Name: תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: למדו כיצד למדוד חצי חיים של חלבונים בתאים חיים ברמת תא בודד באמצעות SNAP-tag ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה זמן-מעבר. השיטה מאפשרת לחקור את ההטרוגניות בתחלופת חלבונים באוכלוסיית תרביות תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מיקרוסקופ זמן לשגות הניסויים בוצעו ב למערכות ביולוגיות הקרנת מתקן (BSF), EPFL. אנו מודים מארק Delachaux (שירות Audiovisuel, EPFL) של צילום וידאו ועריכה של הסרט.

הערה: במחקר זה, הקו תא E14 ES שימש. עם זאת, פרוטוקול זה ישימה ישירות על כל העכבר ES תא קו אחר ביטוי חלבון עניין דבוקה תג SNAP, על-ידי תיוג החלבון אנדוגני או באמצעות ביטוי. על הדוגמאות המוצגת במקטע תוצאות, שימשו דוקסיציקלין-inducible SNAP-תג פיוז'ן תא קווים (SNAP-תג דבוקה החלבונים הבאות: Nanog, Oct4, Srsf11, או חלבונים פלורסנט mOrange2, sfGFP ו- put תחת השליטה של דוקסילין-inducible יזם. ראה11 למידע נוסף פלסמידים משמש את הדור של הקווים תא דוקסיציקלין-inducible SNAP-תג fusion). דוקסילין-inducible המערכת יכול להיות שימושי במיוחד, שכן היא מאפשרת לפיקוח הדוק על התזמון והעוצמה של הביטוי של החלבון עניין. C-מסוף מיצוב של הצמד-התג מומלץ, כמו שינוי של N-מסוף רצף חומצות אמיניות סביר יותר לשנות את half-life של החלבון היעד (N-end כלל12).
1. E-קדהרין ציפוי ו תא זריעה
<ol><li>ליצור קו תא ES ביטוי חלבון עניין דבוקה SNAP-תג4.</li>
	<li>מעיל 100 מ מ תא תרבות מנות עם 4 מ"ל של ג'לטין 0.1% (מדולל בפוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ללא Ca2 +/Mg2 +) עבור ה 1 הסר ג'לטין לתת להתייבש במשך ה 1 השתמש באופן מיידי או לאחסן את הכלים מצופים עד 2 חודשים.</li>
	<li>לגדל את שורת התאים עניין ב- ES תא תרבות בינוני (גלאזגו מינימום הכרחי בינוני, בתוספת 10% ES מוסמך התא העוברי שור סרום, פירובט נתרן 2 מ מ, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין, 100 מיקרומטר 2- mercaptoethanol, לוקמיה מעכבות פקטור (LIF), מיקרומטר 3 CHIR99021, מיקרומטר 0.8 PD184352) על מנות מצופים ג'לטין-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 2 ימים עד שהגיע זרימה של 10-20 תאים Mio לכל תבשיל. הערה: כאן, LIF הופק על ידי תרביות תאים ארעית של תאים 293T HEK, ואחריו supernatant איסוף וסינון. כל אצווה של LIF נבדקה הפוטנציאל לשמור על pluripotency, אך לא נקבעו ריכוזים. עם זאת, LIF רקומביננטי גם זמינים מסחרית, ריכוז משמש בדרך כלל תרבית תאים העכבר ES הוא 1000 יחידות/mL13.</li>
	<li>מעיל צלחת 96-ובכן מתאים הדמיה עם 30 µL של העכבר רקומביננטי E-קדהרין Fc כמירה חלבון (E-cad-Fc) ליום טוב (5 ng/µL, מדולל ב- PBS עם Ca2 +/Mg2 +. השתמש מניות ריכוזי 100 ng/µL, המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס). הימנע pipetting מקיף, כמו E-cad-Fc שברירית מאוד. דגירה ב 37 ° C עבור 1.5 h. הערה: בהתאם המיקרוסקופ, פורמטים אחרים עשויים לשמש.</li>
	<li>האחות של E-cad-Fc, לשטוף פעם עם µL 100 ל- PBS עם Ca2 +/Mg2 +ולהוסיף 100 µL מראש ומחוממת ES תא תרבות בינוני.</li>
	<li>לשטוף את התאים עניין עם 5 מ של PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. האחות ולהוסיף 2 מ של טריפסין-EDTA 0.25%. תקופת דגירה של 4 דקות ב 37 º C. להוסיף 4 מיליליטר ES תא תרבות בינוני, resuspend ספין למטה ב- 1000 g x עבור 4 דק לשאוב תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 2 מיליליטר טריים ES תא תרבות בינוני. הערה: PBS ללא Ca2 +/Mg2 + אמור לשמש לניקוי התאים לפני trypsinization על מנת להסיר Ca2 + יונים, אשר נדרשים עבור תא אדהזיה. לעומת זאת, ה-cad-Fc דילול ציפוי (שלב 1.4), ולהשתמש PBS עם Ca2 +/Mg2 +, מאז הידבקות תאים ES E-cad-Fc מנות מצופה היא Ca2 +-תלויים14.</li>
	<li>לדלל את התאים resuspended 1:10 ב 1 מ"ל של ES תא תרבות בינונית, ספירה, באמצעות חדר הספירה (עומס 10 µL עבור תא של 0.1 מ מ עומק).</li>
