Name: דבקותה של חיידקים לשתול משטחים הנמדדים במעבדה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: למד שיטה פשוטה למדידת דבקות חיידקים לשורשי צמחים ונבטים. טכניקה זו מהירה, זולה ויעילה למחקר בפתולוגיית צמחים ובטיחות מזון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחבר תודה סוזן ויטפילד הכנה של דמויות, קמיל מרטין, הילארי Samagaio לקבלת סיוע בחלק מהניסויים.

<ol><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li>
<li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11932192">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe-plant+interactions%3A+principles+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Microbe-plant interactions: principles and mechanisms.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).</li>
<li>Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+genomics+and+adaptation+to+life+on+plants%3A+implications+for+the+evolution+of+pathogenicity+and+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).</li>
<li>Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Plant+Growth-Promoting+Bacteria+for+Biocontrol+of+Plant+Diseases%3A+Principles%2C+Mechanisms+of+Action%2C+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).</li>
<li>Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+retention+of+pathogenic+Escherichia+coli.+O157+by+sprouts%2C+leaves+and+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits.</a> Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).</li>
<li>Fuqua, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+bacterial+biofilms+associated+with+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying bacterial biofilms associated with plants.</a> Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).</li>
<li>Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+Escherchia+coli.O157%3AH7+to+alfalfa%2C+human+epithelial+cells%2C+and+plastic+is+mediated+by+a+variety+of+surface+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+cellulose%2C+poly-beta-1%2C6-n-acetyl-D-glucosamine%2C+and+colanic+acid+are+required+for+optimal+binding+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+strains+to+alfalfa+sprouts+and+K-12+strains+to+plastic+but+not+for+binding+to+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).</li>
<li>Matthysse, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9780792351801">The Rhizobiaceae</a>. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01276821">Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells.</a> Protoplasma. 183, 131-136 (1994).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+Agrobacterium+tumefaciens.+attR+mutation+on+attachment+and+root+colonization+differs+between+legumes+and+other+dicots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).</li>
<li>Jeter, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+binding+of+diarrheagenic+strains+of+E.+coli.to+plant+surfaces+and+the+role+of+curli+in+the+interaction+of+the+bacteria+with+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel%2C+attB%2C+attD%2C+and+attR+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analyses+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analyses of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 3 (2012).</li>
<li>Brandl, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+lesions+promote+the+rapid+multiplication+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+postharvest+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).</li>
<li>Franz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+contamination+of+lettuce+by+GFP-expressing+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 1 (2012).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+seed+and+root+exudate+sugars%3A+composition%2C+utilization+by+Pseudomonas+biocontrol+strains+and+role+in+rhizosphere+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization.</a> Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x/abstract">A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Danhorn, T., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+plant-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by plant-associated bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15639628">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+growth+of+Salmonella+enterica+and+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).</li>
<li>Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240593829_Lognormal_Distribution_of_Bacterial_Populations_in_the_Rhizosphere">Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere.</a> Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, 252(2014).</li>
<li>Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+mutants+affected+in+attachment+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells.</a> J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).</li>
<li>Tomlinson, A. D., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+regulation+of+polar+surface+attachment+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, (2014).</li>
<li>Wright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endophytic+lifestyle+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%3A+quantification+and+internal+localization+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots.</a> Phytopathology. 103, 333-340 (2013).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Erickson, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+and+Fate+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+Leafy+Green+Phyllosphere+Tissue+Using+Various+Spray+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions.</a> J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).</li>
<li>McKellar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+approaches+for+modeling+Escherichia+coli+O157%3AH7+survival+on+field+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce.</a> Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).</li>
<li>Wu, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+detection+and+enumeration+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds.</a> Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).</li>
</ol>

