Name: מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי גין דפיקה למטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: חקור מנגנוני עמידות מושגת לטיפולים ממוקדים בסרטן באמצעות שיטת in vitro ליצירת תת-שיבטים עמידים לתרופות. שיטה זו מאפשרת זיהוי מנגנוני עמידות ושחזור רגישות על ידי השתקת גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות ד ר ורוניקה זאנוני לעריכת כתב היד.

הערה: פרוטוקול זה במיוחד הותאם לניתוח של המנגנונים ההתנגדות רכשה הרצפטין של שורות תאים של סרטן קיבה וורויקשייר-חיוביות. כל מכשירי מעבדה הצורך מדווחים בטבלה של חומרים.
1. דור של Subclones עמידים לטיפול ממוקד
הערה: זה הכי קריטי, קשה לתקנן את שלב בפרוטוקול בשל העובדה כי שורות תאים שונים עשוי להפגין רגישויות שונות לחומר המדכא טיפולית יישוב עצמאי של התרכזות histotype או התרופה שלהם הגידול בשימוש.
<ol><li>תרבות NCI-N87 תא קו בינוני RPMI בתוספת סרום עגל עוברית (10%) וגלוטמין (2 מ מ, 1%), כמו טפט ב 37 מעלות צלזיוס, זרע זה על 25 ס מ2 תרבות מבחנות.</li>
	<li>הוסף למדיום תרבות ב כל הבקבוק 10 µg/mL של הרצפטין המינון ההתחלתי. חושפים את התאים המינון ההתחלתי עד שהם לחדש גדל. הערה: המינון ההתחלתי של החומר המדכא טיפול ממוקד צריך להיות 10-fold נמוך יותר ריכוז שיא פלזמה שלה. ריכוז שיא פלזמה היא הרמה הגבוהה ביותר של ריכוז התרופה זוהה דם החולה בדרך כלל בעקבות מספר מינונים של טיפול סטנדרטי. ערך זה ניתן יהיה לאחזר ממחקרים על פרמקוקינטיקה.</li>
	<li>לעקוב אחר גדילת תאים עם השיטה הדרה trypan blue; כאשר יתחדש צמיחת תאים (בדרך כלל לאחר תקופה של שבועיים עד שלושה שבועות), חושפים את התאים 10-fold ריכוז מינון גבוה יותר של הרצפטין.</li>
	<li>לחשוף לתאים מנה בהדרגה גדל והולך של הרצפטין (מתוך 100 µg/mL כדי µg 400/mL) עד לשמור תאים הגדלים (לאחר כשבועיים) למרות נוכחותם של ריכוז סמים גבוהה (לפחות 2.5 - 4-fold גבוה יותר מאשר הפסגה פלזמה).</li>
	<li>
ביצוע וזמינותו של clonogenic כדי להעריך את רמת ההתנגדות לטיפול ממוקד-כל שינוי של הריכוז של החומר המדכא טיפול המטרה בטווח הבינוני תרבות, ולהגדיר עמידות יחסית IC50 אינדקס (RR IC50) כדלקמן.
	<ol>
<li>זרע 500 תאים 24 צלחות תרבות רב טוב. הערה: בארות 5 צריך להיות מוכן לכל ערכת תנאים.</li>
		<li>לחשוף תאים הגדלת יעד טיפול מעכב (הרצפטין) ריכוזים של µg/mL 100 עד 400 µg/mL.</li>
		<li>דגירה בתאים חממה2 CO ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 ימים.</li>
		<li>לאחר דגירה, לתקן, כתם דגימות כדלקמן.<ol>
<li>להסיר תאים בינונית ולאחר מכן לשטוף עם PBS 1 x 10 מ"ל. 1 x PBS להסיר ולהוסיף 2-3 מ"ל של פתרון קיבעון (חומצה אצטית: מתנול, 1:7, (כרך/כרך)). להסיר את הפתרון קיבוע ולהוסיף הפתרון קריסטל ויולט 0.5%. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים</li>
			<li>להסיר את הפתרון קריסטל ויולט בקפידה על-ידי כ רפה בעברית עם פיפטה ומשקיעים לוחות במי ברז לשטיפה מכל משקעים הפתרון קריסטל ויולט. מילה נהדרת בטמפרטורת החדר עד 2 ימים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לספור מושבות של יותר מ- 50 תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (4 X הגדלה). הערה: שני משקיפים עצמאיים נדרשים עבור זה.</li>
		<li>לחשב RR IC50 כיחס בין ערך50 IC תאי היעד-טיפול עמידים subclone, הערך של התאים המקורי/נאיבי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אימות פרוטוקול עבור המועמד ממוקד בטיפול ההתנגדות ג'ין (R-גן)
הערה: לאחר אפיון גנים, חתימות המשויך ההתנגדות רכשה יעד טיפול וג'ין כל מועמד כמו נהג של התנגדות ייחקר באמצעות: א) RT-PCR, ומערבי ב) כתם ניתוח.
<ol><li>
בזמן אמת RT-PCR
	<ol>
<li>לחלץ RNA הכולל שורות תאים באמצעות תערובת thiocyanate-פנול-כלורופורם חומצה guanidinium (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>לבצע תגובות שעתוק במהופך (RT) באמצעות תחל hexamer אקראיים ולהגדיר הצנטרפוגה תרמי כדלקמן: הטרמה 25 ° c במשך 5 דקות, RT ב 46 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ו- RT איון ב 95 ° C עבור 1 דקות.</li>
		<li>שימוש 400 ננוגרם של RNA הכולל עבור ריאקציה 20 µL. להכין לתערובת תגובה עבור מדגם כדלקמן: 7 µL RNase חינם H2א, 2 µL cדנ א (10 ng/µL), µL 1 20 x התווית על-ידי פלורסנט בדיקה במטרה ולאחר 10 µL 2 x Mix המכילה מאגר dNTPs, ה-DNA פולימראז (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>להוסיף 20 µL של תערובת התגובה כל צלחת היטב ולהפעיל את התוכנית הבאה: מחזיקים את הבמה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (מחזור 1); אז 40 מחזורי ב 95 ° C 15 s ו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תספיג חלבון
	<ol>
<li>לשחזר המתלים תא על-ידי הוספת 2 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA פתרון ומאפשר 2-3 דקות עבור טריפסין לעבודה.</li>
		<li>להוסיף 2 כרכים בינוני המכיל 10% עוברית שור סרום כדי לנטרל טריפסין (למשל, 2 מ ל בינונית עבור כל 1 מ"ל של טריפסין) ואת צנטריפוגה-g x 1,200 עבור 5 דק להשליך supernatant ותאי תשטוף עם PBS קר 1 x.</li>
