Name: התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: למד לפתח ביוסנסור אלקטרוכימי לזיהוי Vibrio parahaemolyticus באמצעות אלקטרודות פחמן מודפסות וננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר ורגיש של פתוגנים במזון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להכיר את התמיכה של מלזיה Universiti Putra.

הערה: כל ריאגנטים כימי וביוכימי כדי לשמש צריך להיות של כיתה אנליטית, ללא טיהור נוסף. להכין את כל הפתרונות באמצעות מים יונים סטרילי. אוטוקלב כל כלי זכוכית לפני העיקור.
התראה: אנא השתמש כל נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע פעילויות מעבדה, כולל את השימוש הנדסה פקדים (fume הוד, הכפפות), ציוד מגן אישי (בטיחות משקפיים, כפפות, חלוק המעבדה, מכנסיים באורך מלא, סגורות נעלי).
1. ייצור, אפיון של שינוי אלקטרודה באמצעות ה-PLA-AuNPs
<ol><li>
הכנה ואפיון של ה-PLA-AuNPs
	<ol>
<li>להוסיף 10 מ של הפתרון סודיום ציטרט (38.8 מ מ) ל- 100 מ של רותחים chloroauric מימית תמיסה חומצית (1 מ מ) ובמהירות תירגע עד טמפרטורת הסביבה. לבחון את השינויים בצבע בפתרון AuNPs מוכן אשר מתחיל כמו צהוב, שינויים שחור ומסתיים לבסוף כמו אדום רובי כהה.</li>
		<li>מניחים את כדורי ה-PLA תבנית מפלדת לתהליך ההיתוך ומחממים אותם בטמפרטורה של 190 מעלות במשך 10 דקות אחרי ההליך הקשה: שים אותם תחת לחץ של MPa 2.2 עבור 1 דקות כחלק הכנת גיליון ה-PLA. הגיליון PLA יהיה מוכן לשימוש לאחר קירור במשך כ-3 שעות.</li>
		<li>לערבב נמרצות, להמיס 0.68 מ ג של הסדינים PLA ב 5 מ של כלורופורם בטמפרטורת החדר. מערבבים ה-PLA מומס עם 10 מ"ל של הפתרון AuNPs בעבר מוכן ומערבבים homogeneously זה בטמפרטורת החדר. תערובות הומוגנית אז יכול להיות denoted כמו ה-PLA-AuNPs, מאופיין באמצעות UV-Vis, XRD, TEM, ו- FESEM עם EDX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה ואפיון של פחמן המסך המודפס ששונה אלקטרודה הערה: SPCE השתמשו במחקר זה כוללת מערכת 3-אלקטרודה: אלקטרודה מונה אלקטרודה עבודה של פחמן, אלקטרודה הפניה Ag/AgCl.<ol>
<li>במהירות פיפטה 25 µL של פתרון הומוגני של ה-PLA-AuNPs על גבי SPCE ולאחר מכן אוויר יבש זה עבור 24 שעות לפני השימוש.</li>
		<li>Electrochemically לאפיין את האלקטרודות ששונה, SPCE/ה-PLA-AuNPs, בפרו אשלגני (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) כדי למדוד את שטח פעיל, ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימי, הדיר, הפארמצבטית, יציבות30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. פיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA
<ol><li>
בדיקה הכנה הערה: הרצף של בדיקה ssDNA ו- DNA משלימים נבחרו בהתבסס על מידע של המרכז הארצי עבור מסד הנתונים ביוטכנולוגיה מידע (NCBI).<ol>
<li>לרכוש oligonucleotides סינתטי (20-מר ssDNA בדיקה, DNA משלימים 20-mer, 20-מר לא תואמים DNA ו 21-מר-משלימה דנ א) אבקת lyophilized ממעבדות מסחרי, בהתבסס על רצפי הבאים: thiolated ssDNA בדיקה: יונקות - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3′ DNA משלימים: יונקות - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3′ DNA שאינם תואמים אחד-בסיס: יונקות - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3′ 3-בסיס DNA שאינם תואמים: יונקות - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3′ DNA שאינם משלימים: יונקות - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3′</li>
		<li>להכין מלאי פתרונות של כל oligonucleotides (100 מיקרומטר) באמצעות סטרילי טה פתרון (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 7.5), מחולק לחלקים אנליטית. לשמור את זה ב-4 ° C ולאחר מכן בצע את דילולים המתאים רק לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אופטימיזציה של קיבעון של הכלאה הערה: SPCE שופרת PLA-AuNPs, מסומן בתור SPCE/ה-PLA-AuNPs, נעשה שימוש במחקר זה, שיטת הליהוק טיפה שימש כדי להפוך את ה-DNA הנייח הכלאה.<ol>
<li>ראשית, לשתק 25 µL של thiolated ssDNA בדיקה על ה-PLA/SPCE-AuNPs, ואז האוויר יבש זה עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן זה להיות סוף סוף מסומן בתור SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA. לקבוע אופטימיזציה של התנאי הנייח באמצעות שלושה גורמים: הריכוז של ssDNA (החל 0.2 1.4 µM), זמן (החל מ-30 ועד 210 דקות), טמפרטורה (החל מ- 25 ועד 75 ° C).</li>
