאחר לידה 8 שבועות,</td></tr><tr><td>מזרק זכר (1 מ"ל)</td><td>מחט Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>(27G x 3/4 אינץ') (0.40 x 19 מ"מ)</td> <td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>משקל</td> <td>שקילהMettler</td><td>PE2000</td><td>פריט זה הוא מוצר שהופסק. כמעט שווה ערך ל-FX-2000i עם FXi-12-JA מבית A& פלוגה ד'.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>nacalai tesque</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטטית</td><td>ATTO</td><td>SJ1211</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>nacalai tesque</td><td>30404-45</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Yamato</td><td>REM-700</td><td>פריט זה הוא מוצר שהופסק. כמעט שווה ערך ללהב מיקרוטום REM-710</td></tr><tr><td></td><td>נוצה</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד סינפטופורין</td><td>מערכות סינפטיות</td><td>102 002</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים אנטי-ZnT3</td><td>מערכות סינפטיות</td><td>197 002</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-דאבל קורטין</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-8066</td><td>פריט זה הוא מוצר שהופסק. לא בדקנו מוצר שווה ערך (sc-271390).</td></tr><tr><td>מנגנון בדיקת אפליית פחד קונטקסטואלי</td><td>O'hara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר בדיקה תלת-קאמרית</td><td>Muromachi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) הוא אנטגוניסט קולטן GABA-A. זריקה בקרום הבטן של PTZ לחיה המניע של התקף אקוטי, חמור במינון גבוה, בעוד זריקות רציפים של מנה subconvulsive שימשו לפיתוח כימית מוצתים, מודל אפילפסיה. זריקה אחת במינון נמוך של PTZ גורם התקף קל ללא עווית. עם זאת, חוזרות זריקות במינון נמוך של PTZ להקטין את הסף לעורר התקף עוויתי. לבסוף, במינון נמוך מתמשך, מינהל PTZ גורם של תפיסה clonic חמורה. שיטה זו היא פשוטה, החלים נרחב לחקור הפתופיזיולוגיה של אפילפסיה, אשר מוגדרת כמחלה כרונית המערבת התקפים חוזרים. הכימי מוצתים פרוטוקול גורמת להתקפים חוזרים אצל בעלי חיים. בשיטה זו, הוערך פגיעות בתיווך PTZ התקפים או מידת ההחמרה של התקפים אפילפטיים. יתרונות אלה הובילו השימוש בשיטה זו לסינון סמים אנטי-אפילפטי, גנים הקשורים אפילפסיה. בנוסף, שיטה זו שימש לחקור נזקים עצביים לאחר התקפים אפילפטיים, בגלל השינויים היסטולוגית במוחם של חולי אפילפסיה להופיע גם במוחם של חיות כימית-כיליון. לפיכך, פרוטוקול זה שימושי להפקת בנוחות מודלים חייתיים של אפילפסיה.

הזרקה חוזרות של PTZ גורם לעלייה בחומרתן התקף. 6 C57BL/6 עכברים שטופלו PTZ, עוד 6 עכברים שטופלו תמיסת מלח כקבוצת בקרה. המינון PTZ היה 35 מ"ג/ק"ג, 10 זריקות נוהלו. הציון התקף גדל בהדרגה עם זריקות PTZ, ואילו ללא התקפים או התנהגויות חריגות ולעוצמת על ידי זריקות מלוחים (איור 2). אנובה ואחריו Bonferroni הבדיקה הראו הבדל משמעותי בין קבוצת שטופלו PTZ לקבוצת שטופלו תמיסת מלח.
פרכוס שחוזרת על עצמה מקדמת aberr...

פרוטוקול זה מתאר שיטה של הצתה כימי עם pentylenetetrazole ומספק דגם העכבר של אפילפסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפגיעות פרכוס אינדוקציה, פתוגנזה לאחר התקפים אפילפטיים בעכברים.

דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי Pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

שיטה זו יכולה לסייע בניתוח מעמיק של אפילפסיה. ההתקף יגרום לשינויים היסטולוגיים במוח שעשויים להיות מעורבים בהפרעות ההתפתחותיות הנוירו-פסיכיאטריות. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שמינון עצמי של PTZ יכול לגרום להתקפים נשלטים טוב יותר מהשיטות האחרות הנוכחיות.התחל בהכנת ההזרקה על ידי המסת 2 מיליגרם למיליליטר PTZ בסטרילי 0.9 אחוז נתרן כלורי. שקלו את החיה, ואז הניחו אותה בתא תצפית לתקופת התרגלות של 3 דקות. לאחר מכן, הזריק PTZ באופן אינטרפריטוני עם מזרק של 1 מיליליטר המחובר למחט בגודל 27 לרבע השמאלי או הימני של בטן החיה.לבסוף, התבונן בבעל החיים לאחר הזרקת PTZ להתנהגות חריגה. השג לפחות שני עכברי SV בני חודשיים עד שישה חודשים שהם מאותו המין של העכברים הנבדקים להיות העכבר הזר. יש לשמור כל עכבר זר בנפרד.עבור כל אימון, השאירו את העכבר בכלוב להתרגלות למשך 15 דקות. נקה את כל המנגנון בשני הכלובים על ידי ניגוב המשטח באתנול 70%. לאחר מכן, הנח את הכלובים הריקים בשני התאים הצדדיים של המנגנון בן שלושת החדרים ופתח את הדלתות בין התאים.כדי להרגיל את העכבר הנבדק, הנח את העכבר הנבדק בתא המרכזי ואפשר לעכבר לנוע בחופשיות ברחבי המכשיר עד שהעכבר יחקור את שני הכלובים, בתוספת חמש דקות נוספות. לאחר שהחיה עוברת לחדר המרכזי, סגרו את הדלתות ותנו לעכבר לנוע בחופשיות בתא המרכזי למשך חמש דקות. במהלך תקופה זו, הכניסו אחד מ-129 עכברי SV לכלוב כדי להתרגל לכלוב.מיד לאחר תקופת ההתרגלות של העכבר הנבדק, הנח את הכלוב המכיל את עכבר 129 SV, המכונה כלוב הזר האחד, באחד התאים הצדדיים והנח את הכלוב הריק, המכונה כלוב האובייקט, בתא הצדדי השני. פתח את הדלת ועקוב אחר התנהגות העכבר הנושא. אפשר לעכבר הנושא לנוע בחופשיות במשך 10 דקות ולהקליט ארבעה פרמטרים התנהגותיים.מספר אחד, הזמן שבילה בכל חדר, תא הזר האחד, תא האובייקט והחדר המרכזי. שנית, הזמן שהוקדש לחקירת כל כלוב, כלוב הזר וכלוב החפץ. מספר שלוש, מספר הכניסות לכל חדר ומספר ארבע, המרחק הכולל שעבר.לאחר שהעכבר עובר לתא המרכזי, סגור את הדלתות. לאחר ניגוב הכלובים, התחל בניתוח החידוש החברתי על ידי הנחת עכבר 129 SV נוסף באחד הכלובים, המכונה כלוב Stranger Two, והנח את כלוב Stranger Two באחד החדרים. הנח את הזר עכבר אחד בכלוב השני, המכונה כלוב הזר הראשון, והנח את כלוב הזר אחד בתא השני.לבסוף, פתח את הדלת ועקוב אחר התנהגות העכבר הנושא. אפשר לעכבר הנבדק לנוע בחופשיות במשך 10 דקות ולמדוד את אותם פרמטרים התנהגותיים שתוארו לניתוח החברתיות. התחל בהצבת עכבר במנגנון מיזוג עם תנאים ספציפיים.לדוגמא, מכשיר מרובע עם קירות פרספקס שקופים, רצפת רשת מתכת, ריח אתנול, בהירות של 100 לוקס ורעש לבן של 65 דציבלים. התנה את העכבר בשוק חשמלי ברגל עם תזמון פסאודו-אקראי של מכות חשמל של 0.1 מיליאמפר למשך שתי שניות שלוש פעמים במהלך חמש דקות. לאחר מכן, החזר את העכבר לכלוב הביתי לאחר המיזוג.ביום שלאחר ההתנייה, בצע הערכת זיכרון על ידי הכנסת העכבר לאותו מכשיר כמו מצב ההלם ומדידת זמן ההקפאה במשך חמש דקות. מאוחר יותר באותו יום, הנח את העכבר במכשיר חדש ומדוד את זמן ההקפאה במהלך הערכה של חמש דקות. לבסוף, השוו את זמן ההקפאה בין אותו מצב למצב חדש.התוצאות הצביעו על כך שציון ההתקפים עלה בהדרגה עם זריקות PTZ, בעוד שלא התעוררו התקפים או התנהגויות חריגות על ידי זריקות מי מלח. יתר על כן, התקפים חוזרים ונשנים קידמו היווצרות ענפים אקסונליים חריגים או נביטת סיבים אזובים ונדידה חריגה של תאי גרגיר בהיפוקמפוס. עכברים שטופלו ב-PTZ הראו חברתיות נורמלית.עכברים בילו יותר זמן בחדר הזר אחד מאשר בתא האובייקט וחקרו את כלוב הזר יותר מאשר חקרו את כלוב האובייקט. עכברים שטופלו ב-PTZ הראו חידוש חברתי חריג, המעיד על פגיעה בזיכרון החברתי. עכברים שטופלו ב-PTZ הראו גם פגיעה בזיכרון במבחן הפחד ההקשר.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבוך המים של מוריס או מבחני זיכרון אחרים כדי לענות על השאלות הנוספות לגבי יכולת הזיכרון הלקויה המושפעת מהתקף אפילפטי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום האפילפסיה לחקור כמנגנון של הפרעות התפתחותיות נוירו-פסיכיאטריות הנגרמות על ידי התקפים באמצעות חיות מודל.

