דיפרנציאלית השפעות תרופות להורדת שומנים בדם להתכוונן מורפולוגיה של כולסטרול חלקיקים

המטרה הכוללת של מחקר זה היא להעריך את ההשפעה של תרופות להורדת שומנים בוויסות תכונות מורפולוגיות של חלקיקי כולסטרול בשיטת מערך פלאק, ולזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לאבחון טרשת עורקים וקביעת השפעות התרופות. תפקידן של תרופות להורדת שומנים בוויסות היווצרות חלקיקי כולסטרול אינו מובן היטב. כאן אנו מדגימים כי תרופות להורדת שומנים ממלאות תפקיד ישיר בשינוי הפרופילים והמאפיינים המורפולוגיים של היווצרות חלקיקי כולסטרול.

היתרון העיקרי של מערך הפלאק המבוסס על שיטת הדמיה חוץ גופית על פני שיטות אחרות לזיהוי חלקיקים הוא בכך שהוא מאפשר הדמיה של חלקיקי כולסטרול להערכת ההשפעה של תרופות להורדת שומנים בסרום. ג'ייסון לונדרי, טכנאי מעבדה ב-Plaxgen ידגים כיצד אנו מגדירים את מבחן מערך הפלאק באמצעות מנתח כימיה. ריימונד קונג, מדען בכיר ב-Millipore Sigma, ידגים כיצד אנו מבצעים את עיבוד הדגימה באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה.

לבסוף, דיוויד ליו, טכנאי מעבדה של Plaxgen ידגים ניתוח נתונים עבור תמונות חלקיקי כולסטרול. השתמש במנתח כימיה-1 כדי להגדיר את מבחן מערך הפלאק להיווצרות חלקיקי כולסטרול. לאורך כל הבדיקה, שמור על נפח התגובה הסופי בכל באר על 200 מיקרוליטר, ובצע את כל הבדיקות בשלוש עותקים.

ראשית, טען 194 נקודות חמישה מיקרוליטרים של מי מלח חוצצים פוספט, או PDS לכל באר של צלחת תחתית עגולה, קושרת חלבון נמוכה של 96 בארות. לכל באר, הוסף שניים וחמישה מיקרוליטרים מכל תמיסת תרופה להורדת שומנים, לא מתווספת תרופה לדגימות הבקרה השליליות. לאחר מכן, יש לנער את הצלחת למשך 30 שניות, על ידי הנחתה על צלחת התגובה של מנתח הכימיה-1 כדי לערבב את התרופה באופן אחיד לתמיסה.

לבסוף, הוסף שני מיקרוליטרים של תמיסת כולסטרול מצטברת עם תווית פלואורסצנטית לכל באר. נער את הצלחת למשך 30 שניות על ידי הנחתה על צלחת התגובה של מנתח הכימיה-1 כמו קודם. לאחר מכן, דגרו את הצלחת על שייקר מעבדה למשך שעתיים המוגדר על 37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד.

לאחר הדגירה, רכשו את תמונות החלקיקים על ידי הדמיית ציטומטריית זרימה. פתח את תבנית רכישת הנתונים כדי לטעון את הגדרות המכשיר הנכונות. לחצו על 'קובץ', בחרו 'טען תבנית' ובחרו בקובץ התבנית.

לחץ על טען, כדי להכין את המכשיר לטעינת דגימה. כאשר תיבת הדו-שיח טען דגימה נפתחת, לחץ על אישור כדי לטעון 50 מיקרוליטר מהדגימות לתוך ציטומטר זרימת ההדמיה. המתן עד שניתן יהיה לראות את החלקיקים באזור ההדמיה בזמן אמת.

כאשר החלקיקים באזור ההדמיה נמצאים במיקוד טוב, לחץ על רכוש כדי לקבל תמונות של כל אובייקט בו-זמנית באופן בעל תפוקה גבוהה עבור שדה כהה, שדה בהיר, פלואורסצנטי ירוק ופלואורסצנטי צהוב. בסיום הרכישה, לחץ על כפתור החזרה כדי להחזיר דגימה. חזור על שלבים אלה כדי לרכוש 5,000 עד 10,000 חלקיקים מכל דגימה.

נתח את כל קבצי התמונה הגולמית באמצעות תוכנת ניתוח התמונה לקביעת עוצמת הקרינה של אובייקטים, וריאציות מורפולוגיות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן צלחת קשירת חלבון נמוכה בתחתית עגולה 96 על ידי העמסת ריאגנטים בצורה מדורגת, תוך שימוש בנפח תגובה סופי של 200 מיקרוליטר לבאר. ראשית, הכינו את בארות הבקרה.