המחבר מצהיר שיש לה אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

חשוב להיות מודעים כל של משטחים שעליהם חיידקים יכולים לדבוק במהלך הניסוי. לפיכך חיידקים המסוגלים מחייב זכוכית יכול לזלזל אם קיימא תא ספירת נעשים באמצעות צינורות זכוכית ופיפטות. אם הצמחים גדלים ב אגר או אדמה וחלק אגר או אדמה נשאר על הצמחים ואז החיידק עלול להיקשר לחומר adhering, ולא את הצמחים. מצד שני, נטילת משטח המפעל, במיוחד במקרה של שורשים, יכול להסיר את ציפוי פני שטח טבעי כגון ריריות ובכך לשנות את התוצאות של בדיקות הדבקות.
חשוב להיות בטוחים כי החיידק מוסיפים את הדגירה יישארו בחיים במהלך הניסוי. לכן ספירת קיימא של חיידקים חינם, כמו גם המצורף באופן שגרתי לבצעו. כמה טיפולים או מוטציות חיידקי עלולה להפחית את קצב התפתחות חיידקים או באמת לגרום למותו של שבריר של האוכלוסייה חיידקי. חיידקים מתים וחיים לא ניתן להבדיל במיקרוסקופ אלא אם כתמי מיוחדים משמשים. יש ערכת הכתם שימושי עבור חיידקים חיים/מתים אשר תלויה החרגה של צבעי מן החיידקים החיים. אם קיימת אוכלוסייה מעורבת של חיידקים ואז ספירת קיימא המינים של ריבית זאת, עשוי להיות השיטה הקלה ביותר לקבוע אם הדגירה הביאה מוות חיידקי.
קומפוזיציה בינונית השפעה הישרדות חיידקי וצמיחה. שורש תפליט וחומרים שוחרר מן הפצע ולחתוך אתרים תספק המצע לתמוך צנוע התפתחות חיידקים. פוספט, חנקן ו ברזל נוטים להיות הגבלת בתנאים אלו. קטיונים דו ערכיים כגון סידן ומגנזיום עשויים להשפיע אדהזיה. בחלק מהמקרים מקור פחמן יכול להשפיע על הדבקה. pH גם בענייני. באופן כללי ה-pH של rhizosphere הוא בין 5.5 ו- 6.5.
יש להיזהר בשימוש חיידקים שמסומנים עמידות לאנטיביוטיקה. האנטיביוטיקה הנפוצים ביותר הם ריפאמפיצין וחומצה nalidixic. עמידות לאנטיביוטיקה אלה בדרך כלל עקב מוטציות בגנים כרומוזומלית (RNA פולימראז ו gyrase, בהתאמה), ולכן לא בקלות ניתן להעביר לאמץ עוד בתקופת הדגירה. סוג זה של התנגדות גם לא תוצאה של השפלה או שינוי של האנטיביוטיקה. סימון חיידקים עם סמן גנטי בעקיצות פלסמיד אינו מומלץ אלא אם לא ניתן להעביר את פלסמיד לחיידקים אחרים. ההתנגדות לאנטיביוטיקה אסור עקב השינוי השפלה או כימית של האנטיביוטיקה כמו חיידקים רגישים לאנטיביוטיקה יוכלו לגדול על צלחות אנטיביוטי אם הם ממוקמים קרוב חיידקים עמידים.
בשיטות המתוארות במאמר זה שימושיים עבור גודל מדגם קטן ו/או ניסויים שבו הדגימות צריך להיות כלול (לדוגמה, בניסויים המערבים פתוגנים אנושי). במדגמים גדולים (מעל 100 גרם של חומר או צמחים יותר מ-50) בשיטות אחרות או שינוי דרסטי של שיטות אלה יהיה צורך10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. הנוכחות של מספרים גדולים של מיקרואורגניזמים חוץ המין נחקר יכול גם להוות בעיות משמעותיות. פתרונות אפשריים כוללים את השימוש חיידקים מסומן עם חלבון פלואורסצנטי או עמידות לאנטיביוטיקה, כפי שתואר בשלבים 6.1.2 ו- 7.3. עם זאת, כאשר החיידק עניין הם אנשים נדירים בקרב אוכלוסיה גדולה של מיקרואורגניזמים אחרים סמנים אלה לא ניתן מספיק כדי לאפשר הערכה ברורה וחד משמעית של המספרים של החיידק נחקר.
כל אחת מהשיטות המתוארות כאן הן שיטות מעבדה מבוסס. שינויים מזעריים יידרש ללימודי החממה. שינויים נוספים צפויים להיות הנדרשים ללימודי שדה שבו חד-תאיים, חרקים, בעלי חיים אחרים טריפה והאקלים וריאציה לסבך את מתן תנאים שהוגדרו עבור הניסויים. בעתיד שיטות אלה יורחב לכלול פעולת הגומלין בין שני אורגניזמים על פני הצמח.