		<li>תגובת שיקוע צנטריפוגה-g x 1,200 עבור 5 דקות וזורקים. Resuspend בגדר תא עם פירוק מאגר, דגירה על כיסא נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.<ol>
<li>הכמות של פירוק מאגר תלויה מספר התאים (למשל, µL 100 עבור 1 x 106 תאים); הקפד להכין מאגר פירוק טריים בכל פעם. עבור 1 מ"ל של פירוק מאגר הכנה (להשאיר על קרח): שימוש 975 µL M-לכל מאגר lysate בתרבית של מעכבי פרוטאז, פוספטאז µL 15, 10 µL 100 מיקרומטר PMSF מעכבי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לשחזר את החלבון supernatant על ידי צנטריפוגה lysate תא ב g x 13,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
		<li>לקבוע ריכוז חלבון באמצעות שיטת של BCA.</li>
		<li>להוסיף 4 x LaemmLi מדגם מאגר דגימות חלבון (לפחות 20-30 µg של חלבון) וחום ב 100 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.</li>
		<li>השתמש precast 4-20% ג'ל וטען µg 20-30 של פתרון חלבון LaemmLi ו- 5-10 µL של חלבון סטנדרטית עבור דגימה.</li>
		<li>למלא את הטבעת תספיג טריס/GLICYNE /SDS 1 x מאגר ולהפעיל ג'ל-110 V למשך 30-60 דקות (עצירת הזמן בדוק כי לצבוע הגיע לסוף של הג'ל, אחרת להפעיל לכמה דקות נוספות)</li>
		<li>Electroblot להעביר את החלבון לתוך קרום PVDF (ראה טבלה של חומרים) באמצעות מערכת חצי יבש.</li>
		<li>לחסום את הקרום על-ידי לספוג את הפתרון המתאים חלבון (חלב/BSA 5%) על ניעור בטמפרטורת החדר מאובטח.</li>
		<li>להפוך את פתרון 1:400 עם נוגדן anti-IQGAP1 העיקרי בפתרון חלב 5% (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>מקם את הקרום פתרון נוגדן ראשוני על מטרף בחדר קר בן לילה.</li>
		<li>למחרת, לבטל את הפתרון נוגדן ומשרים בפתרון 1 x T-TBS (1 x T-TBS: 1 x טריס מלוחים מאגר שנוספו על-ידי Tween20 0.1%) על מטרף בטמפרטורת החדר במשך 7 דקות.</li>
		<li>להתעלם T-TBS 1 x והחלפה של פתרון. חזור על 3 פעמים.</li>
		<li>להפוך את פתרון העכבר המשני-נוגדן 1:10,000 על-ידי הוספת נוגדן המערבי הסטנדרטי כתם זיהוי (ראה טבלה של חומרים) ומניחים את הקרום על מטרף; יוצאים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.</li>
		<li>לבטל את הפתרון נוגדן ומשרים בפתרון 1 x T-TBS על מטרף בטמפרטורת החדר במשך 7 דקות.</li>
		<li>להתעלם T-TBS 1 x והחלפה של פתרון. חזור על 3 פעמים.</li>
		<li>להשרות קרום עבור 5 דקות פתרון chemiluminescent ולאחר תמונה הקרום על imager chemiluminescence.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. שחזור רגישות מעכב היעד-טיפול על ידי המועמד R-גן דפיקה למטה
<ol><li>
הכנה תא
	<ol>
<li>הכן תא בודד השעיה על ידי trypsinization. לבצע תרביות תאים ביום בו התאים אינם מצופים.<ol>
<li>לשטוף NCI-N87 תאים עם PBS, דגירה ב 37 ° C עם פתרון טריפסין/EDTA 0.05% 5-10 דקות להוסיף 2 נפח של RPMI בינוני המכיל 10% עוברית שור סרום לנטרל טריפסין (למשל, 2 מ ל בינונית עבור כל 1 מ"ל של טריפסין).</li>
			<li>ספירת תאים hemocytometer באמצעות צביעת trypan blue. זרע 2.5 10x5 תאים (60% הנהרות) לתוך בקבוקון2 ס מ T25 עבור כל תנאי. הערה: מספר מתאים של תאים עבור זריעה נקבעת לפי זמן ההכפלה של הקו הסלולרי וכן את משך הזמן של הניסוי. המטרה היא להשיג את היעד גן דפיקה למטה משך כל זמן הניסוי. תשעה T25 ס מ2 מבחנות הינם אידיאליים עבור תנאים תקנים ואת וזמינותו clonogenic (3 מבחנות עבור פקדים, 3 מבחנות עבור פקדים שלילי תרביות תאים, 3 מבחנות עבור ג'ין-יעד תרביות תאים).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תרביות תאים הפוכה
	<ol>
<li>הכן ג'ין-מטרה ושלילי שליטה מיקס תרביות תאים עבור כל הבקבוק2 ס מ T25 כדלקמן.<ol>
<li>לדלל µL 12.5 כל פילוח ג'ין oligonucleotides siRNA או שליטה שלילי oligonucleotides siRNA במדיום תרביות תאים חיוניים מינימלי (יחס 1:55; ראה טבלה של חומרים).</li>
			<li>הוספת ריאגנט תרביות תאים ליפוזום cationic (יחס 1:1 עם פילוח ג'ין oligonucleotides siRNA; ראה טבלה של חומרים). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. הערה: הנפח הכולל של המיקס תרביות תאים הוא 700 µL.</li>
			<li>להוסיף 700 µL של תרביות תאים לערבב את הבקבוק2 ס מ לכל T25. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 ימים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ודא ג'ין דפיקה למטה על-ידי ה-RT-PCR וניתוח תספיג חלבון. בדוק היטב את השפעת בשם R-גן הדפיקה למטה על שחזור רגישות לסוכן טיפולי ממוקד באמצעות ניסויים היווצרות המושבה (חזור על שלב 1.5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gerber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapies%3A+a+new+generation+of+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Targeted therapies: a new generation of cancer treatments.</a> Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).</li>
<li>Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+with+small+molecule+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors.</a> Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).</li>