	<li>זרע תאים 30,000/cm2 ב- E-cad-Fc מצופה צלחת הדמיה. למלא עד 200 µL לכל טוב עם ES תא תרבות בינוני. עבור שורות תאים דוקסיציקלין-inducible, זירוז עם המינון המתאים של דוקסיציקלין (מיטוב מינון ותזמון של מראש את תנאי הגיוס. הקווים התא המשמש כאן טופלו ng/mL 500 דוקסיציקלין 24 שעות לפני הדמיה). דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 והמשך עם דופק תיוג והדמיה 24 שעות לאחר תא זריעה.</li>
</ol>2. דופק תיוג של הצמד-תג
הערה: לניסויים דעיכה חלבון חשוב להשתמש ריכוז לצבוע נאותה של הצמד. הריכוז צריך להיות גבוה מספיק להניב אות בהיר בתחילת מואץ, כמו ידי קרינה פלואורסצנטית יתמעטו עם הזמן. עם זאת, שימוש ריכוזי צבעים גבוה מדי עלול לגרום לצבוע שיורית להישאר בטווח הבינוני או בתאים גם לאחר כביסה. לצבוע חינם אולי לאחר מכן לאגד החדש מיוצר מולקולות SNAP-תג במהלך הסרט, יעוות את עקומת דעיכה. האות פלורסצנטיות שנצפה תלויות מאפייני לצבוע, את שורת התאים בשימוש, כמו גם את רמת הביטוי של החלבון המתאים. לכן, זה הכרחי למטב את הריכוז צבע על-ידי בדיקת דילולים שונים, החל מדילול הציע עבור הדמיה תא בשידור חי על ידי היצרן. במחקר זה, שימשה מצע פלורסנט מרחיקת אדום. ריכוז האופטימלית 12 ננומטר נקבע עבור שורות תאים דוקסיציקלין-inducible ביטוי.
<ol><li>לדלל לצבוע SNAP כדי הריכוז המתאים במדיום התרבות תאים ES ומחוממת מראש. השתמש פיפטה להסיר בעדינות את המדיום התאים בעבר נזרע בצלחת 96-ובכן ולהוסיף 50 µL של צבע מדולל SNAP לכל טוב. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>וארוקן את צבע מדולל עם פיפטה ולשטוף 3 x עם µL 200 ל- PBS ומחוממת מראש (ללא Ca2 +/Mg2 +). להוסיף 200 µL ES תא תרבות בינוני ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>חזור על השלבים הקודמים כביסה עוד פעמיים. הערה: כביסה רב חשוב כדי להסיר את כל צבע לא מאוגד. השלבים כביסה חוזרות עם PBS להסיר את שאריות הצבע חוץ-תאית במדיום, ואילו incubations 15 דקות להבטיח תיוג חזקים של החלבונים פיוז'ן SNAP-תג לפני הפעלת הניסוי הדמיה. עם זאת, בצע את השלבים כביסה מאת pipetting עדין, אל תשתמש של העצמות אוטומטיים, כמו תאים נזרע על E-cad-Fc נוטים לנתק בקלות.</li>
	<li>להוסיף 200 µL הדמיה בינוני. כדי להפחית את הרקע פלורסצנטיות, השתמש פנול אדום בינוני חינם (בתוספת 10% ES מוסמך התא העוברי שור סרום פירובט נתרן 2 מ מ, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין, 100 מיקרומטר מרקפטואתנול, LIF, 3 מיקרומטר CHIR99021 ו- 0.8 מיקרומטר PD184352).</li>
</ol>3. זמן לשגות מיקרוסקופ
<ol><li>השתמש מיקרוסקופ מתאים הדמיה בשידור חי, ומאפשר טמפרטורה מבוקרת ו- CO2. הגדר את הטמפרטורה 37 ° C ו CO2 כדי 5% מראש להשתמש ולאפשר כדי equilibrate עבור h 1-2.</li>
	<li>למקם את הצלחת לתוך המיקרוסקופ, למצוא מקומות מתאימים עבור הדמיה. בחר כתמים התאים איפה המפוזרים באופן שווה, אבל לא יותר מדי צפוף, כמו זה יקל את הניתוח. להתאים את מספר הנקודות שנבחרו על מספר התאים הנדרש לניתוח. במחקר זה, נרשמו 3-5 נקודות לכל שורת התאים.</li>
	<li>בחר את המטרה. מטרה X 20 מתאים לגודל של תאים ES.</li>
	<li>בחר את הגדרות תאורה עבור פרופיל פלורסנט שיירשמו. להתאים את עוצמת הלייזר ואת חשיפה על פי עוצמת האות פלורסצנטיות מתאי עניין. הקפד להשיג קליטה ראשונית חזקה, מאז זה להקטין במהלך הסרט, אבל להימנע לייזר כוחות גבוה מ 30% על מנת למזער את phototoxicity ואת photobleaching. במחקר זה, מסנן עירור של 632/22 ננומטר (גל/bandpass), מסנן פליטה של 679/34 nm (גל/bandpass), עוצמת הלייזר של 10% וזמן חשיפה של 100 ms שימשו.</li>
	<li>בחר את מרווחי והמשך הדמיה של הניסוי זמן לשגות. החלבונים עם מחצית החיים הצפוי של h 2-20, בחר רכישת פעמים של 12-24 h עם מרווחי זמן של 15 דקות. חלבונים shorter-lived, להפחית את מרווחי ואת רכישת פעמים, להגדלת חלבונים longer-lived בהתאם.</li>
	<li>להתחיל הדמיה.</li>
</ol>4. התמונה עיבוד וניתוח