pentylenetetrazole-induced-kindling-mouse-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מציג את ההליך לגרימת אפילפטיקוס סטטוס (SE) בעכברים על ידי מתן מערכתי של פילוקרפין למודל אפילפסיה של האונה הרקתית.

טיפול פילוקרפין מערכתי: מודל עכברי של אפילפסיה של האונה הרקתית

סרטון זה מדגים את ההליך לגרימת התקפים הנגרמים מחום בעכבר טרנסגני עם מוטציות גנטיות הקשורות לאפילפסיה על ידי העלאה הדרגתית של טמפרטורת הגוף בתא מבוקר. פרוטוקול זה משמש לחקר מנגנוני התקפים וטיפולים פוטנציאליים לאפילפסיה.

הפעלה וניטור של התקפים הנגרמים על ידי חום במודל עכבר טרנסגני

סרטון זה מדגים את תהליך השראת האפילפסיה בעכברים באמצעות זריקות פנטילנטטראזול (PTZ), אנטגוניסט לקולטן GABA-A. מתן תוך-צפקי חוזר של PTZ מוריד בהדרגה את סף ההתקפים על ידי עיכוב זרם יוני כלוריד, שיבוש הולכה עצבית מעכבת ומוביל לריגוש יתר בתאי עצב המעוררים התקפים. תהליך זה מביא להתלקחות והתפתחות של התקפים ספונטניים, המדמים אפילפסיה כרונית.

הקמת מודל התקף אפילפטי המושרה על ידי Pentylenetetrazole בעכברים

מקור: Shandra, O. et al., השראת אפילפסיה פוסט-טראומטית במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית מפושטת חוזרת ונשנית.  J. Vis. Exp.