המדד של איגוד חיידקי לשתול משטחים הפך חשוב בשלושה מצבים שונים. המצב הראשון הוא הבחינה של השידור של האדם פתוגנים צמח משטחים1,2,3. המטרה היא למנוע מחייב חיידקי או כדי להסיר או להרוג חיידקים מאוגד ובכך להפחית את העברת מחלות על-ידי חומר צמחי. המצב השני הוא הבחינה של הכריכה של פתוגנים צמח לשתול משטחים4. שוב המטרה היא למנוע מחייב או כדי להסיר או להרוג חיידקים מאוגד ובכך להפחית את המחלה. המצב השלישי הוא הבחינה של הכריכה של חיידקים סימביוטיים או צמחים-צמיחה-קידום5,6. . המטרה היא לקדם בקטריאלי מחייב ובכך להגדיל ובריאות הצמח יבול התשואות.
הטכניקות למדידת איגוד חיידקי לשתול משטחים המתוארות במאמר זה הם זול וקל יחסית לביצוע. שהדרישות היחידות במיקרוסקופ הינם חומרים הנמצאים בדרך כלל בדיקות מעבדה. עבור כמה טכניקות sonicator אמבט שימושית. מהטכניקות שתוארו מיועדים מחייב ניסויים מתבצעות בעזרת גודל מדגם קטן יחסית. מדידות של איגוד מיוצרים במעבדה, למרות שזה עשוי להיות אפשרי לשנות חלק משיטות אלה לשימוש בחממה או בשטח.
טכניקות אלה שימשו למדידת איגוד חיידקי שורשים, נבטים, עלים לחתוך לחתוך פירות, עגבניות שרי שלמות מעבדה7,8,9,10,11, 12,13,14,15. הם גם שימשו כדי למדוד שורש התיישבות צמחים גדלים בקרקע או חול מעבדה16. הטכניקות שימשו עם מינים חיידקיים רבים כולל Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli סלמונלה enterica, ו Pseudomonas fluorescens. ניתן למצוא תיאור שימושי של שיטות להערכת את האינטראקציה של א tumefaciens עם משטחי מורטון, Fuqua (2012)17. בכל המקרים גודל מדגם מעורבים היו קטנים, בדרך כלל פחות מ- 25-50 צמחים. מהטכניקות שתוארו מתאימים לשימוש עם פתוגנים אנושי אשר צריך להישמר כלולות במהלך הניסויים.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>כל</td> ניגוד פאזה <td>N/A</td><td>או אופטיקה של נומרסקי מועילים, למחקרים המשתמשים בסמנים פלואורסצנטיים נדרש מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</td></tr><tr><td>זרעים</td><td>כל&nbsp;</td><td>N/A</td><td>רשום את מספר מנת הזרעים ואת</td></tr><tr><td>האקונומיקה</td> של הזן, <td>כל</td> סוניקטור אמבטיה <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>, כל חברת אספקה מדעית</td><td>, N/A</td><td></td></tr>, <tr><td>Triton X-100</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr>, <tr><td>אגר מזין&nbsp;</td><td>דיפקו&nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>דיפקו סויה</td><td>&nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>חול</td><td>ים חול פישר סיינטיפיק</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>חול</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>קונטיינרים</td><td>Stuewe & בנים, בע"מ</td><td>קונוסים של Ray-Leach</td><td>זמינים בגדלים רבים ושונים כדי להתאים לסוג הצמח שברצונך לגדל,</td></tr><tr><td>פרפילם</td><td>, כל חברת אספקה מדעית</td>, <td>מלחי N/A</td><td></td></tr><tr><td>, MS,</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M5524</td><td></td></tr>, <tr><td>פרפין</td><td>, כל</td> צנטריפוגה <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>, כל חברה מדעית</td>, <td>N/A</td><td>כדי לגלול את רוב החיידקים, רק צנטריפוגה קטנה עם כוח מקסימלי של 10,000 XG דרוש</td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>מערבל כל חברה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעית מיקרומטר</td><td>ACCU-SCOPE אביזרים</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>סדג'וויק-קורת ספירת תא</td><td>האוזר סיינטיפיק</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה-קליפ עיתונות חותם תא אינקובטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>ריפמפיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>חומצה naladixic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>כתם חי / מת</td><td>במבחנה Bioprobes מולקולרית</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

דבקותה של חיידקים לשתול משטחים הנמדדים במעבדה

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

כתב יד זה מתאר שיטה למדידת מחייב חיידקי משטחי המפעל axenic במיקרוסקופ אור, באמצעות ספירת קיימא. צמח החומרים המשמשים כוללים שורשים, נבטים, עלים, לחתוך פירות. בשיטות המתוארות הן זולות, קל וזה מתאים גודל מדגם קטן. איגוד נמדד במעבדה, ניתן להשתמש במגוון מדיה הדגירה ותנאים. ההשפעה של מעכבי יכול להיקבע. גם יכול להיות מוערך מצבים לקדם ומעכבות מחייב. במקרים מסוימים זה אפשרי להבחין אם התנאים השונים לשנות מחייב בראש ובראשונה בגלל השפעתם על המפעל או על החיידקים.