<ol><li>לאסוף את התמונות הנרכש ככל בערימה בתבנית tiff. ניתוח ועיבוד נוסף, לשימוש של תוכנות פיג'י15. אם זמן לשגות לא איסוף הנתונים כמו ערימה על ידי תוכנת מיקרוסקופ, פתח כל המסגרות של הניסוי זמן לשגות בתוכנה (או על ידי לחיצה על קובץ | לפתוח... או גרירה של יורד הקבצים המתאים לסרגל הכלים) ולחצו על התמונה | ערימות | תמונות לערום.</li>
	<li>השתמש בפונקציה רקע הפחת כדי להסיר את הרקע של כל התמונות במחסנית. לשם כך, לחץ על תהליך | להחסיר את הרקע. בחר את רדיוס הכדור מתגלגל בחלון המוקפץ. השתמש רדיוס זה לפחות בגודל של התאים עם תמונה. כדי להחיל רקע חיסור על כל התאים במחסנית, בחר כן ב תהליך מחסנית? חלון מוקפץ.</li>
	<li>בחר תא עניין וצייר אזור עניין (ROI) סביב זה באמצעות סרגל הכלים. עבור אותות גרעינית, השתמש הבחירה אליפסה מאת הראשון לחיצה על הלשונית המתאימה בסרגל הכלים ואז לחיצה על הגרעין של עניין, התאמת את האליפסה סביבו. עבור אותות cytoplasmic או אזורים צפופים מאוד להשתמש הבחירה ביד חופשית כדי להיות מסוגל לעקוב מקרוב את קווי המתאר של התא. הימנע כולל אזורים גדולים מדי של רקע, למרות שזה לא הכרחי לעקוב אחר קווי המתאר תא בדיוק בגלל חיסור עוקבות של רקע כל הפיקסלים (שלב 4.8 4.9).</li>
	<li>להוסיף את האזור של ריבית למנהל רועי בלחיצה נתח | כלים | רועי מנהל | להוסיף, או על-ידי הקשה על T על המקלדת.</li>
	<li>המשך למסגרת הבאה על-ידי הזזת הכרטיסיה בחלון מחסנית או על-ידי הקשה על shift + &lt; במקלדת, ואז לחזור על הפעולות הקודמות. בצע את התא של עניין לאורך כל הקורס של הסרט ולהוסיף ההחזר של כל מסגרת מנהל רועי. להציל את רועי הסופי להגדיר עבור כל תא מסומנים על-ידי לחיצה על יותר | שמור. במנהל ROI. הערה: לאחר חלוקות תאים, לעקוב אחר שני תאי הבת בנפרד, לסכם את עוצמות משולב שלהם לאחר רקע חיסור (ראה שלבים 4.6-4.9) לקחת בחשבון חלבון דילול במהלך חלוקת התא. שמור את ערכות ROI עבור שני תאי הבת.</li>
	<li>לאחר התא עניין מתבצע לאורך כל הסרט, לחץ על מידה, כדי לקבל ערכים של ROIs עוצמת רשע ואזור. להעתיק את הערכים שהושג לתוכנית גליון נתונים אלקטרוניים, לחשב את עוצמת משולב raw של התא עבור כל הזמן-נקודה כדלקמן: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> איפה מתכווןcזה את העוצמה רשע,שטחCהאזור של רועי המתאימים.</li>
	<li>כדי להעריך את הרקע מקומיים, להוסיף רועי ליד התא עניין לכל מסגרת זמן. הימנע כולל קליטה סלולרית קרינה פלואורסצנטית. השתמש רועי מעגלי זה בערך בגודל של תא, להזיז או לכווץ את זה בהתאם. במידת הצורך, למשל אם התאים הסמוכים להתערב. המשך כמתואר קודם לכן עם הטלפון הסלולרי רועי להגדיר כדי לקבל רקע רועי להגדיר ולהעתיק את ערכי העוצמה נמדד הגיליון.</li>
	<li>כדי לקבל ערך מתוקן-רקע על עוצמת משולב של התא, תחילה לחשב את עוצמת משולב של הרקע עבור כל נקודת-זמן: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> מתכווןBG איפה העוצמה אכזרי של רקע אות ו שטחC הוא האזור של רועי המקיפות את התא. אל תשתמש/י את האזור של רקע רועי, אלא אם כן בשני התחומים יש באותו הגודל.</li>
	<li>חישוב סופי המופחת-רקע משולב האינטנסיביות של התא עבור כל נקודת זמן: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>לנרמל את עקומות דעיכה של תא בודד, לחלק את הערך בעוצמה של כל הזמן-נקודה לפי הערך בעוצמה של נקודת-בפעם הראשונה. הערה: ההתאמה עקומה (ראה שלב 4.11) ניתן גם לבצע על כל תא בודד או על ממוצע האוכלוסייה. נורמליזציה נדרש אם מחושב ממוצע של אוכלוסייה בהתבסס על מנת למנוע הטיות של עוצמות קרינה פלואורסצנטית שונה בין תאים. נירמול ובכך מבטיחה כי כל תא תורם עם אותו משקל, עיקול דעיכה הסופי. בנוסף, נירמול יכול להיות שימושי להמחיש את נרקב תא בודד ללא תלות עוצמות קרינה פלואורסצנטית המוחלט שלהם (ראה דמויות 3A-3 C). אולם, אם רק מתא בודד מחצית החיים נקבעים, הנתונים לא הממוצע היה הצעד נרמול עשוי להיות מושמט, ההתאמה עקומה יכולה להתבצע ישירות על הנתונים הגולמיים.</li>
