ניתוח התקשורת בין ומונוציטים ו תאים סרטניים בשד ראשי במטריצה חוץ-תאית לחלץ (ECME)-מבוסס מערכת תלת מימדי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לחקור את התקשורת הישירה והעקיפה בין תאי סרטן שד ראשוניים למונוציטים במערכת תרבית משותפת תלת מימדית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במיקרו-סביבה דלקתית של תחום סרטן השד כגון כיצד תאי חיסון מדורגים מחדש ומופעלים, כיצד תאים אלה עוזרים לקיים את המיקרו-סביבה הדלקתית של הגידול וכיצד מיקרו-סביבה זו מקלה על פלישת תאי הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת אלטרנטיבה משתלמת לחקר תקשורת תוך-גידולית וממחישה את הפוטנציאל של מערכות תאים תלת-ממדיות במבחנה לחקירת מאפיינים ספציפיים של ביולוגיה של הגידול.

במיוחד אלה הקשורים לתוקפנות גידול. כדי להתחיל, טפחו פעמיים 10 עד השישי U937 ו-THP1 מונוציטים ב-10 מיליליטר של מדיום RPMI1640, בתוספת 10 אחוז FBS ו-1% אנטיביוטיקה אנטי-פטריית. טפחו גם PMs טריים בתוספת DMEMF12 בינונית.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה של חמישה אחוזי פחמן דו חמצני. צלחת ארבע פעמים 10 עד המונוציטים החמישיים במיליליטר אחד לבאר של המדיום המקביל להם. מניחים תוספת בכל באר ומוסיפים 900 מיקרוליטר מארבע פעמים 10 לתרחיף תאי BrC החמישי במדיום המתאים.

דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה של חמישה אחוזי פחמן דו חמצני למשך חמישה ימים והחזירו את הסופרנטנטים. אחזר את התאים על ידי טריפסיניזציה אם מבוצע ניתוח לאחר מכן. כלול בקרות של תרביות תאים בודדות עם המדיה המתאימה.

כדי לתייג תאי BrC ומונוציטים עם קומרין ורודמין זמינים מסחרית לפני תרבית תאים, הכינו חד-שכבה של פעמיים כפול 10 לתאי BrC השישיים המעניינים והחליפו את המדיום הסטנדרטי בתמיסת עבודה מספקת ומחוממת מראש של הצבע הפלואורסצנטי. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה של חמישה אחוזי פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לאחר מכן שאפו את תמיסת הצבע והשתמשו במספיק XPBS אחד כדי לשטוף בעדינות את התאים.

שאפו את ה-PBS והוסיפו את המדיום הסטנדרטי. כדי לנסח את התאים, הוסיפו שני מיליליטר של 05 אחוז טריפסין ו-0.48 מילי-מולרי EDTA לבקבוק ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות. הוסף 200 מיקרוליטר FBS כדי לעצור את הטריפסיניזציה ושבעה מיליליטר של המדיום המקביל ללא תוספים.

השעו מחדש את התאים על ידי פיפטינג, ואז העבירו 10 מיקרוליטר מהתאים לתא Nuebauer וספרו אותם. לאחר מכן, גלו את התאים בטמפרטורה של 430 פעמים גרם וטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט והשתמשו בשלושה מיליליטר של תמיסת עבודה של צבע פלואורסצנטי שחומם מראש כדי להשעות מחדש את התאים. דגרו את תרחיף התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה של חמישה אחוזי פחמן דו חמצני למשך 30 דקות.

לאחר כדור התאים שוב, השליכו את תמיסת עבודת הצבע והשתמשו בחמישה עד שבעה מיליליטר של XPBS אחד כדי להשעות מחדש בעדינות את התאים. לאחר מכן, לאחר גלולת התאים פעם נוספת והשלכת ה-PBS, השעו מחדש את התאים בחמישה עד שבעה מיליליטר של מדיום סטנדרטי. ספרו 10 מיקרוליטר של מתלה התאים.

הגדר תרבית משותפת על ידי פיזור מספיק ECME בתחתית הבאר כדי ליצור שכבה אחידה בכל באר של מערכת שקופיות של ארבע בארות. לוח 20 מיקרוליטר של תרחיף תא בודד המכיל חמישה פעמים 10 עד החמישי תאי BrC מסומנים לבאר. לאחר 15 עד 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, הוסף תרחיף של 2.5 כפול 10 למונוציטים המסומנים החמישי ב-80 מיקרוליטר של מדיום בדיקה בתוספת 60 אחוז ECME.

אפשר ל-ECME להתמצק ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות. כעת הוסף מיליליטר אחד של תערובת אחד לאחד של תאי BrC ומדיום תרבית מונוציטים. דגרו על התרבויות המשותפות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה של חמישה אחוזי פחמן דו חמצני למשך 24 שעות, 48 שעות או חמישה ימים כדי לעקוב אחר שינויים בנקודות זמן שונות.