<li>Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+human+monoclonal+antibody+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Development trends for human monoclonal antibody therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).</li>
<li>Chabner, B. A., Roberts, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timeline%3A+Chemotherapy+and+the+war+on+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Timeline: Chemotherapy and the war on cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).</li>
<li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+resistance%3A+surviving+stressful+situations%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations.</a> Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).</li>
<li>Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics%2C+clinical+indications%2C+and+resistance+mechanisms+in+molecular+targeted+therapies+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer.</a> Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).</li>
<li>Ellis, L. M., Hicklin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+Targeted+Therapies%3A+Refining+Anticancer+Therapy+in+the+Era+of+Molecular+Oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology.</a> Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).</li>
<li>Asić, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+mechanisms+of+primary+resistance+differ+from+dominant+mechanisms+of+secondary+resistance+to+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).</li>
<li>Arienti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evidence+of+multiple+mechanisms+underlying+trastuzumab+resistance+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer.</a> Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).</li>
<li>Tanner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+HER-2+in+gastric+carcinoma%3A+association+with+Topoisomerase+IIalpha+gene+amplification%2C+intestinal+type%2C+poor+prognosis+and+sensitivity+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab.</a> Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).</li>
<li>Bang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+in+combination+with+chemotherapy+versus+chemotherapy+alone+for+treatment+of+HER2-positive+advanced+gastric+or+gastro-oesophageal+junction+cancer+%28ToGA%29%3A+a+phase+3%2C+open-label%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial.</a> Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337">http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773">http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029">http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390">http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390</a> (2017).</li>
<li>Shimoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+trastuzumab+and+lapatinib+inefficiency+in+gastric+cancer%3A+Future+steps+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review).</a> Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).</li>
<li>Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+and+therapeutics+of+HER2-positive+gastric+cancer-from+trastuzumab+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastrointest+Oncol%22%5BJournal%5D)">The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond.</a> J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).</li>
<li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+landscape+and+genetic+heterogeneity+in+gastric+adenocarcinoma+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing.</a> Nat Commun. 5, 5477(2014).</li>
<li>Oshima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+sensitivities+of+two+novel+trastuzumab-resistant+HER2+gene-amplified+gastric+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines.</a> Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).</li>
<li>Pignatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exposure+to+%28R%29-bicalutamide+generates+a+LNCaP+subclone+with+alteration+of+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome.</a> Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בעוד אישית ממוקדת טיפולים יש elicited ההתלהבות גוברת, אלה טיפולים "חכם" כביכול עם הפנים את המשוכה הגדולות באותה תרופות כימותרפיות המסורתי, כלומר, רכישת תרופתיים מהירה ובלתי צפויים. כדי לשפר את התוצאות של טיפול ממוקד, צריך יהיה לפתור בעיות תרופתיים דרך הבנה טובה יותר של המנגנונים שגורמים להם. כאן, הצגנו מתודולוגיה נגישים נרחב במבחנה כדי לחקור את מנגנוני ההתנגדות רכשה לסמים טיפול ממוקד במודלים קו תאי סרטן.
הדור של יישוב subclones עמידים לטיפול הוא הכי קריטי, קשה לתקנן בשלב של פ...