	<li>על ההערכה של מחצית חיים חלבון, להשתמש בכלי המדידה עקומה. במחקר זה, העקומה MATLAB התאמת הכלים 3.4.1 שימש, אשר ממוקם כברירת מחדל במקטע יישומים של ממשק המשתמש של MATLAB. לייבא את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, ערכי הזמן מהגיליון האלקטרוני לתוך MATLAB על ידי לחיצה על הכרטיסיה ייבוא נתונים פתח את עקומת התאמה בארגז הכלים ובחר את נקודות זמן והנתונים דעיכה פלורסצנטיות נתונים X ו Y הנתונים טאב בחר מותאמת אישית המשוואה פריסטלטיות טאב, הזן את המשוואה עבור דעיכה מעריכית: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> היכן f(t) עוצמת קרינה פלואורסצנטית בכל נקודת זמן נתונה, העוצמה הראשונית ו b קצב הדעיכה. בתיבת הדו-שיח אפשרויות להתאים. בכרטיסיה, בחר 0 עבור הגבול התחתון של גם וגם b . בין הערכים המשוערים עבור ו- b יופיע בחלון תוצאות. לחשב את זמן מחצית החיים כדלקמן: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15173609">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li>
<li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+kinetics+predict+cell+lineage+patterning+in+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo.</a> Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).</li>
<li>Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+O6-alkylguanine-DNA+alkyltransferase+for+applications+in+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Design+Select%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling.</a> Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).</li>
<li>Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).</li>
<li>Bojkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+In+Vivo+Protein+Half-Life%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring In Vivo Protein Half-Life.</a> Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).</li>
<li>Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+quantitative+measurements+of+gene+expression+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells.</a> Methods. 120, 65-75 (2017).</li>
<li>Komatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurements+of+Protein+Dynamics+Using+Fluorescence+Activation-Coupled+Protein+Labeling+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method.</a> J Am Chem Soc. 133 (17), 6745(2011).</li>
<li>Deluz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+mitotic+bookmarking+of+SOX2+in+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation.</a> Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).</li>
<li>Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+pathway+and+regulation+by+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The N-end rule pathway and regulation by proteolysis.</a> Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).</li>
<li>Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Protocols+for+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81156(2013).</li>
<li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Cadherin-Coated+Plates+Maintain+Pluripotent+ES+Cells+without+Colony+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation.</a> PLoS ONE. 1 (1), e15(2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hilsenbeck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+single-cell+tracking+and+quantification+of+cellular+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties.</a> Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).</li>