טען 193 מיקרוליטר PBS לכל באר. הוסף 2.5% מהסרום של המטופל, והעמיס רק דגימת סרום אחת לכל באר. לאחר מכן, נער את הצלחת למשך 30 שניות על ידי הנחתה על צלחת התגובה של מנתח הכימיה.

לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של תמיסת כולסטרול מצטברת המסומנת פלואורסצנטית לכל באר. שוב, נער את הצלחת למשך 30 שניות על ידי הנחתה על לוחית התגובה של מנתח הכימיה-1. להכנת הבארות עם תרופות, טען 191 מיקרוליטר PBS לכל באר.

לאחר מכן, הוסיפו 2.5% מכל סרום מטופל לבאר, ונערו את הצלחת למשך 30 שניות, על ידי הנחתה על צלחת תגובה של מנתח כימיה-1. הוסף שני מיקרוליטר של תמיסת אזטימב, לובסטטין, סימבסטטין או ניאצין לכל הבארות למעט בארות הבקרה השליליות. הוספת תרופה אחת בלבד לבאר.

המשך לנער את הצלחת למשך 30 שניות כמו קודם. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של תמיסת כולסטרול מצטברת פלואורסצנטית לכל באר לפני ניעור הצלחת למשך 30 שניות. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך שעתיים בשייקר מעבדה, המוגדר על 37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד.

לאחר הדגירה, רכוש את הדגימות על ידי הדמיית זרימה ציטומטרית בהתאם לאותן הגדרות כמו קודם. השתמש בתוכנת ניתוח התמונות לעיבוד אצווה של כל קבצי התמונה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוצגות כאן תוצאות מייצגות המראות זיהוי של חלקיקי כולסטרול כדוריים וליניאריים בצורת גדיל, המושרים על ידי סטטינים, על ידי מנגנון לא אנזימטי.

מוצג אישור של שתי מורפולוגיות נפרדות של היווצרות חלקיקי כולסטרול, הנגרמות על ידי תרופות אחרות להורדת שומנים. כולל אזטימיב (ezetimibe), ניאצין (niacin), פיבראט (fibrate) וחומצת שומן אומגה 3. מוצגים כאן תרשימי נקודות, שבהם ציר ה-X מציג ספקטרום של חלקיקי כולסטרול שזוהו בערוץ הקרינה הירוק.

וציר ה-Y מציג פיזור צדדי, שער מראה אזורים של ליפו-חלבון בצפיפות נמוכה מאוד, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה וחלקיקי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה, שזוהו בעלילות הנקודות הקרינה. תוצאות אלה מדגימות כיצד השפעת הורדת השומנים משנה את הפרופיל של חלקיקי כולסטרול VLDL ו-LDL מטוהרים, בנוכחות ללא תרופה, אזמיד, לובסטטין, סימבסטטין וניאצין. מוצג כאן מסך של שלוש דגימות סרום שונות לזיהוי השפעה דיפרנציאלית של תרופות שונות להורדת שומנים בדם, המווסתות פרופילים של היווצרות חלקיקי כולסטרול VLDL, LDL ו-HDL.

פרופילים אלה מצביעים על כך שיש גם שונות ברמות התגובה בין שלוש דגימות הסרום השונות. בדיקת דגימת סרום אחת לחלקיקי כולסטרול כדוריים וליניאריים שנוצרו ללא התרופה ובנוכחות תרופות שונות להורדת שומנים בדם, מאשרת שתי מורפולוגיות נפרדות של חלקיקי כולסטרול שמקורם בסרום, המציגות צורות גדיל כדוריות וליניאריות כאחד. לכן הדגמנו בהצלחה גישת הדמיה חוץ גופית לזיהוי השפעת התרופה להורדת שומנים, המווסתת את הקשר להיווצרות חלקיקי כולסטרול ומשמעותם הקלינית.

התוצאות הראשוניות שלנו מבטיחות, ואנו נמצאים בתהליך של אימות נוסף של בדיקת מערך פלאק זו באמצעות דגימות קליניות בקנה מידה גדול. לוח השומנים הסטנדרטי שלך מודד את רמות הכולסטרול LDL ו-HDL בסרום. מבחן מערך הפלאק שלנו, מקווה לשפר את הדיוק של הסיכון לטרשת עורקים ומנבא את תגובת התרופה להורדת שומנים באמצעות סרום.