א tumefaciens והצנרות שורש משטחים. על מנת לקבוע אם ייצור חיידקי תאית ממלאת תפקיד שורש קולוניזציה, ההשפעות של מוטציות חיידקי אשר למנוע תאית סינתזה היו בחן16. מהטכניקות שתוארו בשלבים 1.3 ו- 7.1 שימשו. זרעי עגבניות, טומטים היו פני מחוטא, מונבטים במים סטריליים. כאשר השורשים היו כ 2 ס מ היו טבול השעיה של חיידקים5 10 לכל mL, נטועים בקרקע מפוסטר במיכלים. הצמחים היו בוגרים למשך 14 ימים ב- 25 ° C על 12 שעות אור/12 h מחזור כהה. לאחר הצביעו פעמים הצמחים הוסרו מן המכולות. השורשים היו נשטפים, sonicated ב sonicator אמבט להסרת חיידקים מאוגד. מספרים חיידקי היו נחושים באמצעות ספירת קיימא. איור 2 מציג את ההשפעה של שתי מוטציות תאית-חיסור שונים על היכולת של החיידקים לישוב עגבניות שורשים. למרות סטיות תקן של כמה מדידות גבוה ככל 0.9 כניסה10 (בעיה נפוצה עם סוג זה של מדידה) צמצום באיגוד המוטציות תאית-חיסור עולה בבירור, נוכל להסיק כי ייצור חיידקי תאית מסייעת החיידקים הקולוניזציה של עגבניות שורשים.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> איור 2 : שורש קולוניזציה לפי סוג הפרוע תאית-חיסור מוטציות של tumefaciens א. יומן10 המספר הכולל של חיידקים לכל ס מ אורך הבסיס התאוששה עגבניות שורשים מחוסן עם פראי סוג tumefaciens א זן C58, מוטציות תאית-מינוס C58:1 ו- C58:A60. המספרים המוצגים הם אמצעי לפחות ארבעה ניסויים נפרדים. ברים מצביעים על סטיות תקן של האמצעים. שורשים חוסנו בטבילת אותם בהשעיה של חיידקים5 10 לכל mL במשך דקה אחת. הצמחים גדלו במיכלים, החיידקים באופן רופף חסיד הוסרו על ידי שטיפת השורשים ב שטיפת מאגר בקבוקון זכוכית. חיידקים חסיד הדוק הוסרו באמצעות sonicator אמבטיה וכתוצאה מכך התליה מצופה כדי לקבוע תא קיימא נחשב16. איור זה השתנה מ Matthysse ו McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
תפקידו של exopolysaccharides באיגוד של e. coli , חיידקים אחרים כדי נבטי אלפלפה נבדק. כמה התפרצויות של מחלת diarrheal עקב e. coli O157:H7 יש כבר לייחס נבטי אלפלפה מזוהמים. איגוד של פראי-סוג חיידקים, מוטציות לא מצליח לעשות exopolysaccharides שונות נמדדה באמצעות השיטות המתוארות שלבים 1.1, 5.1 ו- 7.2. נבטי אלפלפה היו פני מחוטא, מונבטים ליום אחד במים סטריליים 25 ° c בחושך. נבטים 4 עם מעילים הזרע מצורף הונחו במנות פלסטיק סטרילית, המכיל 5 מ ל מים. חיידקים גדל מרק לוריא נוספו ריכוז סופי של 5 x 103 לכל mL. נבטים חוסנו היו הדגירה 25 ° c בחושך למשך 3 ימים. הנבטים היו לשטוף פעמיים ב 5 מ ל מים סטריליים בקבוקון על-ידי היפוך נמרצת, הומוגני ב שטיפת המאגר באמצעות מהמגן זכוכית מבוססת על מנוע של טפלון. ניסויים קודמים באמצעות חיידקים שמסומנים פלסמיד נושא גן ה-GFP הראה אין בקטריות למביטה למרות משטח חיידקים נצפו בקלות. התוצאות מוצגות בטבלה1. נבדקו שני זנים של החיידק O157:H7. לשני הזנים הופיעה הייצור של poly-β-1, 6-גלוקורונית acid(PGA) כדי לבצע את התרומה הגדולה הכריכה של פתוגניים החיידק לשתול משטחים. שטיפת המעי הגס חומצה גם מילא תפקיד משמעותי באיגוד. בזמן הירידה מחייב בתאית-חיסור מוטציות היה משמעותי לא היה גדול כמו זה עבור שני סוכרים אחרים.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">ההשפעות של מוטציות בגנים הפקה Exopolysaccharide על כריכה של אי O157:H7 קולי כדי נבטים ומעילים זרע פתוח</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">זן חיידקי</td>
			<td rowspan="2">מוטציה או גנוטיפ (רלוונטי פנוטיפ)</td>
			<td colspan="2">יומן מספר10 של חיידקים מאוגד לכל נבט או זרע המעיל</td>
		</tr>
<tr>
<td>נבטי אלפלפהb
</td>
			<td>מעילים זרע פתוח</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>אף אחד (סוג הפרוע)</td>
			<td>4.7 ± 0.6</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (תאית-מינוס)</td>
			<td>2.9 ± 0.7c
</td>
			<td>3.5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624C</td>