		<li>פיפטה 25 µL של ה-DNA משלימים על פני השטח של SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA כדי לבצע את האירוע הכלאה לאחר מכן זה יכול להיות סוף סוף מסומן בתור SPCE/ה-PLA-AuNPs/dsDNA. לקבוע אופטימיזציה של התנאי הכלאה באמצעות שני גורמים של זמן (החל מ-5 עד 30 דקות) וטמפרטורה (החל מ- 25 ועד 75 ° C).</li>
		<li>לטבול את קיבוע של אלקטרודות hybridized ב- 20 מיקרומטר MB עבור 30 דקות להסיר את ה-DNA הלא ספציפית הספוחה ו MB עודף על ידי כביסה עם 0.5 M ABS/20 מ מ NaCl (pH 4.5) ולאחר מכן שטיפה בעזרת יונים מים. מדד השיא הנוכחי של הפחתת MB DPV בטכניקה. לבצע את המדידה DPV באמצעות 0.1 M PBS (pH 7) המכיל אין מחוון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אפיון החיישן DNA מפוברק
	<ol>
<li>לטבול את SPCE/ה-PLA-AuNPs ב- 20 מיקרומטר MB במשך 30 דקות, לשטוף עם 0.5 M ABS/20 מ מ NaCl (pH 4.5) ולאחר מכן לשטוף עם מים יונים לפני מדידה. בצע הליך דומה עבור כל האינטראקציות לרבות בדיקת DNA, DNA משלימים, DNA שאינם תואמים, דגימות די אן איי שאינם משלימים.</li>
		<li>למדוד ההפחתה אלקטרוכימי. הערה: מדדנו DPV באמצעות ממשק התוכנה של Autolab מיוצרים באופן מסחרי. המדידות DPV MB להפחתת אלקטרוכימי בנטילת פוטנציאלי ועד-V 0.5 0.25 V, בצעד פוטנציאלי של 0.005 V, אפנון משרעת של 0.05 V, ושיעור סריקה של 7.73 mVs-1 ב- PBS 0.1 M (pH 7), המכיל אין מחוון. סלקטיביות, רגישות, הפארמצבטית, יציבות החום של החיישן DNA מפוברק נחקרו בהמשך. התוצאות המדווחות הוצגו מדידות ערך רשע ב משכפל שלוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. אימות של החיישן מפוברק הדנ א באמצעות דוגמאות אמיתיות
<ol><li>הכנה של זני חיידקים
	<ol>
<li>בחר דגימות בקטריאליות בהתבסס על שלהם זיהום משמעותי של מאכלי ים31,32 . הערה: נ' parahaemolyticus וגם הפניה זנים 8 אחרים זני חיידקים (קמפילובקטר jejuni ליסטריה, סלמונלה typhimurium, סלמונלה דלקת מעיים, דלקת ריאות קלבסיאלה, Escherichia coli O157:H7, Bacillus קובו, ויבריו alginolyticus) של והקאה נפוצות הפתוגן הועסקו לשם אימות ביוסנסור אלקטרוכימי DNA במחקר זה.</li>
		<li>התנהגות שגרתית תת תרבות של זני חיידקים על אגר בהתאמה שלהם כל שבועיים כדי לשמור על יכולת הקיום שלהם, עיין טבלה 1 עבור תנאים תרבות.</li>
		<li>לשמור על שימור לטווח ארוך זני חיידקים ב שלהם broths גדל בהתאמה המכיל 20% (v/v) גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס כפי גליצרול מגן על חיידקים על ידי מניעת היווצרות של גבישי קרח אשר יכולים לגרום להם נזק במהלך תהליך ההקפאה. בשלב הבא, לחסן לולאה של תא החיידק משומרת תרבות במניות גליצרול לתוך broths בהתאמה. דגירה את broths על פי טמפרטורה וזמן צמיחה בהתאמה שלהם בעת הצורך להחיות את החיידקים.</li>
		<li>לקבוע את הכמות נ' parahaemolyticus תאים באמצעות טכניקה של צלחת כפולה33, תקן ושיטה ידועה לספירת מיקרואורגניזמים נגזר סדרת דילולים.<ol>
<li>תרבות נ' parahaemolyticus ב Trypticase סויה מרק (TSB + 3% NaCl) ב 37 מעלות צלזיוס במצב חזק 140-סל ד. לאחר מכן, להעביר 1 מ"ל של התרבות תאי חיידקים לתוך 9 מיליליטר TSB + 3% NaCl להשיג גורם לדילול 10-1 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>חזור על שלב זה תשע פעמים כדי לקבל סדרה מלאה של גורם לדילול-10 עד 10. הבא, התפשטה 0.1 מ"ל של כל גורם לדילול (החל מ 10-1 כדי 10-10) על צלחת אגר סלקטיבי של ויבריו המושבה ספירה, בהתאמה. דגירה הלוחות מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>השתמש מונה המושבה כדי לספור מושבות בודדות, ואז חזרה-לחשב (ספירת הסכום CFU/pipetted x פקטור דילול) כדי לקבל יחידת המושבה יוצרי לאדם צפיפות מיליליטר (מ"ל CFU-1). שואבים את הריכוז של המושבה יוצרי יחידות (CFUs) ב השעיות התא חיידקים מן העלילה כיול של mL CFU-1 נגד ספיגת.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת וזמינותו PCR
	<ol>
<li>תמצית הדנ א בעקבות ששונה מבושלים הליך פירוק34. עם הנץ החמה בקטריאלי בודדים זן במדיה אגר, לחסן אותו בתקשורת מרק, ואחריו המקננת זה על מצבו היחסי צמיחה, סל"ד 140 רועד תנאי.</li>
		<li>Pipette תרבות 1 מ"ל של מרק לתוך שפופרת צנטרפוגה מיקרו. Centrifuge זה-4830-g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה להשיג כדורי. השתמש בערך 500 µL מאגר טה סטרילי re-השעיה עם בגדר. להחזיק ההשעיה וכתוצאה מכך במשך 10 דקות על 98 ± 2 ° C בתוך גוש חימום, מיד תרגעו ב-18 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות lyse התאים ולשחרר את ה-DNA.</li>