עוקב אחרי התגליות מכריע בביולוגיה מולקולרית, תאית, מספר מולקולות נגד סרטן מסונתז הרומן פותחו באופן סלקטיבי היעד oncogenic איתות המסלולים במגוון רחב של סוגי גידולים. בפרט, שתי קטגוריות של יישוב סוכני טיפולית עם מאפיינים ייחודיים באונקולוגיה, תרכובות כימיות כלומר סינתטי של נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטי, ידועים השיגו הצלחות קליני וטיפול בסרטן שינו באופן דרמטי העשורים האחרונים1,2,3.
ובכל זאת, למרות התגובה הראשונית שלהם מרשים לטיפול, הרוב המכריע של חולי סרטן פיתחו עמידות לתרופות לכל הסוכנים טיפולית יישוב, נוגדנים חד-שבטיים והן מעכבי קינאז. כתוצאה מכך, תרופתיים, המשוכה העיקריים תרופות נגד סרטן קלאסי4, הוא עדיין אתגר גדול עבור טיפולים ממוקדים המתעוררים5,6.
עמידות לטיפול ממוקד עשוי להיות מהותי (קרי, ראשי) או רכשה (קרי, משני). התנגדות פנימית מתאר דה נובו חוסר תגובה לטיפול, בעוד התנגדות משני מתרחשת לאחר תקופת בתגובה סמים טיפול7. האחרון הוא הנגרמת על ידי התפרצויות של גדודים קטן של תאים סרטניים בתוך עיקר הגידול פרימיטיבי או בנויים דיסטלי נישות אנטומי נסתר, מפגין עד 90% עמידות לתרופה אחת או יותר ממוקד סוכני טיפולית. המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח עמידות לטיפול ממוקד בעיקר תוצאה של מוטציות היעד והפעלה מיותר של אחרים פרו-הישרדות איתות המסלולים, ההבנה של מי הוא עדיין רחוק מלהיות שלם8.
בעבודה זאת, הצענו זמן cost effective בגישה לחקור מנגנונים במבחנה של ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, החל מהדור של subclones הסלולר עמידים לתרופות על תיאור של שתיקת הליכים המשמשים עבור שחזור הרגישות לחומר המדכא, כלי חיוני המשמש עבור בדיקה ואימות של בהנחות עבודה. בפרט, הגישה שלנו שימש לחקור, סרטן קיבה, מנגנוני ההתנגדות הרצפטין (למשל, הרצפטין), מואנשים חד-שבטיים מיקוד המחשבים חוץ-תאי של החלבון HER29. הרצפטין + כימותרפיה מקובל כטיפול רגיל קו ראשון לסרטן שד גרורתי HER2 חיובי. בזכות מחקרים פרה מציג את האנטי-HER2 טיפולים יש פעילות משמעותית בשני במבחנה , ויוו HER2 חיובי סרטן קיבה מודלים10,11, היה מולקולרית שהתרופות המתוות HER2 בחן בהרחבה בניסויים קליניים, חלקם עדיין בעיצומה, על חולים עם גסטרו סרטן12,13,14,15.
מחקרים אלה הדגישו את המספר העולה מהמטופלים חווים התנגדות הרצפטין16, בדומה אל תצפית על מעכבי טיפולית יישוב אחרים. בפרט, קצב התגובה של הרצפטין היה 47%, חציון ההישרדות הכוללת של חולים על הרצפטין + כימותרפיה היה ארוך יותר לחולים על כימותרפיה לבד172.7 חודשים בלבד. זה הציע כי בעוד הרצפטין העיקרי ההתנגדות היא שכיחה, הרצפטין משני ההתנגדות היא בלתי נמנעת. מסיבה זו, יש צורך דחוף כדי להבהיר את מנגנוני גרימת טיפול ממוקד-HER2 עמידות סרטן קיבה, אשר הוא בעייתי עוד יותר בהתחשב הטרוגניות גנטית אינטרה-tumoral את זה neoplasia18.
בנוסף, מנגנוני עמידות הרצפטין בסרטן קיבה הוכיחו מאתגר להסביר, חלקית עקב הקושי בהשגת במודלים פרה אמין נציג של מצב זה. אושימה. et al. דיווח על שיטת הבחירה ויוו של שורות תאים עמידים הרצפטין סרטן קיבה, המורכב תרבות חוזרות ונשנות של גרורות קטנות הצפק שיורית לאחר הטיפול עם הרצפטין19. עם זאת, הצורך של זיווד, ההתמחות לטיפול בבעלי חיים ספציפיים ועל האישור של ועדת האתיקה חיה תרמו הפיכתה לפעולת לצרוך זמן עלות. הגישה שנתאר בעבודה זו פשוט וקל החלים נרחב, אפשרות להאריך בקלות לחקור את מנגנוני ההתנגדות לסמים אחרים טיפולית גידול שונים histotypes20.