			<td>
wcaD (חומצה חוקן-מינוס)</td>
			<td>1.8 ± 0.7c
</td>
			<td>2.4 ± 0.5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>P 8624</td>
			<td>
pgaC (PGA-מינוס)</td>
			<td>&lt; 1.0c
</td>
			<td>± 1.0 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>אף אחד (סוג הפרוע)</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
			<td>6.1 ± 0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (תאית-מינוס)</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
			<td>4.1 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (חומצה חוקן-מינוס)</td>
			<td>3.9 ± 0.5c
</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-מינוס)</td>
			<td>&lt; 1.0c
</td>
			<td>1.2 ± 0.7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">זאת אומרת ± סטיית תקן של מינימום של שלוש מדידות של המספר (יומן10) של חיידקים מאוגד לאחר 3 ימים.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b נבטים נשטפו לפני המדידה.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c שונה באופן מהותי מן הסוג הפרוע: P &lt; 0.01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">שונה באופן משמעותי מן הסוג בר d: P &lt; 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: ההשפעות של מוטציות בגנים הפקה exopolysaccharide על הכריכה של E. coli O157:H7 כדי נבטים. על מנת לקבוע את התפקיד של exopolysaccharides השונות ליפופוליסכריד באיגוד של פתוגניים החיידק זנים O157:H7 כדי נבטי אלפלפה, הכריכה של קבוצת מוטציות נבטים, מעילים זרע פתוח נבדקה באמצעות השיטות תיאר בשלב 6. התוצאות הראו כי פולי-ß-1, 6 -N-acetyl-D-גלוקוזאמין (PGA) שנראה חיוני מחייב נבטים, כי חומצה תאית והן colanic נדרשים עבור איגוד המרבי של e. coli O157. טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.
על מנת לקבוע אם הייצור של PGA הוא מספיק כדי לגרום את איגוד חיידקי לשתול משטחים, פלסמיד (pMM11) נושאת את אופרון משובטים קידוד הגנים הדרושים עבור PGA ייצור הוכנס שני חיידקים שונים אשר לא בדרך כלל תוכל לאגד עגבניות שורשים10. Tumefaciens א A1045 הוא מוטנט של המתח פראי סוג C58 אשר נכשל ביצירת גלוקן מחזורית-β-1, 2, נכשל גם לאגד לשתול משטחים29. Sinorhizobium meliloti 1021 המהווה פקעיות על אספסת נכשל לאגד ללא קטניות כולל עגבניות12. השיטות המתוארות שלבים 1.1, 5.1, 6.3 ו- 7.1 שימשו כדי לקבוע אם היכולת לגרום PGA בדרך כלל מוגברת איגוד חיידקי שורש משטחים. זרעי עגבניות, טומטים היו פני מחוטא, מונבטים במים סטריליים. שורשים היו חותכים למקטעים 1 ס מ אורך והושמו במים סטריליים, החיידקים חוסנו. ככל ששני המינים האלה של חיידקים גדלים בקצב שונה, איגוד נמדדה בזמנים שונים כדי לאפשר שווה בערך כמויות של התפתחות חיידקים. הנוכחות של pMM11 פלסמיד נגרמת עלייה משמעותית דומה במספר של חיידקים מאוגד של שני מינים (טבלה 2)10. עלייה משמעותית באיגוד נראתה גם במיקרוסקופ אור אך האיגוד היה מאוד שונה אצל שני המינים (איור 3). Tumefaciens א A1045 מאוגדים כמו בודדים חיידקים פני השורש. Meliloti ס מאוגדים באשכולות גדולים שבהם רק אחדים של החיידק היה מחובר ישירות לספריית הבסיס של רוב החיידקים צורפו לחיידקים אחרים. דוגמה זו מראה כי פשוט לנתח את המספרים של חיידקים מאוגדים ללא כולל תצפיות מיקרוסקופיות יכול לתת רושם מטעה של תוצאות ניסוי. למרות שתי השיטות (ספירת קיימא ותצפיות מיקרוסקופיים) להציג שאת pMM11 מוגבר מחייב חיידקי לשורשים עגבניות, סוג הכריכה הנגרמת על ידי הייצור של PGA היה שונה אצל שני המינים חיידקי10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">השפעת pMM11 פלסמיד על איגוד של החיידק לשורשים עגבניות</td>
		</tr>
<tr>
<td>זן חיידקי</td>
			<td>פלסמיד</td>
			<td>מספר החיידקים מאוגד לכל אורך השורש מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>א tumefaciens A1045