		<li>Centrifuge ה-DNA גנומי-4830-g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות לקבל השעיה ברורה ולשמור את תגובת שיקוע ב-20 ° C לשימוש נוסף. השתמש מדידה biophotometer עם הקליטה UV באורך-גל של 260 ננומטר (כמו חומצות גרעין קליטת אורך הגל של אור) וגם ב אורך גל של 280 ננומטר (כמו החלבונים סופגי אורך הגל של אור) כדי לקבוע את הריכוז ואת טוהר חילוץ דנ א גנומי ולאחר מכן לזהות את כל זני באמצעות מבחני הביוכימי רגיל35 ואימות אותם על ידי מטוסי אף-16 rRNA ג'ין רצף36. לבסוף, denature ה-DNA גנומי ב 92 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לצנן את זה במהירות במי קרח לפני היישום החיישן.</li>
		<li>נוסף לאשר הנוכחות נ' parahaemolyticus באמצעות PCR למקד את הגן toxR. ביצוע הליך זה thermocycler באמצעות זוג פריימר (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' ו 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). למטב את הגברה PCR נפח התגובה הכולל של 25 µL המורכב במים סטריליים (15.5 µL), מאגר (5 µL), פריימר (1 µL, 10 מיקרומטר), dNTP מיקס (1 µL), תבנית ה-DNA (2 µL) ו- Taq DNA פולימראז (0.2 µL, 10 x).</li>
		<li>מערבבים את רכיבי היטב, לארגן הגברה PCR של הרצף היעד ב- thermocycler מתוכנת מחזורים של הגברה. במחקר שלנו, בכל מחזור כללה שלושה שלבים תגובות כלומר., דנטורציה הראשונית (94 ° C, 3 דקות) ואחריו 30 מחזורי דנטורציה (94 ° C, 1 דקות), חישול (63 ° C, כ- 1.5 דקות) והסיומת (72 ° C, כ- 1.5 דקות), ואחריו הסיומת הסופי (72 ° C, 7 דקות).</li>
		<li>לקבוע את המוצרים מוגבר, הגדלים שלהם באמצעות אלקטרופורזה על 1.5% agarose ג'ל. ללכוד את התמונות ג'ל עם מערכת ג'ל המיוצר מסחרית-תיעוד.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת דוגמאות פשוט נתעלף
	<ol>
<li>להשיג דגימות טריות. הערה: הלב שלנו טריים (Anadara granosa) היו המתקבל בשוק רטוב Serdang, Selangor, והביא במהירות את המעבדה בתיבת קרח קריר יותר לניתוח. לחלק את הדגימות 2 קבוצות, כלומר קבוצת טיפול ללא טיפול, בהנחה כי הלב נבצרו בצורה אחידה מתחילת הקציר עד הצבתם לתוך אחסון הקרה.</li>
		<li>מראש לטפל הלב בקבוצה שטופלו על ידי אחסונם ב-20 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ואחריו חשיפה לאור UV ב 20 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות לפני מיצוי הדנ א. הערה: את טמפרטורת הקיפאון ואת חשיפה UV המשמש מבוקרת קבוצה או לפחות מגביל את צבירת באופן טבעי נ' parahaemolyticus ב הלב. אל תחיל משטר פסטור גבוה יותר של 70 מעלות צלזיוס כמו מטרת התנאי מבוקרת במחקר זה היא לחקות את המצב בפועל של הלב טריים. בינתיים, לנתח דגימות ישירות מן הקבוצה מטופל ללא כל טיפול קדם ברגע שהם מגיעים במעבדה.</li>
		<li>תת-תרבות זן של נ' parahaemolyticus בקרת האוויר 17802 ב TSB (3% NaCl). לקבוע את רמת התאים קיימא ב inoculum באמצעות ציפוי של דילולים המתאים של TSB (3% NaCl) ב- CA על מנת לקבל את inoculum של 104 CFU מ ל-1 של נ' parahaemolyticus. לשטוף כל אחרים במים מזוקקים, לקרצף אותה ללא לכלוך לפני באמצעות מלקחיים סטרילי זרימה שכבתית בארון כדי להסיר הרקמות הקליפה.</li>
		<li>Homogenize בערך 10 גרם של דגימות רקמה אחרים עם מהמגן ב- 90 מיליליטר TSB סטרילי (3% NaCl) 60 s. הוסף כמות ידועה של נ' parahaemolyticus 9 מ ל ציר מדגם הומוגני על הדגימות מחודדים. השתמש הדגימות unspiked כפקד שלילי. מעריכים את ספירת תאים של נ' parahaemolyticus עלה על הדגימות אחרים על ידי ציפוי 0.1 מ"ל של הדגימות על CA, לאחר מכן, pipetting 1 מ"ל של דגימות לתוך צינור microcentrifuge עבור ה-DNA לטעום החילוץ, כדי לשמש את ביוסנסור ואת וזמינותו PCR.</li>
		<li>תמצית ה-DNA גנומי של נ' parahaemolyticus בין דגימות מחודדים, unspiked בעקבות ששונה מבושלים הליך פירוק36. לבסוף, לקבוע את ריכוז הדנ א ואת טוהר באמצעות מדידה photometer ביו עם הקליטה UV באורך-גל של 260 ננומטר (כמו חומצות גרעין קליטת אורך הגל של אור) וגם ב אורך גל של 280 ננומטר (כמו החלבונים סופגי אורך הגל של אור).</li>
	</ol></li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השלבים הקריטיים במסגרת להתפתחותן של סוג זה של ביוסנסור אלקטרוכימי הם מבחר אלמנטים המתאימים זיהוי ביולוגי המתמר (חומצת גרעין או DNA כאן); הגישה כימיים עבור בניית השכבה חישה של המתמר; התמרה חושית חומר; אופטימיזציה של ה-DNA הנייח, הכלאה; ואימות החיישן מפותחת באמצעות דוגמאות אמיתיות.
ליבה להתפתחות מוצלחת של רגיש, סלקטיבי אלקטרוכימי DNA ביוסנסור, אופטימיזציה של התנאי הנייח של הכלאה. בעבודה זו, השתמשנו MB בתור מורכבים חמצון-חיזור. עקרונות שונים של אינטראקציות MB-DNA: (i) על ידי האינטראקציה אלקטרוסטט...