טכניקה לגרימת התקפים פוסט טראומטיים במודל עכבר באמצעות פציעה טראומטית של ירידה במשקל

מודלים עכבר מהונדסים ונוקאאוט של מחלות נוירולוגיות שימושיים לחקר התפקיד של גנים בנוירופיזיולוגיה נורמלית ולא נורמלית. מאמר זה מתאר שיטות שיכולים לשמש כדי לחקור הגברה לטווח ארוך, מנגנון תאי שעשוי בבסיס למידה וזיכרון, במהונדס ומפסיד יוצא, באופן חופשי מתנהג מודלים עכבר של neuropathology.

הגברה לטווח ארוך של Perforant מסלול-משוננת gyrus סינפסה בחופשיות מתנהג עכברים

מאמר זה מדגים את הביצועים של דיקור סיני, מודלים של אפילפסיה וניתוח שינה במכרסמים. מתוארים הליך הדיקור וזיהוי נקודות הדיקור. פילוקרפין או פנטילנטרזול (PTZ) משמשים לגרימת אפילפסיה. אלקטרוקורטיקוגרמה (ECoG), אלקטרומיוגרמה (EMG), טמפרטורת המוח ורישומי פעילות תנועתית משמשים לניתוח שינה.

מניפולציה של Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) ולישון חולדות ועכברים ידי דיקור

פרוטוקול שיטתי זה מתאר מודל חדש לבעלי חיים של אפילפסיה פוסט-טראומטית לאחר פגיעה קלה במוח הטראומטי. החלק הראשון לפרטים צעדים לפגיעה מוחית טראומטית אינדוקציה באמצעות מודל שונה ירידה במשקל. החלק השני מספק הנחיות לגבי הגישה הכירורגית עבור מערכות מידע חד-ערוצית לרכישת נתונים אלקטרונצלוגרפיה.

גרימת אפילפסיה פוסט טראומטית במודל עכבר של פגיעה במוח החוזר ומפוזר טראומטי

דו"ח זה מתאר את השיטות ליצירת מודל של אפילפסיה של האונה הרקתית המבוסס על הצתה חשמלית של עכברי VGAT-Cre טרנסגניים. עכברי VGAT-Cre עשויים להיות שימושיים בקביעת הגורמים לאפילפסיה ולהקרנת טיפולים חדשניים.

הכנה והשתלה של אלקטרודות להצתה חשמלית של עכברי VGAT-Cre ליצירת מודל לאפילפסיה של האונה הרקתית

האמיגדלה ממלאת תפקיד מפתח באפילפסיה של האונה הרקתית, שמקורה במבנה זה ומתפשטת ממנו. מאמר זה מספק תיאור מפורט של ייצור אלקטרודות מוח עמוקות עם פונקציות הקלטה וגירוי כאחד. הוא מציג מודל של אפילפסיה של האונה הרקתית האמצעית שמקורה באמיגדלה.

שימוש באלקטרודה דו-קוטבית ליצירת מודל עכבר אפילפסיה של האונה הרקתית על ידי הצתה חשמלית של האמיגדלה

הפרוטוקול מציג שיטה חדשנית לניתוח והדמיה של התנהגויות הקשורות להתקפים המושרים על ידי פנטילנטרזול בעכברים. גישה זו משתרעת מעבר לציונים המסורתיים של רסין, ומספקת הערכה מקיפה יותר של המגוון והדינמיקה הזמנית של התנהגויות איקטליות.

אפיון התנהגותי של התקפים הנגרמים על ידי Pentylenetetrazole: מעבר לסולם Racine

למד כיצד ליצור מודל עכברים לאפילפסיה באמצעות Pentylenetetrazole לחקירת שינויים התנהגותיים ונוירולוגיים. השיטה מאפשרת ניתוח מעמיק של התקפים ופגיעה בזיכרון חברתי בעכברי 129 SV.

דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי Pentylenetetrazole

גלה סרטונים נוספים