</td>
			<td>אף אחד</td>
			<td>0.25 x3 10 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (וקטורית)</td>
			<td>0.25 x3 10 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (סינתזה PGA)</td>
			<td>10 x 10-3 -± 0.25 x 10-3
</td>
		</tr>
<tr>
<td>ס meliloti 1021b
</td>
			<td>אף אחד</td>
			<td>אף אחד לא זיהה</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (וקטורית)</td>
			<td>אף אחד לא זיהה</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (סינתזה PGA)</td>
			<td>50 x 10-3 -± 5 x 10-3
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">איגוד חיידקי, נמדדה לאחר שעתיים</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b איגוד חיידקי היה מדד אחרי 18 שעות</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: השפעת פלסמיד נושא הגנים לסינתזה של PGA על הכריכה של Tumefaciens א A1045, meliloti ס 1021 אל פלחי עגבניה שורש. כדי לבחון את היכולת של פולי-ß-1, 6 -N-acetyl-D-גלוקוזאמין (PGA) כדי לקדם את הכריכה של חיידקים לטעת שורשים, השפעת פלסמיד היוועצות היכולת לגרום PGA (pMM11) על הכריכה של שני זנים של חיידקים הקשורים צמח עגבניות שורשים נבדק. גם זן של חיידקים הראו משמעותי מחייב לשורשים עגבניות בהיעדרו של פלסמיד או בנוכחות של פלסמיד ללא הגנים קידוד PGA סינתזה (pBBR1mcs). התוספת של פלסמיד נושא הגנים סינתזה PGA גדל לכריכה על ידי שני סוגי חיידקים. כי tumefaciens א גדל מהר יותר meliloti ס מחייב נמדדה אחרי שעתיים של דגירה עבור tumefaciens א ואחרי 18 h עבור ס meliloti. הטכניקות בשימוש הם מהמתואר בשלב 7. טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> איור 3 : השפעת pMM11 פלסמיד נושא הגנים ביוסינטזה PGA על הכריכה של A1045 tumefaciens א ו ס meliloti 1021 כדי שערות השורש עגבניות. A1045 tumefaciens א מחייב עגבניות שערות השורש של A), B) A1045 tumefaciens א pMM11, C) meliloti ס 1021, ו- D) pMM11 ס meliloti 1021. למרות העלייה קשירה של שני המינים חיידקי הוא בערך דומה בפרטים של האיגוד כפי שנראה במיקרוסקופ אור מעט שונים. הטכניקות בשימוש הם מהמתואר בשלב 6. איור זה השתנה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
זה לפעמים ניתן להשתמש מחייב הלא-ביולוגיים משטחים לסייע בהבחנה התרומה של החיידקים, של הצמח באינטראקציה מסוימת. Polysaccharide(UPP) unipolar של tumefaciens א הוכח כדי להיות מסוגל לתווך איגוד חיידקי למגוון של שני משטחים ביולוגי, הלא-ביולוגיים30. הסידן נצפתה כדי לעכב את הכריכה של tumefaciens א לשתול משטחים בתיווכו של UPP28. על מנת לקבוע עיכוב על ידי יונים של סידן של איגוד חיידקי לשתול משטחים עקב אפקט על החיידק או על פני הצמח, נבחנה הכריכה של חיידקים חוטי ניילון. הטכניקות מתאר בשלב 8.2 שימשו. זרעי עגבניות, טומטים היו פני מחוטא, מונבטים במים כפי שמתואר בשלב 1. החיידקים היו גדל בינונית מזערי עם סוכרוז, להוסיף עגבניות שורשים או חוטי ניילון-ריכוז סופי של 10 /mL5כפי שמתואר בשלב 5.1. השפעת CaCl הוסיף2 על איגוד חיידקי עגבניות שורשים, חוטי ניילון נבדק במיקרוסקופ. איור 4 מראה של עיכוב דומה של איגוד על ידי סידן באמצעות או משטח רומז ההשפעה של סידן היא בעיקר על חיידקים10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> איור 4 : ההשפעה של סידן על הכריכה של tumefaciens א שערות השורש עגבניות, חוטי ניילון. Tumefaciens א , נדגרה עם שורשים עגבניות (A ו- B) או חוטי ניילון (C ו- D) במשך 24 שעות ביממה ב- 1:10 דילול של מלחי MS ו- 1:20 דילול של AB בינונית מזערי, 0.4% סוכרוז (A ו- C) או ב- 1:10 דילול של מלחי MS ו- 1:20 לדילול בינונית מזערי אלב , 0.4% סוכרוז המכיל 60 מ מ CaCl2 (B ו- D)31. CaCl הוסיף2 עכבות איגוד חיידקי שורשים והן חוטי ניילון רומז כי עיכוב היה בעיקר בשל אפקט על החיידק ולא על השטח המפעל. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