נושא מרכזי של הדיון הציבורי ומדעיים בשנים האחרונות, הרעלת מזון היא מזוהה בעיקר עם שלושה סוכנים: מיקרואורגניזמים1, כימיקלים2וטפילים3. מזון מזוהם עלול לגרום לתוצאות בריאות רציניות בבני אדם, במיוחד אצל קבוצת סיכון גבוה יותר של אלה עם מערכות החיסון חלשה, נשים בהריון, קשישים, תינוקות, ילדים צעירים4. עם יותר ממיליון מקרים של שלשול אקוטי המתרחשים מדי שנה אצל ילדים מתחת לגיל 5 שנים ב אפריקה, אסיה, אמריקה הלטינית, הרעלת מזון היא מחלה הגלובלית הגדולות5,6 , הקימה ארגון הבריאות העולמי מיקרואורגניזמים כמו התורם החשוב ביותר7. ויבריו parahaemolyticus בולטת בין זנים מידבק ביותר המוכר. בדרך כלל שנמצאו לאורך החוף, estuarine, ימית סביבות8, הוא חיידק גראם שליליים, אשר הופכת לפעילה בסביבות מלח גבוהה, והוא גורם להרעלתו אנושי רציני כאשר אוכלים מבושל כראוי, כושלת או raw ימית מוצרים9. בנוסף, קיימים מצבים רפואיים אצל אנשים מסוימים להפוך אותם נוטה פצע הזיהום זיהום, ספטיסמיה או האוזן הנובעים נ' parahaemolyticus10. הגורמים התקפה אלימה של נ' parahaemolyticus hemolysins נחלקים לשני סוגים אשר לתרום בפתוגנזה המחלה: thermostable המוליזין ישירה (TDH) מקודד על ידי הגנים tdh ולאחר הקשורות TDH המוליזין מקודד על ידי גנים trh11. הקריטריונים התקפה אלימה (גנים tdh ו- trh) של parahaemolyticus (פ') נמצאים בעיקר דגימות קליניות, במקום דגימות סביבתיים.
(פ') parahaemolyticus יש את היכולת לשרוד תחת מגוון רחב של תנאים, להגיב במהירות על שינויים סביבתיים12. מנגנון התפשטות שלה מסלים את פוטנציאל הסיכון שלו ככל שלה רעילות במקביל תא המוני13. חמור מכך, שינוי האקלים מספקת חיידקים אלה בתנאים בשפע כדי להאיץ את הצמיחה שלהם האוכלוסייה תא14. בשל תדירותו גבוהה, נ' parahaemolyticus צריך להיות במעקב לאורך שרשרת אספקת המזון, במיוחד בתחום הסחר והייצור של פירות ים מאז מוצרים אלה הם שבו הם נמצאים בכמויות עצומות15,16 ברחבי העולם. כיום החיידקים מזוהות ואת וזמינותו מבודדים באמצעות מגוון של שיטות כולל בדיקות ביוכימיות, העשרה, מדיה סלקטיבי17, מקושרים-אנזים immunomagnetic sorbent (אליסה)18, הדופק-שדה בג'ל (PFGE) 19התלכדות לייטקס בדיקות, בדיקות פולימראז תגובת שרשרת (PCR)20. שיטות אלו דורשות בדרך כלל מוסמכים, מכשירים מתוחכמים וטכניקות מפרך אשר אינם מספקים מידע אודות זיהום באופן מיידי. זה קשות מגביל את הסבירות מיד גילוי זיהום מזיקים ויישומים באתר. כלי איתור מהיר עדיין מהווה אתגר יוצא מן הכלל.
Biosensing מתגלה כאופציה מבטיחה איתור והקאה פתוגנים משום שהיא מציעה לחיסכון בזמן, חסכונית, מעשית, בזמן אמת וניתוח בשיטת21,22,23,24 . עם זאת, אמנם היו תוצאות חיוביות רבות של analyte בזיהוי כל פתרון באמצעות ביולוגיים ודוגמאות מחודדים, יש עדיין חוסר מחקר חלה על דוגמאות אמיתיות או תערובות מימית או תמציות אורגניות25. לאחרונה, ביולוגיים אלקטרוכימי באמצעות זיהוי ישיר ו/או עקיף חומצה deoxyribonucleic (DNA) קיבלו תשומת לב מוגברת בקרב מדענים, עקב שלהם זיהוי ספציפי של המטרה משלימים באמצעות אירוע הכלאה26 , 27 , 28 , 29. גישות ייחודיות אלה יציבים יותר בהשוואה ביולוגיים מבוססי אנזים, ובכך מציע טכנולוגיה מבטיח המזעור, מסחור. המטרה של המחקר דיווח הנה כדי לבנות כלי מהיר יכול לזהות נ' parahaemolyticus עם סלקטיביות גבוהה, רגישות, מעשיות, המבוססת על רצף ה-DNA יחודיות במהלך הכלאה. זיהוי אסטרטגיות כוללות השילוב של חומצה מיוצב חלקיקי זהב (PLA-AuNPs) polylactic30 ואלקטרודות פחמן המסך המודפס (SPCEs) בנוכחות מחוון הכלאה, מתילן כחול (MB). הפוטנציאל של הבונה הזיהוי מפותחת הוא חקר נוסף באמצעות חיידקים דגימות די אן איי פשוט נתעלף lysate ורענן.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>דיאמינואתאן חומצה טטראצטית</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>דיסודיום מימן פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>אתנול&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>זהב (III) כלוריד טריהידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>520918</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי, מונוהידרט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>שרף פולי (חומצה לקטית), דרגה מסחרית 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>מו"פ M כימיקלים</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הקסציאנופרט III</td><td>R& M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט מלח נטול מים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>טריסודיום ציטראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>טריס-בסיס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR מאסטר מיקס עם צבע כפול</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל אגרוז</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>בולטון אגר</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Eosin מתילן כחול אגר&nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GelRed Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>טוען צבע 100 bp סולם DNA</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>טוען צבע 1kb סולם DNA</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>מניטול חלמון ביצה פולימיקסין אגר</td><td>מרק</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>מקונקי אגר</td><td>מרק</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>מרק תזונתי</td><td>מרק</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>טאק פולימראז</td><td>מרק</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>טריפטיקז מרק סויה</td><td></td> מרק <td>105459</td><td></td></tr><tr><td>טריפטיקס סויה אגר</td><td>מרק</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