<table><tbody><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>TRIzol Reagent הוא ריאגנט לבידוד RNA כולל באיכות גבוהה או בו זמנית לבידוד RNA, DNA וחלבון ממגוון דגימות ביולוגיות</td></tr><tr><td>ערכת סינתזה ISCRIPT CDNA</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>ערכת סינתזת cDNA iScript היא ערכת סינתזת cDNA רגישה וקלה לשימוש לניתוח ביטוי גנים באמצעות qPCR בזמן אמת.</td></tr><tr><td>בדיקת ביטוי גנים של TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>4331182</td><td>Applied Biosystems מבחני ביטוי גנים של TaqMan מורכבים מזוג פריימרים PCR ללא תווית ובדיקה של TaqMan עם תווית צבע FAM או VIC של Applied Biosystems בקצה 5' וקלסר חריץ מינורי (MGB) ומרווה לא פלואורסצנטי (NFQ) בקצה 3'.</td></tr><tr><td>מגיב מיצוי חלבון יונקים M-PER</td><td>Thermo Scientific</td><td>78501</td><td>Thermo Scientific M-PER מגיב מיצוי חלבון יונקים נועד לספק מיצוי חלבון מסיס כולל יעיל ביותר מתאי יונקים מתורבתים.</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב עצירת פרוטאז ופוספטאז (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td>קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז תרמו סיינטיפיק (100X) מספק את הנוחות של פתרון יחיד עם הגנה מלאה על דגימות חלבון עבור ליזטים של תאים ורקמות.</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>ערכת בדיקת החלבון Thermo Scientific Pierce BCA היא ריאגנט בדיקה דו-רכיבי, דיוק גבוה ותואם לחומרי ניקוי שנקבע למדידת ריכוז החלבון הכולל (A562nm) בהשוואה לתקן חלבון.</td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td>השתמש ב-4x Laemmli Sample Buffer להכנת דגימות עבור SDS PAGE. להפחתת דגימות, הוסף חומר הפחתה כגון 2-מרקפטואתנול למאגר לפני הערבוב עם הדגימה.</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% ג'ל חלבון טרומי Mini-PROTEAN TGX</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1094</td><td>ג'ל TGX (Tris-Glycine eXtended) בעל אורך חיים ארוך יש נוסחה חדשה וניתן להשתמש בהם הן להפרדות חלבון דנטורציה סטנדרטיות והן לאלקטרופורזה טבעית.</td></tr><tr><td>תקני Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610376</td><td>Precision Plus Protein Prestained זמינים בפורמטים Dual Color, All Blue, Kaleidoscope ו-Dual Xtra. לכל הארבעה יש את אותם דפוסי נדידת ג'ל, עם 3 רצועות ייחוס בעוצמה גבוהה (25, 50 ו-75 kD).</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>10x Tris/glycine/SDS הוא חוצץ רץ מעורבב מראש להפרדת דגימות חלבון על ידי SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>חבילות העברה של Trans-Blot Turbo Mini PVDF חבילות העברה</td><td>של Bio-Rad</td><td>1704156</td><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF להעברה מהירה ויעילה של חלבונים ממיני ג'לים באמצעות מערכת Trans-Blot Turbo Transfer System. כל חבילת העברה אטומה בוואקום ומוכנה לשימוש מכילה שתי ערימות מאגר יונים רוויות חוצץ וממברנת PVDF רטובה מראש.</td></tr><tr><td>חלבון מדויק StrepTactin-HRP מצומד</td><td>Bio-Rad</td><td>1610381</td><td>StrepTactin-חזרת פרוקסידאז (HRP) מצומד לזיהוי כימילומינסנט או קולורימטרי של תקני חלבון לא מוכתמים של Precision Plus Protein או Precision Plus Protein WesternC Standards על כתמים מערביים.</td></tr><tr><td>תמיסת Immun-Star WesternC</td><td>Bio-Rad</td><td>5572</td><td>Immun-Star WesternC, שיטה לזיהוי חלבונים, מזהה כמויות חלבון באמצע הפמטוגרמה.</td></tr><tr><td>ל-Invitrogen</td><td>12935300</td> ל-siRNA <td>בקרה שלילית בקרה</td><td>שלילית אין דמיון משמעותי ברצף לרצפי גנים של עכבר, חולדה או אדם. הבקרה נבדקה גם במסכים מבוססי תאים והוכחה כחסרת השפעה משמעותית על התפשטות התאים, כדאיות או מורפולוגיה.</td></tr><tr><td>opti-MEM Glutamax Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985026</td><td>Opti-MEM Medium הוא מדיום חיוני מינימלי (MEM) משופר המאפשר הפחתה של תוספי סרום בקר עוברי ב-50% לפחות ללא שינוי בקצב הגדילה או במורפולוגיה.</td></tr><tr><td>משתיק קול בחר מעוצב מראש & הפרעות 4390824 RNA (RNAi) מאומתות של siRNA</td><td>Ambion</td><td></td><td>(RNAi) היא הדרך הטובה ביותר להפיל ביעילות את ביטוי הגנים כדי לחקור את תפקוד החלבון במגוון רחב של סוגי תאים.</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>13778075</td><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent מציע פתרון מתקדם ויעיל להעברת siRNA. אף מגיב טרנספקציה ספציפי אחר ל-siRNA אינו מספק אספקת siRNA קלה ויעילה כל כך במגוון רחב של קווי תאים, כולל סוגי תאים נפוצים, תאי גזע ותאים ראשוניים, כמו גם סוגי תאים קשים להעברה באופן מסורתי.</td></tr><tr><td>עכבר anti-IQGAP1</td><td>Invitrigen</td><td>33-8900</td><td>ריכוז עבודה: 1:400 בתמיסת חלב 5%</td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG-HRP: sc-2005</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>ריכוז עבודה: 1:10000 בתמיסת חלב 5%</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P 7626</td><td>זהו מעכב של פרוטאזות סרין ואצטילכולין אסטראז</td></tr><tr><td>תרמו-ציקלר למחקר RT-PCR</td><td>MJ מחקר</td><td>MJ PTC-200 Thermal Cycler</td><td>הוא מאפשר הומוגניות טמפרטורה ומהירות הגברה של עד 3&deg; ג/שנייה ניתן לבצע את הפרוטוקול גם עם מחזורים תרמיים אחרים</td></tr><tr><td>מכשיר RT-PCR בזמן אמת</td><td>מערכת Applied Biosystems</td><td>7500 RT-PCR זוהי</td><td>פלטפורמה בעלת חמישה צבעים המשתמשת בריאגנטים של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוססי פלואורסצנציה כדי לספק כימות יחסי באמצעות סוג בדיקה השוואתי CT. ניתן לבצע את הפרוטוקול גם עם מחזורים תרמיים אחרים</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטרים Microvolume Thermo</td><td>Scientific</td><td>Nanodrop</td><td>הוא מספק מדידת גרעין חומצה מדויקת ומהירה תוך שימוש בנפח קטן של מערכת ספיגת הדגימה</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>Trans-Blot Turbo מערכת הוא</td><td>מבצע העברה יבשה תוך מספר דקות</td></tr><tr><td>מערכת רכישת תמונה ותיעוד ג'ל</td> תמונת <td>Bio-Rad</td><td>Chemidoc מערכת</td><td>קל לשימוש לזיהוי כימילומינסנט</td></tr></tbody></table>