שיטה קלה עבור מדידה ואפיון הידבקות חיידקים לצמחים, בעיקר שורשים ונבטים, המתוארת במאמר זה.

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות במדד קשירת חיידקים למשטחי הצמח. שיטה זו יכולה לענות על שאלות חשובות הן בפתולוגיה של הצמח והן בבטיחות המזון. בפרט, הוא יכול לענות על שאלות לגבי האופן שבו חיידקים נקשרים למשטחי צמחים וכיצד ניתן להסיר אותם.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה, מהירה וזולה. להכנת שתילים הגדלים במים, הניחו מספר קטן של זרעים בכוס זכוכית של 30, 50, 100 או 150 מיליליטר. כאן משתמשים בזרעי עגבניות.מכסים את הזרעים באתנול 80% ומערבבים קצרות. לאחר מכן תנו לזרעים להשרות דקה אחת. יוצקים את האתנול וטובלים את הזרעים בתמיסה של 50% אקונומיקה מסחרית ו-0.1% טריטון X-100 ומי ברז.הניחו לזרעים להשרות במשך 20 דקות או יותר אם הזרעים גדולים, כמו זרעי שעועית. יוצקים את תערובת האקונומיקה ושוטפים את הזרעים שלוש פעמים במים סטריליים, ונותנים לזרעים להשרות במים למשך דקה אחת לכל שטיפה. שופכים את הזרעים וכמות קטנה של מים לצלחת פטרי סטרילית ודוגרים את הזרעים בחושך עד שהשתילים מגיעים לגודל הרצוי, בין סנטימטר אחד ל -10 סנטימטרים.להכנת זרעים או שתילים הגדלים בחול, לאחר עיקור הזרעים וחומרי השתילה יש לחסן את הזרעים או השתילים בחיידקים על פי פרוטוקול הטקסט. בעזרת מוט זכוכית סטרילי, צרו חור רדוד בחול עמוק מספיק כדי להניח את הזרע מתחת לפני השטח. מניחים את הזרע בחור ומכסים אותו בשכבה דקה של חול.לאחר מכן השתמש בסרט איטום כדי לאטום את החלק העליון של המיכל כדי למנוע אובדן מים וכניסה של חיידקים נוספים. לגדל את הצמחים במעבדה תחת אור או בחממה בטמפרטורה ואורך יום מתאימים למין ולמגוון הצמחים. שתלו את השתילים בחול.השתמש במוט זכוכית סטרילי כדי ליצור חור. לאחר מכן, בעזרת וו סרוגה סטרילי מנירוסטה, הנח את השורש בזהירות לתוך החור והשתמש בחול כדי למלא את דפנות החור. לאחר דגירה של צמחים עם חיידקים על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו דגימה למיקרוסקופיה על ידי הנחתה בטיפת מים או מדיום דגירה על שקופית מיקרוסקופ והתבוננו בה ישירות.אם אין חיידקים חופשיים נראים לעין, ייתכן שהיה מוות חיידקי או קשירה חיידקית למיכל בו בוצעה הדגירה. שטפו את הדגימה במים או במדיום דגירה על ידי הנחתה בבקבוקון נוזל והיפוך עדין של הבקבוקון. לאחר מכן הנח את הדגימה על שקופית המיקרוסקופ בנוזל טרי לתצפית.כדי להרכיב את המדגם השתמש בתלוש כיסוי רגיל. אם הדגימה סמיכה ויוצרת בליטה, הוסף את הנוזל והדגימה לבאר של מכבש, החל החלקת כיסוי שיש לה טבעת גומי או פלסטיק סביב הקצה. הנח את השקופית למעלה ולחץ כלפי מטה בעדינות כדי לאטום את החלקת הכיסוי למגלשה.הפוך את השקופית כדי לבחון את הדגימה. לחלופין, השתמש בשקופית ספירת אצות ובהחלקת כיסוי באופן דומה וצפה בהגדלה של לא יותר מפי 20. כדי לקבוע את מספר החיידקים בני הקיימא שנמצאו לצמחים הגדלים בחול, התחל בהסרת חומר האיטום מהחלק העליון והתחתון של המיכל.הניחו את המיכל על פיסת נייר סטרילית ודפקו בעדינות את המיכל על פני השטח כדי לשחרר את החול לפני שמרימים בעדינות את החול עם הצמח מהמיכל. כאשר גליל החול והצמח חופשיים על הנייר, פצלו את החול באמצע כדי לחשוף את שורש הצמח. אם תרצה, קח דגימות של החול מסמוך לקצה המיכל כמו גם ליד השורש.זה עשוי להיות שימושי כדי לקבוע את ההתפשטות, ההצטברות והצמיחה של חיידקים. הרם את השורש והסר את החול והחיידקים שנדבקים באופן רופף על ידי טבילת השורש בנפח מדוד של מים או חיץ וניעור עדין. קבע את ספירת התאים בת הקיימא של החיידקים בתרחיף שנוצר על ידי ציפוי על מדיומים מתאימים כגון לוריא אגר.זה מייצג את מספר החיידקים הקשורים באופן רופף לשורש. לבסוף, הסר את החיידקים הקשורים היטב על ידי סוניקציה וקבע את מספרם. הגרף הזה מראה את ההשפעה של שתי מוטציות שונות של תאית מינוס על יכולתם של החיידקים להתיישב בשורשי עגבניות.למרות שסטיות התקן של חלק מהמדידות היו גבוהות עד 0.9 בסיס לוג של 10, הירידה בקישור של התאית מינוס מוטציות ניכרת בבירור. בניסוי זה נמדדה הקישור לנבטי אספסת מסוג בר E.Coli 0157:H7 במוטאנטים שאינם מסוגלים לייצר אקסופוליסכרידים שונים. בשני הזנים, נראה כי הייצור של חומצה גלוקורונית פולי-בטא אחת שש, או PGA, תרם את התרומה הגדולה ביותר לקשירת E.coli פתוגני למשטחי הצמח.חומצה קולנית מילאה גם תפקיד משמעותי בכריכה. כאן הונדסו שני זני חיידקים שאינם מסוגלים להיקשר למשטחי הצמח כדי לייצר PGA כדי לקבוע אם זה מספיק כדי לגרום לקשירת חיידקים לשורשי עגבניות. במקרה של A.tumefaciens A1045, PGA גרם לחיידקים להיקשר בנפרד לפני השטח של השורש.לעומת זאת, S.meliloti נקשר באשכולות גדולים, שבהם רק מעט מהחיידקים היו מחוברים ישירות לשורש, ורוב החיידקים היו מחוברים לחיידקים אחרים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעה להתקנה ראשונית, בתוספת זמן דגירה, ובין 10 דקות לשעה זמן ניקוד, תלוי במדגם. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שחיידקים יכולים להיצמד כמעט לכל משטח.לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לצפות בקשירת חיידקים למשטחי הצמח. קבע היכן בצמח החיידקים נקשרים וקבע את מספר החיידקים הקשורים. אל תשכח שאם אתה מבצע נהלים אלה עם פתוגנים אנושיים, ההליך יכול להיות מסוכן ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כמו עבודה במכסה המנוע ולבישת כפפות.