ויבריו parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) הוא. חיידק נפוץ והקאה אשר תורם חלק ניכר של בעיות בריאות הציבור ברחבי העולם, באופן משמעותי משפיע על הקצב של האדם תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית. שיטות קונבנציונליות איתור נ' parahaemolyticus כגון שיטות מבוססות-תרבות, מבחני אימונולוגי מולקולרי המבוסס על שיטות דורשים טיפול מסובך לדוגמה, זמן רב, מייגע, ויקרות. לאחרונה, ביולוגיים הוכיחו להיות שיטה לזיהוי מבטיח ומקיף עם היתרונות של זיהוי מהיר, משתלמת, ו המעשיות. מחקר זה מתמקד בפיתוח שיטה מהירה של גילוי נ' parahaemolyticus סלקטיביות גבוהה ורגישות שימוש בעקרונות ה-DNA הכלאה. עבודה, אפיון polylactic מסונתז מיוצב חומצה חלקיקי זהב (PLA-AuNPs) הושג באמצעות קרני רנטגן (XRD), ספקטרוסקופיה הגלוי אולטרה סגול (UV-Vis), הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), פליטת שדה מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (FESEM), וולטמטריה ציקלית (CV). אנחנו גם ביצעו בדיקה נוספת של יציבות, רגישות הפארמצבטית של ה-PLA-AuNPs. . מצאנו ה-PLA AuNPs נוצר מבנה הקול של חלקיקים מיוצב בתמיסה המימית. גם הבחנו כי שיפרה הרגישות כתוצאה ערך התנגדות (Rct) קטן יותר תשלום העברה, גידול של פעיל שטח (2ס מ 0.41). פיתוח ביוסנסור הדנ א שלנו מבוססת על שינוי של אלקטרודות פחמן המסך המודפס (SPCE) עם ה-PLA-AuNPs ושימוש מתילן כחול (MB) כאינדיקטור חמצון-חיזור. אנחנו לאומדן האירועים הנייח והכלאה הדופק דיפרנציאלי voltammetry (DPV). מצאנו כי משלימים, שאינם משלימים, oligonucleotides לא תואמת במיוחד היו מכובדים על ידי החיישן מפוברק. זה הראה גם זיהוי רגיש בצורה אמינה במחקרים אשיג נגד פתוגנים שונים שמקורם במזון, הזיהוי של נ' parahaemolyticus בתוך הלב טריים.