<li>Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAST%3A+An+automated+segmentation+and+tracking+tool+for+the+analysis+of+transcriptional+kinetics+from+single-cell+time-lapse+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings.</a> Methods. 85, 3-11 (2015).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Comm. 8, (2017).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22076938">5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation.</a> Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Regulation+of+Akt+and+Oct4+Promotes+the+Self-Renewal+and+Survival+of+Embryonal+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells.</a> Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).</li>
<li>Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+Oct4+Enhances+Its+Stability%2C+DNA+Binding%2C+and+Transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation.</a> J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Engineered+Protein+Tag+for+Multiprotein+Labeling+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells.</a> Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השלב המכריע ביותר כאשר היא בעזרת תג SNAP לפקח חלבון דעיכה כדי להבטיח כי אין צבע לא מאוגד שיורית שנשאר במדיום או בתאים אחרי כביסה, אחרת זה עלול להיקשר החדש מיוצר מולקולות SNAP-תג מאוחר יותר במהלך ניסוי של שם פשרה eby העקומה דעיכה. זה מצד אחד, מושגת על ידי ביצוע בקפידה את כל השלבים המתוארים כביסה. מצד שני, הריכוז צבע יש לשמור נמוך ככל האפשר, תוך שהם עדיין בטווח המאפשר קבלת אות לרעש יחס טוב. כפי שמוצג באיור2, ריכוז צבע צריך להיות אופטימיזציה עבור ניסוי על-ידי בדיקת דילולים שונים. במקרה שלנו, הק...

זה ידוע כי החלבונים עוברים תחלופת נרחב, עם המחירים סינתזה והשפלה להיות ספציפיים עבור כל חלבון ובכפוף תקנה פיזיולוגיים. באופן מסורתי, חלבון השפלה המחירים כבר נמדד בשיטות בתפזורת, כגון ניתוח צ'ייס הדופק רדיואקטיביים, או מעורבים מעכבי סינתזה חלבונים כגון cycloheximide1. לאחרונה, איזוטופ יציב תיוג עם חומצות אמינו בתרבות תא (SILAC) בשילוב עם ספקטרומטר מסה הוקם לכמת חלבון מחזור על מידה עולמי2. עם זאת, שיטות אלה מוגבלים על ידי ממוצע של אוכלוסייה, מידע על השתנות לתא ולכן הוא אבוד. יתר על כן, אין אפשרות לזהות שינויים חולף ב השפלה חלבון זה הם מסונכרן על פני האוכלוסייה תא.
לחלופין, חלבון מחצית החיים יכול להיקבע גם על-ידי קרינה פלואורסצנטית גישות, אשר לעיתים קרובות יש את היתרון של מתן רזולוציה תא בודד. למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק photoactivatable (paGFP) שימש כדי לקבוע Oct4 half-life של יונקים העובר מוקדם3. שיטה נוספת לעקוב אחר דעיכה חלבונים בתאים חיים היא השימוש תג הצמד בשילוב עם פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ. SNAP-התג הוא גרסה מוטציה של ה-DNA תיקון אנזים O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (של AGT) זה במיוחד מגיב עם benzylguanine (BG) נגזרים, אשר יכול להיות מצמידים הגששים מולקולרית4,5, 6. לכן, כל חלבון כימרי SNAP-תג יכול להיות בלתי הפיך עם תוויות צבע חדיר פלורסנט, תא. הדופק תיוג של חלבון עניין התמזגו SNAP-תג, ולאחריה שטיפה של לצבוע שיורית, מאפשר לניטור ההשפלה של האוכלוסייה שכותרתו חלבון ובכך לקביעת חלבון half-life. SNAP-tags שימשו בהצלחה במשך. צ'ייס הדופק תיוג של חלבונים, לקביעת חלבון מחצית החיים ב מחסידי תא תרבות, אין ויוו5,7,8,9. ספקטרה פלורסנט מגוון גדול של מצעים SNAP-תג כיסוי נפוץ זמינים מסחרית, המאפשרת הבחירה של לצבוע האופטימלי עבור כל יישום ספציפי. לפיכך, SNAP-tags יכול לשמש גם עבור הדמיה ססגוניות בשילוב עם חלבונים פיוז'ן פלורסנט או צבעים אחרים. תא אטום צבעי מתאימים עבור תיוג קשורה קרום חלבונים, ואילו צבעי תא חדיר הינם ישימים עבור ניטור חלבונים תאיים והן קרום מאוגד. יתר על כן, חלק רגשים אלו שהפגינו כמעט אין קרינה פלואורסצנטית הבזליים, רק להתחיל לשדר אות ניאון חזק על קשירה SNAP-תג10.
פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד את שיעורי השפלה של חלבונים שונים עניין בתאים בודדים באמצעות תג SNAP. כאן אנו מיישמים שיטה זו לתאי גזע עובריים (ES) העכבר בתרבית על E-קדהרין, אבל זה צריך להיות ניתן להשתמש בה עם כל סוג תאים בתרבית חסיד. אנחנו מראים כי הדופק תיוג של חלבונים פיוז'ן SNAP-תג ואחריו קרינה פלואורסצנטית הדמיה בצילום מואץ מאפשר לקביעת תא בודד מחצית החיים של חלבונים שונים של עניין, ומספק הערכה ההשתנות לתא של מחצית החיים ב אוכלוסיית תאים בתרבית.

<table><tbody>קו תאים <tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ES המבטא חלבון היתוך SNAP-tag מעניין</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>פלקון 100 מ"מ TC-Assisted Cell</td><td>Culture Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96 באר, שחור/שקוף, קורנינג צלחת מטופל בתרבית רקמות</td><td></td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירה משופר של נויבאואר, 0.1 מ"מ</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, תאי גזע אמביוניים מוסמכים</td><td>ThermoFisher</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן פירובט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי&nbsp; חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 מ"מ</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>גורם מעכב לוקמיה</td> <td>-</td><td>-</td><td>מיוצר במעבדה על ידי טרנספקציה חולפת של תאי HEK-293T, ולאחר מכן איסוף וסינון של הסופרנטנט.</td></tr><tr><td>CHIR99021 (מעכב GSK-3 XVI)</td><td>Merck Millipore</td><td>361559</td><td></td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>391210-10-9</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x מרוכז של Dulbecco</td><td>BioConcept</td><td>3-05K00-I</td><td></td></tr><tr><td>PBS של Dulbecco ללא Ca++/Mg++</td> <td>BioConcept</td><td>3-05F29-I</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Solution 0.25%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי E-Cadherin Fc חלבון כימרה</td><td>R& D systems</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין היקלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>SNAP-Cell 647-SiR</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>תוכנה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>-</td><td>-</td><td>-תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks-Microsoft</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

חלבונים הם במצב דינמי של סינתזה, השפלה, החצי חייהם יכול להיות מותאם תחת נסיבות שונות. עם זאת, הנפוץ ביותר גישות לקביעת חלבון מחצית חיים האם מישהו מוגבל ממוצעים באוכלוסייה מתאי lysed או מחייבות שימוש מעכבי סינתזת חלבון. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדוד חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות SNAP-תג פיוז'ן חלבונים בשילוב עם מיקרוסקופ זמן לשגות זריחה. כל חלבון עניין דבוקה תג SNAP יכולות להיות covalently קשורות על ידי תא פלורסנט, חדיר לצבוע את זה משולב נגזרת benzylguanine, ניתן לנטר את הדעיכה של האוכלוסייה חלבון שכותרתו לאחר שטיפה של לצבוע שיורית. תא עוקבות מעקב, כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית משולב מעל הזמן יוצרת מעגל דעיכה מעריכית עבור כל תא מסומנים, מתן אפשרות לקביעת חלבון השפלה בבתי תאים בודדים על ידי עקומת התאמה. שיטה זו מספקת הערכה הטרוגניות של מחצית החיים בקרב אוכלוסיה של תאים בתרבית, אשר לא יכול בקלות להיות מוערך על ידי שיטות אחרות. הגישה המוצגת כאן היא ישימה לכל סוג של בתרבית תאים חסיד ביטוי חלבון עניין דבוקה תג SNAP. כאן אנו משתמשים בתאי גזע עובריים (ES) העכבר גדל על צלחות תרבות תא E קדהרין-מצופים להמחשת השפלה תא יחיד איך המחירים של חלבונים עם מגוון רחב של מחצית החיים יכול להיקבע.