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

בעשרים השנים האחרונות ראינו משמרת של תרופות ציטוטוקסיות לטיפול ממוקד לאונקולוגיה רפואית. למרות יישוב סוכני טיפולית הראו יעילות קלינית מרשים יותר תופעות לוואי ממוזער טיפולים מסורתיים, תרופתיים הפך המגבלה העיקרית היתרונות שלהם. מספר מודלים פרה/במבחנה/ויוו של ההתנגדות רכשה סוכני ממוקד בטיפול קליני פותחו בעיקר באמצעות שתי אסטרטגיות: מניפולציה גנטית i) להכנת דגמים אחרים של ההתנגדות רכשה, ii) במבחנה / אין ויוו מבחר דגמים עמיד. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מציעים מסגרת המאחד, על חקירת המנגנון הבסיסי אחראי על ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, החל מהדור של subclones הסלולר עמידים לתרופות על תיאור של להשתיק הליכים המשמשים עבור שחזור הרגישות לחומר המדכא. פשוט הזמן cost effective בגישה זו הוא החלים נרחב, אפשרות להאריך בקלות לחקור את מנגנוני ההתנגדות לסמים אחרים טיפולית יישוב בגידול שונים histotypes.

איור 1 מתווה במסגרת ההליך ניסיוני. שלושה סרטן קיבה-שורות תאים המבטאים רמה גבוהה של HER2, רגישות הרצפטין (IC50 &lt; שיא רמת הפלסמה של התרופה, 2A איור, גרף השמאלי) גדלו במדיום תרבות המכיל את הסוכן טיפולית יישוב. מנה 10-fold נמוכים מריכוז הפלסמה שיא של הרצפטין (10 µg/mL) היה לקבוע את המינון ההתחלתי, בהדרגה ל 400 µg/mL על פני תקופה של 8-12 חודשים. לאחר מכן, השגנו שלוש subclones מאופיין הפנוטיפ ההתנגדות יציב עם IC50</s...

זהו פרוטוקול זמן cost effective במבחנה חוקרים על מנגנוני ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, ובגלל זה צורך רפואי קליניות מאוד בניהול סרטן.