היווצרות AuNPs התגלה באמצעות בשינוי הצבע של התמיסה המימית עם סודיום ציטרט הנוכחי. זה גרם את הצבע לשנות מן צהוב בהיר אדום רובי עמוק. הדור של ה-PLA-AuNPs אושרה של ספקטרום UV-vis (איור 1) שבו הצמיחה של הפסגה תהודה (SPR) משטח פלזמון נמצאה כ 540 nm. היווצרות ואת קיומו של ה-PLA-AuNPs הייתה מצוינת בטווחים גל nm 500-600, בהתאם לגודל החלקיקים37. הדפוסים XRD של AuNPs, פלה-AuNPs מוצגים באיור2. כל פסגות crystallite נצ...

פרוטוקול לפיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA הכוללת של אלקטרודות פחמן חלקיקי-לאחרונה, המסך המודפס מיוצב חומצה, זהב polylactic לזהות ויבריו parahaemolyticus מוצג.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

פתוגנים הנישאים במזון תורמים לחלק גדול מבעיות בריאות הציבור בעולם, המשפיעות באופן משמעותי על שיעור התמותה והתחלואה האנושית. שיטות קונבנציונליות לאיתור פתוגנים הנישאים במזון דורשות טיפול מסובך בדגימות וגוזלות זמן. לאחרונה, חיישנים ביולוגיים הוכיחו את עצמם כשיטת זיהוי מבטיחה ומקיפה עם היתרונות של זיהוי מהיר ומעשיות.פיתוח חיישנים ביולוגיים מבוסס על אלקטרודה מותאמת עם ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית. אלקטרודת פחמן מודפסת על מסך שונתה כדי להגדיל את שטח הפנים הפעיל של האלקטרודה העובדת. למתילן כחול המשמש כקומפלקס חמצון חיזור יש קשר חזק עם DNA חד-גדילי של DNA בדיקה משותק.קשר זה של אפיניות גבוהה מיוצג על ידי זרם שיא גבוה. הכלאה של DNA חד-גדילי עם הרצף המשלים שלו מחליפה את מולקולות המתילן הכחולות הקשורות, מה שמפחית את הזרם של וולטמטריית הדופק הדיפרנציאלי. ייתכן שהסיבה לכך היא כמות קטנה יותר של מתילן כחול שנאספה על פני האלקטרודה שהשתנתה עם DNA דו-גדילי משלים, שנגרמה על ידי אינטראקציה בלתי ניתנת להשגה בין בסיסי גואנין.צבע התמיסות המוכנות משתנה החל מצהוב לשחור ולבסוף לאדום אודם כהה. זה הצביע על כך שמלח הזהב הופחת על ידי יוני הציטראט. החומצה הפולילקטית המומסת עורבבה עם תמיסת ננו-חלקיקי הזהב שהוכנה קודם לכן ולאחר מכן ערבבה באופן הומוגני בטמפרטורת החדר, שסומנה לאחר מכן כננו-חלקיקי זהב מיוצבים של חומצה פולילקטית.ספקטרוסקופיה גלויה אולטרה סגולה, עקיפה של קרני רנטגן, מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה עם ספקטרומטריית קרני רנטגן מפזרת אנרגיה שימשו לאפיון ננו-חלקיקי הזהב המיוצבים בחומצה פולילקטית. כ-25 מיקרוליטר של התמיסה ההומוגנית של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית הוזרמו במהירות על המסך, אלקטרודת פחמן מודפסת ויובשו באוויר במשך 24 שעות לפני השימוש. האלקטרודות ששונו אופיינו לאחר מכן באופן אלקטרוכימי באשלגן פרוציאניד כדי למדוד שטח פנים פעיל, ספקטרוסקופיה של עכבה אלקטרוכימית, יכולת חזרה, שחזור ויציבות.אופטימיזציה של מצב הקיבוע נקבעה באמצעות שלושה גורמים, ריכוז ה-DNA החד-גדילי נע בין 0.2 ל-1.4 מיקרומולר, זמן שנע בין 30 ל-220 דקות וטמפרטורה שנעה בין 25 ל-75 מעלות צלזיוס. מצד שני, אופטימיזציה של תנאי ההכלאה נקבעה באמצעות שני גורמים, שהם זמן שנע בין חמש ל-35 דקות וטמפרטורה שנעה בין 25 ל-75 מעלות צלזיוס. האלקטרודות ששונו שטופלו הוטבלו לאחר מכן ב-20 מתילן כחול מיקרו-מולרי למשך 30 דקות.ה-DNA שלא נספג במיוחד ועודף מתילן כחול הוסרו על ידי שטיפה עם חוצץ אצטט מלוח pH 4.5 ולאחר מכן נשטפו במים נטולי יונים. זרם השיא של הפחתת מתילן כחול נמדד באמצעות טכניקת וולטמטריית דופק דיפרנציאלי. מדידת הוולטמטריה של הדופק הדיפרנציאלי בוצעה באמצעות pH מלוח מאגר פוספט 7.0 שלא הכיל אינדיקטור.הליך דומה נערך עבור כל האינטראקציות. Vibrio parahaemolyticus כזני ייחוס ושמונה זני חיידקים אחרים, כלומר Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus ו-Vibrio alginolyticus של הפתוגן הנפוץ הנישא במזון שימשו לאימות חיישן הביולוגי של ה-DNA האלקטרוכימי במחקר זה. תת-תרבית שגרתית של זני חיידקים על האגר שלהם נערכה כל שבועיים כדי לשמור על חיותם.כמות תאי Vibrio parahaemolyticus נקבעה בטכניקת צלחת מפוזרת. מילימטר אחד מתרבית תאי החיידק הועבר לתשעה מילימטר של מרק סויה טריפטיקאז המכיל 3% נתרן כלורי כדי לקבל מקדם דילול של 10. לאחר מכן, 0.1 מיליליטר מכל גורם דילול החל מגורם דילול חד פעמי של פי 10 עד פי 10 גורם דילול של 10 נמרח על צלחת של CHROMagar Vibrio לספירת מושבות, בהתאמה.הקוקלים הושגו מהשוק הרטוב ולאחר מכן הובאו במהירות למעבדה בקופסת קירור קרח לניתוח. התרנגולים חולקו לשתי קבוצות, הקבוצה המטופלת והקבוצה הלא מטופלת, מתוך הנחה שהתרנגולים נקטפו באופן אחיד מתחילת המסיק ועד לאחסון בקירור בשוק. תרנגולים בקבוצה שטופלה טופלו מראש על ידי אחסונם במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, ולאחר מכן חשיפה לאור אולטרה סגול ב-20 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות לפני מיצוי ה-DNA.טמפרטורת הקיפאון והחשיפה האולטרה-סגולה ששימשו לקבוצת הביקורת היו צפויים להרוג אותה או לפחות להגביל את הפתוגנים הנישאים במזון המצטברים באופן טבעי בקוקלים. משטר פסטור גבוה יותר של 70 מעלות צלזיוס לא יושם, מכיוון שמטרת המצב המבוקר במחקר זה הייתה לחקות את המצב האמיתי של הקוקלים הטריים. בינתיים, דגימות מהקבוצה הלא מטופלת נותחו ישירות ללא כל טיפול מקדים ברגע שהגיעו למעבדה.הקוקלים נשטפו במים מזוקקים וקרצפו ללא לכלוך לפני הוצאת הרקמות מהקונכיות באמצעות מלקחיים סטריליים וארון זרימה למינר. כ-10 גרם דגימות רקמת קוקל הומוגניות עם ההומוגנייזר ב-19 מיליליטר של מרק סויה טריפטיקאז סטרילי המכיל 3% נתרן כלורי למשך 60 שניות. לאחר מכן נוספה כמות ידועה של פתוגנים הנישאים במזון לתשעה מילימטרים של מרק הדגימה ההומוגני עבור הדגימות הדוקרניות.הדגימות הלא דוקרניות שימשו כביקורת שלילית. כמיליליטר אחד של דגימות הוזרמו לתוך שפופרת אפנדורף למיצוי דגימת DNA שתשמש לבדיקת החיישן הביולוגי ותגובת השרשרת של פולימראז. לאחר מכן חולץ ה-DNA הגנומי של הפתוגן הנישא במזון מהדגימות הדוקרניות והלא קוצניות.DNA גנומי חולץ לאחר הליך ליזה מבושל שונה. הדנ"א הגנומי צנטריפוגה ב-12,000 סיבובים לדקה למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להשיג תרחיף ברור והסופרנטנט נשמר במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף. נעשה שימוש בביופוטומטר כדי לקבוע את הריכוז והטוהר של ה-DNA הגנומי שחולץ.זהותם של כל הזנים נקבעה לאחר מכן באמצעות מבחנים ביוכימיים סטנדרטיים ואומתה על ידי ריצוף גנים של 16 SR RNA. לבסוף, הדנ"א הגנומי עבר דנטורציה ב-92 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות והתקרר במהירות במי קרח לפני יישום החיישן הביולוגי. אישור נוסף של פתוגנים הנישאים במזון נעשה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז המכוונת לגן המתאים.