כדי לפרק את חלבוני ה-ECM ולשחזר את התאים מהתרביות, שאפו והשליכו את המדיום, ואז הוסיפו לתרבית 0.5 מיליליטר של XPBS אחד עם 0.1 אחוז טריפסין ו-0.25 אחוז EDTA. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר הדגירה, הוסף 0.5 מיליליטר של XPBS אחד עם 10 אחוז FBS כדי לנטרל את הטריפסין ולהשעות מחדש את התאים על ידי פיפטינג נמרץ להשגת תרחיף תא בודד.

לאחר הטלת התאים, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של XPBS אחד עם 10 אחוז FBS. חזור על שלב זה פעם אחת. הכפף את מתלה התא לפקס באמצעות המכשיר המתאים.

ודא שהאוכלוסיות הסופיות טהורות ב-95 אחוז לפחות. בכל באר של מערכת שקופיות של שמונה בארות פרש בסיס של 40 מיקרוליטר של ECME ותן לו להתמצק ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. זרע 800 תאי MCF10 A לבאר ב -400 מיקרוליטר של מדיום תרבית DMEM F12 בתוספת על פי פרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של מדיום מותנה או מדיום תרבית DMEM F12 בתוספת עם 20 ננוגרם למיליליטר של בטא IL1 רקומביננטי אנושי. הנח את החלקה התאית לתוך צלחת פטרי מזכוכית המכילה צלחת פטרי של 35 מיליליטר במילוי שני מיליליטר PBS. יש לזרוע את תאי MCF 10A בכל באר לאט מאוד כדי למנוע נזק לבסיס ה-ECME וכדי למנוע מהתאים להתיישב וליצור מונולי.

באמצעות מיקרוסקופ אופטי מתעדים היווצרות אציני בלוטות כל 24 שעות למשך 14 יום. לאחר 14 יום של תרבית, הוסיפו 100 מיקרוליטר של 100 ננו-מולרי דאפי ב-XPBS אחד ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב מתמיד למשך 25 דקות. שוטפים את הדגימות עם XPBS אחד בטמפרטורת החדר, שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת תוך ערבוב מתמיד.

השתמש במדיום הרכבה ספציפי לצביעה פלורסנט כדי להרכיב את התכשירים. לאחר מכן אטמו את הדגימות המותקנות בפוליש שקוף ושמרו על השקופיות, מוגנות מפני אור בארבע מעלות צלזיוס. מי שידגים את ההליך במיקרוסקופ הקונפוקלי יהיה ואדים פרז, חוקר מהמעבדה הלאומית למיקרוסקופ מתקדם.

נתח את האצ'יני במיקרוסקופ קונפוקלי שצילם תמונות של ערימות רוחביות בעומקים שונים של האציני. דמיין חלבונים תאיים שונים באצ'יני עם פרוטוקולי צביעה מתאימים. לדוגמה, קאהרן נצבע כאן כדי להעריך הידבקות תא לתא, קוטביות תא והיווצרות אורלימן.

המורפולוגיה של תאי BrC ראשוניים הגדלים בתרביות תלת מימד בצפיפות נמוכה וגבוהה נחקרה במשך חמישה ימים. במהלך 48 השעות הראשונות, תאים נצמדים ל-ECME בצורת ציר מוארך ויוצרים מבנים דמויי סריג לאחר חמישה ימים. לאחר חמישה ימים בתרביות תלת-ממדיות, תאי BrC מסחריים MCF7 ו-MDA-MB-231 יצרו אגרגטים לא מאורגנים.

עם זאת, תאי MDA-MB-231 אגרסיביים עבור אגרגטים עם צורות מוארכות, בעוד שתאי MCF7 לא אגרסיביים עבור אגרגטים בעלי צורות מעוגלות הדחוסות בצפיפות רבה יותר מאשר תאי MDA-MB-231. הסופרנטנטים מאינטראקציה עקיפה של תרביות BrC ראשוניות תלת-ממדיות ותרבויות משותפות של חמישה ימים עם מונוציטים ראשוניים נקצרו. רמות מוגברות משמעותית של IL1 beta ו-IL8 נצפו בתרביות מונוציטים ראשוניות של תאי BrC.

ציטוקינים חיוניים ודליקים כאחד שהיו קשורים בעבר להתקדמות ממאירה. תאי MCF10A גודלו עם שני סופרנטנטים שונים משני קווי תאי BrC ראשוניים כדי לצפות בהיווצרות לומן כמדד לעמידות בפני אנויקיס. בניגוד לתאי MCF10A שגדלו בתנאים סטנדרטיים, מיקרוסקופיה דו-קונפוקלית ביום 14, חתכים רוחביים של הספרואידים מראים שתאי MCF10A התחמקו מאנויקיס כפי שנמדד על ידי ספירת מספר התאים המרכזיים באציני.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח רפואי על מנת לענות על שאלות נוספות. בדוק את מסלולי האיתות בשני נדידת הסרטן. לאחר פיתוחה טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מיקרו-סביבות גידול לחקור את התקשורת של תאי סרטן השד עם תאי מסה, פיברובלסטים, נויטרופילים, או אפילו שיבוטים שונים של תאי גידול במערכות תרבית משותפת תלת מימדית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקים מערכת תרבית תלת מימדית למודל המיקרו-סביבה של הגידול.