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

המטרה הכוללת של פלטפורמה פרה-קלינית זו היא לספק הליך סטנדרטי לזיהוי ואפיון המנגנונים המניעים עמידות נרכשת לטיפולים ממוקדים. שיטה זו יכולה לעזור ליישם את ההנעה הגנומית באונקולוגיה, בפרט, לענות על שאלות מפתח לגבי הטרוגניות הגידול והמנגנונים המרובים האחראים לעמידות נרכשת לטיפול ממוקד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הגישה החסכונית בזמן ובעלות-תועלת המאפשרת חקירה חוץ גופית של מנגנוני עמידות לטיפול ממוקד.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסרטן, שכן עמידות הריאות עדיין מאתגרת עבור טיפולים ממוקדים מתפתחים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המנגנון המעורב בעמידות לטיפול ממוקד, אך ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור את יעילותם של תרופות כימותרפיות קונבנציונליות. בדרך כלל, מפעילים המשתמשים בשיטה זו יתנדנדו עם דור של תת-שיבוטים עמידים לתרופות, הצעד הקשה ביותר לסטנדרטיזציה.הגה לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר אפיינו את המנגנון העמיד הנרכש לטרסטוזומאב בשורות תאי סרטן קיבה חיוביים ל-HER. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שיש צורך במספר טכניקות ליצירה ואימות של מודלים עמידים לתרופות במבחנה, כולל שחזור הרגישות על ידי הפלת גנים. כדי להתחיל בהליך זה, זרעו תאי NCI N87 לתוך צלוחיות תרבית של 25 סנטימטר רבוע.הוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר טרסטוזומאב למדיום התרבית בכל בקבוק. חשוף את התאים למינון התחלתי זה עד שהם חוזרים לגדול. לאחר חידוש צמיחת התאים תוך כשבועיים, חשוף את התאים למינון ריכוז של מאה מיקרוגרם למיליליטר של טרסטוזומאב.המשיכו להגדיל בהדרגה את ריכוז הטרסטוזומאב בהמתנה עד שהתאים יחזרו לצמוח לפני כל חשיפה, עד להגעה לריכוז של 400 מיקרוגרם למיליליטר. קו תאים עשוי להפגין רגישות שונה לתרופות שונות. פתרון אחד לבעיה זו הוא לחשוף את התאים למינונים הולכים וגדלים של תרופות, החל ממינון בערך פי עשרה מהשעה שבה ריכוז השיא של הפלזמה ועד שהתאים ממשיכים לגדול.לאחר מכן, תאי זרעים ל -24 צלחות תרבית מרובות בארות. לחשוף את התאים הזרעים להגדלת ריכוזי מעכבי הטיפול מ-100 מיקרוגרם למיליליטר ל-400 מיקרוגרם למיליליטר. דגירה בחממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 יום.לאחר מכן, הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS-1X. הסר את ה- PBS-1X והוסף בין שניים לשלושה מיליליטר של תמיסת קיבוע. לאחר 20 דקות, הסר את תמיסת הקיבוע והוסף שני מיליליטר של תמיסת סגול קריסטל 0.5% לכל באר.דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי לשאוב בזהירות את תמיסת הסגול הקריסטלית. טבלו את הצלחות במי ברז כדי לשטוף את כל השאריות שנותרו.יבש באוויר בטמפרטורת החדר עד יומיים. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הפוך בהגדלה פי 4 כדי לספור מושבות המכילות יותר מ-50 תאים. חשב את יחס ההתנגדות היחסית IC50 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כדי להתחיל, הכן תרחיף של תא בודד על ידי טריפסיניזציה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בעזרת המוציטומטר וצביעה כחולה של טריפאן, ספרו את התאים. לאחר מכן, זרעו 2.5 פעמים 10 עד חמישה תאים על בקבוק T-25 עבור כל מצב.לאחר מכן, יש לדלל 12.5 מיקרוליטר מכל אוליגונוקלאוטיד siRNA המכוון לגן או בקרה שלילית siRNA oligonucleotide במדיום טרנספקציה חיוני מינימלי. הוסף מגיב טרנספקציה ליפוזום קטיוני ביחס של 1:1 עם האוליגונוקלאוטידים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.לאחר מכן, הוסף 700 מיקרוליטר מתערובת הטרנספקציה לכל בקבוק T-25. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד שלושה ימים. השתמש בניתוח RT-PCR ו-Western Blot כדי לאמת הפלת גנים.לאחר מכן, תאי זרעים ל -24 צלחות תרבית מרובות בארות. לחשוף את התאים לריכוזים הולכים וגדלים של מעכב טיפול מטרה מ-100 מיקרוגרם למיליליטר ל-400 מיקרוגרם למיליליטר. לצורך היעילות של הפלת גנים, אוליגונוקלאוטידים של siRNA חייבים להיות ספציפיים להפחתת ביטוי המטרה.כלים מתוכננים והמדד של siRNA היה אותו גן מטרה שימושיים למטרה זו. דגירה בחממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 יום. הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS-1X.לאחר הסרת ה- PBS, הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של תמיסת קיבוע. לאחר מכן, הסר את תמיסת הקיבוע והוסף תמיסת סגול קריסטל של 0.5%. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.בעזרת פיפטה, שאפו בזהירות את תמיסת הקריסטל הסגולה. לאחר מכן, טבלו את הצלחות במי ברז. יבש באוויר בטמפרטורת החדר עד יומיים.לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הפוך בהגדלה פי 4 כדי לספור את המושבות המכילות יותר מ-50 תאים. במחקר זה, שלושה קווי תאי סרטן קיבה המבטאים רמה גבוהה של HER2 ורגישים לטרסטוזומאב גדלים במדיום תרבית המכיל את החומרים הטיפוליים הממוקדים. מכאן מתקבלים שלושה תת-שיבוטים המאופיינים בפנוטיפ עמיד יציב.מבין תת-השיבוטים, HR NCI N87 נראה כעמיד ביותר ומגיע להתנגדות יחסית IC50 של 28.57. ניתוח ביטוי חלבונים וגנים תומך בהשערה כי הגן IQGAP1 ממלא תפקיד מרכזי בפנוטיפ ההתנגדות של תת-קו HR NCI N87. כפי שמוצג כאן, רמת החלבון IQGAP1 היא פי חמישה בתת-השיבוט העמיד מאשר בתאי ההורים.וביטוי הגן IQGAP1 הוא פי 2.5 בתת-השורה HR NCI N87 מאשר בתת-השיבוט המקורי. לאחר מכן מבוצעת השתקת גן IQGAP1 כדי להעריך את תפקידו בהתפתחות פנוטיפ העמידות לטרסטוזומאב. בדיקה קלונוגנית מאשרת עוד יותר את ההשערה לגבי חשיבותו של IQGAP.כפי שניתן לראות כאן, השתקת הגנים משחזרת את רגישות התא לטרסטוזומאב, ומורידה את ערך ה-IC50 לשבעה מיקרוגרם למיליליטר. מה שאני חושב על הליך זה חשוב לזכור שבדרך כלל לא קל להשיג תת-שיבוטים של תאים עמידים לתרופות. וכי שיטה זו טומנת בחובה סיכון פוטנציאלי לכישלון.באמצעות הליך זה ניתן להשיג מספר תאים של שיבוטים המאופיינים במנגנונים שונים המניעים עמידות נרכשת לטיפולי מטרה. פיתוח נוהל סטנדרטי למידול מבחנה של עמידות לטיפול מטרה אמור לאפשר לחוקר אונקולוגי לחקור מטרה חדשה המופעלת על ידי תרופות כדי להתגבר על עמידות לתרופות שהיא הביקורת הגדולה ביותר על טיפולי הדור האחרון.

