מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

המטרה הכוללת של פלטפורמה פרה-קלינית זו היא לספק הליך סטנדרטי לזיהוי ואפיון המנגנונים המניעים עמידות נרכשת לטיפולים ממוקדים. שיטה זו יכולה לעזור ליישם את ההנעה הגנומית באונקולוגיה, בפרט, לענות על שאלות מפתח לגבי הטרוגניות הגידול והמנגנונים המרובים האחראים לעמידות נרכשת לטיפול ממוקד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הגישה החסכונית בזמן ובעלות-תועלת המאפשרת חקירה חוץ גופית של מנגנוני עמידות לטיפול ממוקד.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסרטן, שכן עמידות הריאות עדיין מאתגרת עבור טיפולים ממוקדים מתפתחים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המנגנון המעורב בעמידות לטיפול ממוקד, אך ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור את יעילותם של תרופות כימותרפיות קונבנציונליות. בדרך כלל, מפעילים המשתמשים בשיטה זו יתנדנדו עם דור של תת-שיבוטים עמידים לתרופות, הצעד הקשה ביותר לסטנדרטיזציה.

הגה לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר אפיינו את המנגנון העמיד הנרכש לטרסטוזומאב בשורות תאי סרטן קיבה חיוביים ל-HER. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שיש צורך במספר טכניקות ליצירה ואימות של מודלים עמידים לתרופות במבחנה, כולל שחזור הרגישות על ידי הפלת גנים. כדי להתחיל בהליך זה, זרעו תאי NCI N87 לתוך צלוחיות תרבית של 25 סנטימטר רבוע.

הוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר טרסטוזומאב למדיום התרבית בכל בקבוק. חשוף את התאים למינון התחלתי זה עד שהם חוזרים לגדול. לאחר חידוש צמיחת התאים תוך כשבועיים, חשוף את התאים למינון ריכוז של מאה מיקרוגרם למיליליטר של טרסטוזומאב.

המשיכו להגדיל בהדרגה את ריכוז הטרסטוזומאב בהמתנה עד שהתאים יחזרו לצמוח לפני כל חשיפה, עד להגעה לריכוז של 400 מיקרוגרם למיליליטר. קו תאים עשוי להפגין רגישות שונה לתרופות שונות. פתרון אחד לבעיה זו הוא לחשוף את התאים למינונים הולכים וגדלים של תרופות, החל ממינון בערך פי עשרה מהשעה שבה ריכוז השיא של הפלזמה ועד שהתאים ממשיכים לגדול.

לאחר מכן, תאי זרעים ל -24 צלחות תרבית מרובות בארות. לחשוף את התאים הזרעים להגדלת ריכוזי מעכבי הטיפול מ-100 מיקרוגרם למיליליטר ל-400 מיקרוגרם למיליליטר. דגירה בחממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 יום.

לאחר מכן, הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS-1X. הסר את ה- PBS-1X והוסף בין שניים לשלושה מיליליטר של תמיסת קיבוע. לאחר 20 דקות, הסר את תמיסת הקיבוע והוסף שני מיליליטר של תמיסת סגול קריסטל 0.5% לכל באר.

דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי לשאוב בזהירות את תמיסת הסגול הקריסטלית. טבלו את הצלחות במי ברז כדי לשטוף את כל השאריות שנותרו.

יבש באוויר בטמפרטורת החדר עד יומיים. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הפוך בהגדלה פי 4 כדי לספור מושבות המכילות יותר מ-50 תאים. חשב את יחס ההתנגדות היחסית IC50 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי להתחיל, הכן תרחיף של תא בודד על ידי טריפסיניזציה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בעזרת המוציטומטר וצביעה כחולה של טריפאן, ספרו את התאים. לאחר מכן, זרעו 2.5 פעמים 10 עד חמישה תאים על בקבוק T-25 עבור כל מצב.