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

פרוטוקול זה הוא פשוט assay הידבקות חיידקים המורכב לספור את המספרים של המושבה חיידקי הקמת יחידות כי הם דבקו על תאים בתרבית. Assay היא חזקה, עצמאית של adhesin למד, וכן וריאציות רבות משמשים ברוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

בתהליך ההדבקה, צעד מפתח הוא הדבקה של פתוגנים עם תאים המארח. ברוב המקרים שלב זה הידבקות מתרחשת בנוכחות הלחץ המכני שנוצר על ידי זרימת נוזל. אנו מתארים טכניקה מציגה הלחץ גזירה כפרמטר חשוב במחקר של הידבקות חיידקים.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

העיצוב של קידוד סינטטי אופרון גם מנגנון ההפרשה ומונומרים המבניים של סיבי curli מתואר. ייצור יתר של amyloids אלה ופולימרי חסיד מאפשר מדידת רווח של היצמדות...

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

מקור: Matthysse, A. G. היצמדות חיידקים למשטחי צמחים שנמדדה במעבדה. J. Vis. Exp. (2018).הסרטון הזה מדגים את הערכת ההיצמדות החיידקית לשורשי הצמח באמצעות מיקרוסקופ פאזה-ניגודיות. דגימות שורשים משתילים שדגרו עם חיידקים מורכבות תחילה כדי לבדוק אם יש חיידקים חופשיים. הדגימות נשטפות להסרת חיידקים שמחוברים ברפיון ומותקנות מחדש באמצעות כיסוי מתאים למניעת נזק. לבסוף, מספר החיידקים המחוברים לשערות השורש נספר תחת מיקרוסקופ.

הערכה מבוססת מיקרוסקופיה של היצמדות חיידקים למשטחי שורשי הצמחים

מקור: Matthysse, A. G. היצמדות חיידקים למשטחי צמחים שנמדדה במעבדה. J. Vis. Exp., (2018)סרטון זה מדגים פרוטוקול למדידת התיישבות שורשים של שתילי עגבניות על ידי חיידקים פתוגניים מסוג בר וחסרי תאית. ספירות חיוניות של חיידקים הדביקים היטב מראות הידבקות גבוהה יותר ויצירת מיקרוקולוניות על ידי הזן הפראי, מה שמדגיש את תפקיד התאית ביציבות התיישבות שורשים.

הערכת התיישבות שורשים של שתילי עגבניות על ידי חיידק פתוגני באמצעות ספירות תאים ברות קיימא

מקור: האריס, ס. ל. ואחרים. ניטור קולוניזציה ותחזוקה של חיידקים בשורשי Arabidopsis thaliana במערכת הידרופונית צפה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים פרוטוקול למעקב אחר התיישבות חיידקים הקשורים לשורשים על שתילי Arabidopsis thaliana שגדלו במערכת ללא קרקע. לאחר הקולוניזציה, החיידקים מופרקים באמצעות סוניקציה, מדוללים, מצופים ומודגרים ליצירת מושבות המשקפות את ההתקשרות והחיוניות של חיידקים.

ניטור קולוניזציה חיידקית של שורשי Arabidopsis thaliana במערכת ללא קרקע

סרטון זה מדגים את בדיקת היצמדות החיידקים להערכת היצמדות חיידקים המתויגים ב-GFP לתרבית תאי אפיתל כדי לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות מארח-פתוגן באמצעות הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

זיהוי היצמדות חיידקים לתאים מארחים באמצעות דימות פלואורסצנטי

התקשרות חיידקית לתאי מארח היא שלב מפתח במהלך קולוניזציה וזיהום של המארח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של הידבקויות רקומביננטיות מצומדות פולימר כחומרים ביומימטיים המאפשרים ניתוח של תרומתם של הידבקויות בודדות לתהליכים אלה, ללא תלות בגורמים חיידקיים אחרים.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

כאן אנו מתארים ידרופוני צמח שיטת הצמיחה כדי נוכחות המינים ככמת ולהמחיש את התפלגות מרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברתם לסביבות צמיחה שונות.

ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

התיישבות של ריזובקטריה מעודדת גדילה של צמחים (PGPR) בריזוספרה חיונית להשפעתו מעודדת הצמיחה. יש צורך לתקנן את שיטת הזיהוי של התיישבות ריזוספרה חיידקית. במאמר זה אנו מתארים שיטה הניתנת לשחזור לכימות התיישבות חיידקים על פני השטח של השורש.

מדידת התיישבות חיידקים על שורשי Arabidopsis thaliana במצב הידרופוני

למד שיטה פשוטה למדידת דבקות חיידקים לשורשי צמחים ונבטים. טכניקה זו מהירה, זולה ויעילה למחקר בפתולוגיית צמחים ובטיחות מזון.

דבקותה של חיידקים לשתול משטחים הנמדדים במעבדה

גלה סרטונים נוספים