looking-for-driver-pathways-acquired-resistance-to-targeted-therapy

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

עמידות לתרופות לטיפולים ממוקדים היא נרחבת והצורך לזהות מנגנונים של התנגדות - לפני או אחרי הופעה קלינית - היא קריטי להדרכת אסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגזירה כמה קווים עמידים לתרופות במבחנה עם רצף לזרז גילוי המנגנונים אלה.

הטמעה של<em&gt; במבחנה</em&gt; תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

כאן נתאר פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לחשוף את מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic, במיוחד rhabodvirus וטיפול וירוס vaccinia, אבל ניתן בקלות להתאים oncolytic אחרים וירוס פלטפורמות או לגילוי גנים המארח לווסת את שכפול וירוס בדרך כלל.

ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס

כאן, אנו מתארים את פרוטוקולי האימות גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 כמטרה סמים בלוקמיה באמצעות העכבר גנטי, humanized במבחנה ויוו מודלים. בשיטה זו ניתן ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

הקמת קו יציב תא overexpressing הגן עניין ללמוד פונקציה ג'ין יכול להיעשות על ידי שיבוטים יחיד יציב של חיטוט תרביות תאים לאחר transfecting אותם באמצעות retroviral זיהום. הנה אנחנו מראים כי HT29-DR3 שורות תאים שנוצרו בדרך זו להבהיר את מנגנוני מוות איזה קולטן 3 (DR3) תורמת antimitotics-induced אפופטוזיס.

הקמת שורות תאים Overexpressing DR3 כדי להעריך את התגובה אפופטוטיים להיפגע הרפוי אנטי-mitotic

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדוק את היעילות של טיפולים ייעודיים שנבחרו על בסיס האיפור גנומית של הגידול. הפרוטוקול מתאר זיהוי ואימות של הסדרים מבניים של ה-DNA, חרט גידולים של חולים לתוך עכברים והתגובות בדיקה לתרופות המתאימות.

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לגלות את הגנים המובעות יתר שמירה על התאים הקבועים גזע הסרטן נגזר מתאי HT29 המעי הגס. RNAseq עם ביואינפורמטיקה זמין בוצע כדי לחקור והמסך רשתות ביטוי גנים להבהיר מנגנון פוטנציאלי מעורב בהישרדות של תאים סרטניים ממוקד.

גילוי של גנים הנהג ב המעי הגס HT29-נגזר סרטן גזע כמו Tumorspheres

פרוטוקול זה מתאר הערכה מתוקננת של רגישויות לתרופות למעכבי איתות ממוקדים במודלים אורגנויד שמקורם בחולה NSCLC.

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

בדיקת הפרעות RNA בתפוקה גבוהה (RNAi) באמצעות מאגר של shRNA לנטי-ויראליים יכולה להיות כלי לאיתור מטרות קטלניות סינתטיות רלוונטיות מבחינה טיפולית בממאירות. אנו מספקים גישת סינון shRNA משולבת כדי לחקור את האפקטים האפיגנטיים בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML).

הקרנה משולבת של ספריית shRNA לזיהוי גורמים המווסתים פנוטיפ עמידות לתרופות

פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

חקור מנגנוני עמידות מושגת לטיפולים ממוקדים בסרטן באמצעות שיטת in vitro ליצירת תת-שיבטים עמידים לתרופות. שיטה זו מאפשרת זיהוי מנגנוני עמידות ושחזור רגישות על ידי השתקת גנים.

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

גלה סרטונים נוספים