הפרוטוקול המתואר מספקת הערכה של מידת ההשתנות לתא בתוך מחצית חיים עבור כל חלבון נתון דבוקה תג SNAP. השימוש רקומביננטי E-קדהרין-Fc לציפוי של צלחת הדמיה מאפשרת לתא בודד רזולוציה ES תאים, אשר אחרת צומחים במושבות. תאים בודדים ניתן לעקוב בנפרד לאורך כל הקורס של הסרט ( איור 1 א').
על מנת לקבוע זמן מחצית החיים חלבון עבור כל תא יחיד, זה חיוני למדוד את האות פלורסצנטיות SNAP-תג משולב, רקע המופחת לאורך זמן ( איור 1B), עם סיכום עוצמות משולבת של שנ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות הדופק תיוג פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ של חלבונים פיוז'ן SNAP-תג.

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

המטרה הכוללת של גישת הדמיה פלואורסצנטית זו היא לקבוע את זמן מחצית החיים של חלבון מעניין בתאים חיים בודדים באמצעות תג SNAP. חלבונים תאיים הופכים באופן נרחב כאשר שיעורי הסינתזה והפירוק הם ספציפיים לכל חלבון, וכפופים לוויסות פיזיולוגי. עם זאת, השיטות הנפוצות ביותר לקביעת זמן מחצית החיים של חלבון מוגבלות לממוצעי אוכלוסייה מתאי כינים, או דורשות שימוש במעכבי סינתזת חלבון.בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בתג SNAP בשילוב עם מיקרוסקופ זמן פלואורסצנטי כדי למדוד זמן מחצית חיים של חלבונים בתאים חיים. היתרון בשיטה זו הוא בכך שהיא משיגה רזולוציה של תא בודד, ולכן מספקת אומדן להטרוגניות של זמן מחצית חיים באוכלוסייה של תאים מתורבתים. ניתן ליישם את הליך הניסוי המוצג כאן על כל סוג של תאים מתורבתים דבקים, המבטאים חלבון מעניין המותך לתג SNAP.ניתן להשיג זאת על ידי תיוג חלבון אנדוגני או על ידי שימוש בביטוי יתר של חלבונים מתויגים. תג ה-SNAP הוא גרסה מוטנטית של אנזים תיקון ה-DNA, O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase המגיב באופן ספציפי עם בנזילגואנין, שניתן לחבר לבדיקות מולקולריות. לכן, ניתן לתייג באופן בלתי הפיך כל חלבון היתוך של תג SNAP בצבע חדיר לתאי תפרחת.עם שטיפת שאריות הצבע, אוכלוסיית החלבון המסומנת תתפרק באופן אקספוננציאלי, וניתן להסיק את זמן מחצית החיים של החלבון המתאים. בסרטון זה אנו משתמשים בתאי גזע עובריים, היוצרים מושבות הדוקות כאשר מגדלים אותם באופן קלאסי על כלים מצופים ג'לטין. כדי לאפשר להם לגדול כשכבה אחת של תאים, ובכך להשיג רזולוציה של תא בודד לניסויי הדמיית תפרחת, תרבנו אותם על לוחות מצופים נצמדים, מה שמפחית את האינטראקציות בין התא לתא המתווכות על ידי היצמדות inc תאית המתבטאת בקרום הפלזמה.לדלל את ה-inc הרקומביננטי הנצמד לחמישה ננוגרם למיקרוליטר ב-PBS, ולהוסיף 30 מיקרוליטר של inc מדולל הדבק לכל שסתום בצלחת 96 שסתומים, המתאימה להדמיה. הימנע מפיפטה נרחבת, מכיוון שהיצמדות רקומביננטית היא שבירה מאוד. דגירה בחום של 37 מעלות למשך שעה וחצי.שאפו את התמיסה הדבקה בע"מ, שטפו פעם אחת עם 100 מיקרוליטר PBS, והוסיפו עד 200 מיקרוליטר מדיום תרבית ESL מתולעים מראש. השתמש בקווי ESL המבטאים חלבון מעניין המותך לתג SNAP. שוטפים את התאים עם חמישה מ"ל PBS.לאחר מכן מוסיפים שני מ"ל טריפסון, ודוגרים במשך ארבע דקות בחום של 37 מעלות. הוסף ארבעה מ"ל של מדיום תרבית ESL, השהה מחדש וסובב ב -1000 T למשך ארבע דקות. שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש במדיום טרי וספרו את התאים.