המוצר המוגבר וגודלו נקבעו באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1.5%. תמונות הג'ל צולמו באמצעות מערכת תיעוד ג'ל. הדור של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית אושר מהספקטרום הנראה האולטרה סגול, שצמיחת הפלזמה על פני השטח ושיא התהודה התבססה סביב 540 ננומטר.היווצרותם וקיומם של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית צוינו בטווחי אורכי גל של 500 עד 600 ננומטר, תלוי בגודל החלקיקים. כל הפסגות הגבישיות של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית נצפו בשני הזירות ב-31.7, 38.2, 44.4, 64.7 ו-77.7 מעלות. עוצמות השיא של הגבישים גדלו גם כאשר שיאי עקיפה רחבים יותר נכנסו ב-31.7 מעלות, מה שמרמז על כך שהננו-חלקיקים הקרים היו משובצים בחומצה הפולילקטית ומרמז על היווצרות ננו-מבני זהב פוליפאזיים.מעקומת התפלגות חלקיקי מיקרוסקופ אלקטרונים ותמונות של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית, ניתן היה לראות כי ננו-חלקיקי זהב הם כמעט כדוריים בצורתם. גודל הננו-חלקיקים היה בטווח של כ-37 ננומטר, שהוא מעט גדול יותר מזה שהתקבל מהנוסחה של שרר, מה שמרמז על אופי רב-גבישי של הננו-חלקיקים המסונתזים. הגודל העיקרי של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית חושב באמצעות משוואת שרר על ידי קביעת רוחב ההשתקפות של 100 בראג.מהטבלה, גודל הגביש של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית חושב כ-27 ננומטר. מתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה ועם ספקטרום קרני רנטגן מפזר אנרגיה, לאלקטרודת הפחמן המודפסת במסך השונה היה אחוז המשקל הגבוה ביותר של זהב, הצפיפות הגדולה ביותר והמבנה הגדול ביותר של כיסוי ננו-חלקיקים. ספקטרום קרני הרנטגן המפזר אנרגיה אישר כי ננו-חלקיקי הזהב המיוצבים בחומצה פולילקטית כפי שנוצרו היו מורכבים מזהב בלבד ולא הציגו שום יסוד אחר מלבד השיא המתאים לפחמן וחמצן.פוטנציאל השיא האנודי והקתודי היו עקביים בקצבי סריקה שונים, מה שמרמז על כך שהתגובה האלקטרוכימית הייתה הפיכה על סמך הפרדת שיא. שטח הפנים הפעיל של האלקטרודות ששונו חושב כ-0.26 סנטימטרים בריבוע ו-0.41 ס"מ בריבוע עבור האלקטרודה החשופה והאלקטרודה ששונה, בהתאמה. תוצאה זו אישרה כי השיפור שהעניקו ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית על שטח הפנים הפעיל היה גבוה יחסית בהשוואה לאלקטרודה החשופה.ערך התנגדות העברת המטען עבור האלקטרודה החשופה היה 1, 932 אוהם, ואילו האלקטרודה שהשתנתה ירדה ל -1, 444 אוהם. הירידה בערך התנגדות העברת המטען באלקטרודה שהשתנתה עשויה לנבוע מירידה בקבוע הדיאלקטרי המקומי ו/או עלייה בעובי השכבה הכפולה החשמלית, מה שמרמז על כך שאשלגן פרוציאניד פעל על ידי ספיגה בממשק המתכת או התמיסה. זרמי השיא גדלו בהדרגה עם שינוי האלקטרודה החשופה באמצעות ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית, שהראו שרגישות גבוהה יותר היא ההיפוך של התנגדות העברת המטען הנמוכה יותר.סטיית התקן היחסית של האלקטרודה שהשתנתה נגזרה כ-4.26% האלקטרודה עם שינוי ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית נתנה סטיית תקן יחסית טובה יותר לאחר מספר מדידות. ערכי סטיית תקן יחסיים של 4.05% עבור אלקטרודה שונה המצביעים על שחזור טוב יותר של ייצור האלקטרודה עבור ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית. הריכוז האופטימלי של ה-DNA היה 1.2 מיקרו-מולרי DNA חד-גדילי.זמן הקיבוע האופטימלי של ה-DNA החד-גדילי נבחר כ-180 דקות. טמפרטורת הקיבוע האופטימלית של ה-DNA החד-גדילי נבחרה כ-55 מעלות צלזיוס. זמן ההכלאה האופטימלי של ה-DNA הדו-גדילי נבחר כ-10 דקות.טמפרטורת ההכלאה האופטימלית של ה-DNA הדו-גדילי נבחרה כ-35 מעלות צלזיוס. DNA משלים הציג את זרם השיא הנמוך ביותר של 0.73 מיקרו-אמפר מבין ה-DNA שנבדק, DNA לא משלים, שלושה בסיסים DNA לא תואם ו-DNA לא תואם בסיס אחד. ברור שהזרם הגבוה מה-DNA שהותקף קטן יותר מהזרם של הרצפים האחרים של אוליגונוקלאוטיד.תוצאה זו הצביעה על כך שניתן להשתמש בחיישן הביולוגי כדי להבחין ברגישות וספציפיות גבוהות. לחיישן הביולוגי של ה-DNA שנבנה הייתה סלקטיביות של זיהוי הכלאה באמצעות DNA בדיקה משותק על פני האלקטרודה ששונה. ירידה מתמשכת בזרם השיא של וולטמטריית הדופק הדיפרנציאלי של מתילן כחול על האלקטרודה שהשתנתה הופעלה כתוצאה מעלייה בריכוז ה-DNA המשלים.מתאם ליניארי בין הלוג של ריכוזי DNA יעד שונים 0.2 פיקומולר עד 0.02 מילימולר לבין הלוג של זרם שיא הפחתת מתילן כחול מתואר עם מקדם רגרסיה ליניארי של 0.96. אחוז ההתאוששות של חיישן ה-DNA הביולוגי המיוצר ירד לאט ללא פחות מ-80% מהאות הראשוני שלו לאחר שישה חודשי אחסון, מה שמצביע על כך שבדיקת ה-DNA החד-גדילי על פני האלקטרודה שהשתנתה יציבה ביותר. יציבות טובה לטווח ארוך בטמפרטורה מתחת ל-45 מעלות צלזיוס עשויה להיות הסיבה לתגובה החזקה בין ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית לבין DNA חד-גדילי.תוצרי הגברת תגובת שרשרת הפולימראז עבור תשעה מינים שונים של חיידקים, שהיו Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae ו-Vibrio parahaemolyticus נבדקו. זרם השיא של וולטמטריית הדופק הדיפרנציאלי המתקבל לאחר הערכת תגובתיות צולבת מראה זיהוי ברור מאוד של Vibrio parahaemolyticus בהשוואה למיני חיידקים אחרים. ניתן לראות זאת על ידי הפחתת מספר זוגות הבסיסים, אות הוולטמטריה של הדופק הדיפרנציאלי הנצפה עולה.זה קשור לכמות הגדולה יותר של מולקולות מתילן כחולות עד לבדיקות. מניתוח תגובת השרשרת של פולימראז, Vibrio parahaemolyticus נמצא הן בדגימות המטופלות והן בדגימות הלא מטופלות, כפי שמוצג על ידי נתיב 7, 8, 9, 10, 11 ו-12. ואילו הדגימות הלא דוקרניות שטופלו ולא טופלו בנתיב 1, 2, 3, 4, 5 ו-6 היו נטולות Vibrio parahaemolyticus.תוצאות הזיהוי מתבצעות באמצעות חיישן ה-DNA הביולוגי שפותח אשר קבע בהצלחה את נוכחותו של Vibrio parahaemolyticus בקבוצה המטופלת המורכבת מדגימות דוקרניות ולא קוצניות. תוצאות אלה מתואמות באופן חיובי עם תוצאות תגובת שרשרת הפולימראז שנדונו קודם לכן. ליישום של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית יש פוטנציאל גדול ליישום כשינוי לתחושת ייצור נוספת.ניתן להשיג סלקטיביות גבוהה כאשר קומפלקס החיזור נקשר חזק יותר למולקולת הזיהוי הביולוגי הלא היברידית, מה שעשוי להיות חידוש שכדאי לעקוב אחריו.