לאחר מכן, יש לדלל 12.5 מיקרוליטר מכל אוליגונוקלאוטיד siRNA המכוון לגן או בקרה שלילית siRNA oligonucleotide במדיום טרנספקציה חיוני מינימלי. הוסף מגיב טרנספקציה ליפוזום קטיוני ביחס של 1:1 עם האוליגונוקלאוטידים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

לאחר מכן, הוסף 700 מיקרוליטר מתערובת הטרנספקציה לכל בקבוק T-25. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד שלושה ימים. השתמש בניתוח RT-PCR ו-Western Blot כדי לאמת הפלת גנים.

לאחר מכן, תאי זרעים ל -24 צלחות תרבית מרובות בארות. לחשוף את התאים לריכוזים הולכים וגדלים של מעכב טיפול מטרה מ-100 מיקרוגרם למיליליטר ל-400 מיקרוגרם למיליליטר. לצורך היעילות של הפלת גנים, אוליגונוקלאוטידים של siRNA חייבים להיות ספציפיים להפחתת ביטוי המטרה.

כלים מתוכננים והמדד של siRNA היה אותו גן מטרה שימושיים למטרה זו. דגירה בחממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 יום. הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS-1X.

לאחר הסרת ה- PBS, הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של תמיסת קיבוע. לאחר מכן, הסר את תמיסת הקיבוע והוסף תמיסת סגול קריסטל של 0.5%. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

בעזרת פיפטה, שאפו בזהירות את תמיסת הקריסטל הסגולה. לאחר מכן, טבלו את הצלחות במי ברז. יבש באוויר בטמפרטורת החדר עד יומיים.

לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הפוך בהגדלה פי 4 כדי לספור את המושבות המכילות יותר מ-50 תאים. במחקר זה, שלושה קווי תאי סרטן קיבה המבטאים רמה גבוהה של HER2 ורגישים לטרסטוזומאב גדלים במדיום תרבית המכיל את החומרים הטיפוליים הממוקדים. מכאן מתקבלים שלושה תת-שיבוטים המאופיינים בפנוטיפ עמיד יציב.

מבין תת-השיבוטים, HR NCI N87 נראה כעמיד ביותר ומגיע להתנגדות יחסית IC50 של 28.57. ניתוח ביטוי חלבונים וגנים תומך בהשערה כי הגן IQGAP1 ממלא תפקיד מרכזי בפנוטיפ ההתנגדות של תת-קו HR NCI N87. כפי שמוצג כאן, רמת החלבון IQGAP1 היא פי חמישה בתת-השיבוט העמיד מאשר בתאי ההורים.

וביטוי הגן IQGAP1 הוא פי 2.5 בתת-השורה HR NCI N87 מאשר בתת-השיבוט המקורי. לאחר מכן מבוצעת השתקת גן IQGAP1 כדי להעריך את תפקידו בהתפתחות פנוטיפ העמידות לטרסטוזומאב. בדיקה קלונוגנית מאשרת עוד יותר את ההשערה לגבי חשיבותו של IQGAP.

כפי שניתן לראות כאן, השתקת הגנים משחזרת את רגישות התא לטרסטוזומאב, ומורידה את ערך ה-IC50 לשבעה מיקרוגרם למיליליטר. מה שאני חושב על הליך זה חשוב לזכור שבדרך כלל לא קל להשיג תת-שיבוטים של תאים עמידים לתרופות. וכי שיטה זו טומנת בחובה סיכון פוטנציאלי לכישלון.

באמצעות הליך זה ניתן להשיג מספר תאים של שיבוטים המאופיינים במנגנונים שונים המניעים עמידות נרכשת לטיפולי מטרה. פיתוח נוהל סטנדרטי למידול מבחנה של עמידות לטיפול מטרה אמור לאפשר לחוקר אונקולוגי לחקור מטרה חדשה המופעלת על ידי תרופות כדי להתגבר על עמידות לתרופות שהיא הביקורת הגדולה ביותר על טיפולי הדור האחרון.