development-an-electrochemical-dna-biosensor-to-detect-foodborne

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול לזהות trichothecenes (mycotoxins של דאגה לבריאות האדם) בשיטת ההקרנה החדשה שפותחה על בסיס שיטת immunochemical תחרותי זיהוי סופי אלקטרוכימיים מודגם.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

"ה-DNA" חיישנים, reagentless, biosensors אלקטרוכימיים כי ביצועים טובים גם כאשר תיגר ישירות בדם מטריצות מורכבות אחרות, הותאמו זיהוי של מגוון רחב של חומצת גרעין חלבון, ו analytes מולקולה קטנה. כאן אנו מציגים הליך כללי עבור ייצור ושימוש של חיישנים כאלה.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי לגילוי חיידקים מהיר והזדהות. Assay כרוך מערך חיישנים פונקציונליות עם בדיקות ללכוד oligonucleotide DNA ל( rRNA) רצפי מינים ספציפיים ריבוזומלי RNA. הכלאה כריך של rRNA היעד עם הבדיקה ללכוד ובדיקת גלאי דנ"א oligonucleotide peroxidase צמודת חזרת מייצרת נוכחית amperometric למדידה.

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

מקור: Barber, A. E., et al. הכנה ויישום של חיישן ביולוגי חיידקי חדש לזיהוי משוער של שאריות ירי. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים זיהוי של אנליטים ספציפיים באמצעות חיישן ביולוגי חיידקי. נלקחת תרבית חיידקים הנושאת פלסמיד עם גן חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) תחת מקדם רגיש לאנליט. לאחר ניגוב יסודי של משטח הבדיקה, חלק קטן מהמגבון טובל בתרבות ומודגר. האינטראקציה האנליטית עם המקדם מפעילה ביטוי RFP, ומאשרת את נוכחותו של אנליט המטרה.

זיהוי אנליט מטרה באמצעות חיישן ביולוגי חיידקי

סרטון זה מדגים טכניקה לזיהוי מזהמים חיידקיים בדגימות מזון ומים באמצעות ננו-חיישנים. חיידקי המטרה הפתוגניים מזוהים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטית ושיטות פליטה פלואורסצנטיות.

זיהוי זיהום חיידקי באמצעות ננו-חיישנים מגנטו-פלואורסצנטיים

Biosensor אופטי ללא תווית לזיהוי חיידקים מהירים הוא הציג. Biosensor מבוסס על Si הנקבובי nanostructured, שנועד ללכוד באופן ישיר את תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו. אנו משתמשים בנוגדנים חד שבטיים, משותקים על המתמר הנקבובי, כמו הבדיקות ללכוד. המחקרים שלנו מראים את הישימות של biosensors אלה לצורך זיהוי של ריכוזי חיידקים נמוכים תוך דקות ללא עיבוד לפני מדגם (כגון תמוגה תא).

זיהוי אופטי של א coli חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

אנו מציגים biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic לגילוי הכלאת DNA. בעקבות functionalization הבדיקה ssDNA, הסגוליות, הרגישות, וגבול הגילוי נלמדים ביעדי ssDNA משלימים ולא משלימים. תוצאות ממחישות את השפעתם של אירועי הכלאת DNA על מערכת אלקטרוכימיים, עם גבול גילוי של 3.8 ננומטר.

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי קולורימטרי של E. coli באמצעות בדיקת לקמוס שונה המנצלת DNAzyme, אוראז וחרוזים מגנטיים.

איתור מדד-צבע של חיידקים באמצעות מבחן לקמוס

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

סלמונלה spp /שיגלה spp. הם נפוצים פתוגנים לייחס שלשול. כאן, אנו מתארים פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp / spp.שיגלה באמצעות PCR בזמן אמת בשילוב עם תרבות מודרכים.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

למד לפתח ביוסנסור אלקטרוכימי לזיהוי Vibrio parahaemolyticus באמצעות אלקטרודות פחמן מודפסות וננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר ורגיש של פתוגנים במזון.

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

גלה סרטונים נוספים