מושב 30,000 תאים לסנטימטר רבוע בלוחית ההדמיה המצופה הנצמדת. המשך עם צביעת צבע SNAP 24 שעות לאחר הישיבה בתא. יש לדלל את צבע התא במדיום תרבית ELS לריכוז האופטימלי שנקבע קודם לכן.שואבים את המדיום בעזרת פיפטה ומוסיפים בזהירות 50 מיקרוליטר מצבע ה- SNAP המדולל. דוגרים במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות. שאפו את הצבע ושטפו שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS לפני תולעת.מוסיפים 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית ESL, ודוגרים למשך 15 דקות בחום של 37 מעלות. בצע את שלבי הכביסה על ידי פיפטה עדינה, ואל תשתמש בשואב אוטומטי מכיוון שתאים נוטים להתנתק בקלות. חזור על אותם שלבי כביסה פעמיים נוספות, ולאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום הדמיה.השתמש במדיום חופשי פנול אדום כדי להפחית את רקע הפריחה. השתמש במיקרוסקופ המאפשר טמפרטורה מבוקרת ו-CO2. הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות, ואת ה-CO2 לחמישה אחוזים לפני השימוש, ואפשר שיווי משקל למשך שעה עד שעתיים.הנח את הצלחת במיקרוסקופ, ובחר מקום המתאים להדמיה. תמונות השדה הבהיר מראות את ה-ESL מחובר ל-inc נצמד לצלחת מצופה בשכבה חד-שכבתית. בחר את המטרה, יעד פי 20 מתאים לגודל זה של ESL.בחר את הגדרות התאורה עבור ערוץ הפריחה שיש להקליט. כוונן את עוצמת הלייזר והחשיפה כדי לקבל אות חזק, מכיוון שהוא יפחת במהלך הסרט. בחר את פרמטרי הרכישה עבור ניסוי ה-time lapse.עבור חלבונים עם זמן מחצית חיים צפוי של שעתיים עד עשרים שעות, בחר זמני רכישה של 12 עד 24 שעות עם מרווחי זמן של 15 דקות. התחל את ניסוי ההדמיה. השתמש בתוכנת פיג'י לעיבוד וניתוח הסרט.אסוף את התמונות שנרכשו כערימה ועיוות אותן. השתמש בפונקציית הפחתת רקע FIJI כדי להסיר רקע מכל התמונות בערימה. בחר תא מעניין, צייר סביבו אזור עניין באמצעות סרגל הכלים של פיג'י, והוסף את אזור העניין למנהל ההחזר על ההשקעה.המשך למסגרת הבאה וחזור על הפעולות הקודמות. עקוב אחר התא המעניין לאורך כל הסרט ושמור את ערכת ההחזר על ההשקעה עבור כל תא במעקב. לחץ על מדידה כדי לקבל ערכים עבור העוצמה הממוצעת ואזור ההחזר על ההשקעה.כדי להעריך את הרקע המקומי, הוסף אזור עניין קרוב לתא המעניין עבור כל מסגרת זמן. בסופו של דבר, לחץ על מדידה כדי לקבל ערכים עבור עוצמת הרקע הממוצעת. ראשית, חשב את העוצמה הממוצעת של התא על ידי הכפלת הערך המתקבל עבור העוצמה הממוצעת של החזר ה-ROI הסלולרי בשטחו.לאחר מכן, המשך לחישוב ערך הרקע המשולב של התא, על ידי הכפלת העוצמה הממוצעת של החזר ה-ROI ברקע עם שטח ה-ROI הסלולרי. לבסוף, כדי לקבל ערך מתוקן ברקע עבור העוצמה המשולבת של התא, הפחיתו את ערך עוצמת הרקע המשולב מערך עוצמת התא המשולב. כדי להשיג מחצית חיים ממוצעת של אוכלוסיית התאים, נרמל את הערכים המתקבלים לערך העוצמה של המסגרת הראשונה עבור כל תא.זה מבטיח שכל תא תורם באותו משקל לערך מחצית החיים הממוצע ללא תלות בעוצמת הפריחה המוחלטת שלו. לאחר חלוקת התאים עוקבים אחר שני תאי הבת בנפרד ומסכמים את העוצמות המשולבות שלהם לאחר חיסור הרקע כדי להסביר את דילול החלבון במהלך חלוקת התא. שמור את ערכות ההחזר על ההשקעה עבור שני תאי הבת.להערכת מחצית החיים של החלבון, השתמש בכלי התאמת העקומה ב-MATLAB. דעיכת החלבון עוקבת אחר מעריכי כאשר F(x) היא עוצמת הפריחה בנקודת הזמן הנתונה, a"העוצמה ההתחלתית, ו-b"קצב הדעיכה. לאחר קבלת הערכים עבור קצב הדעיכה b"מההתאמה, ניתן לחשב את מחצית החיים על ידי חלוקת הלוגריתם של שניים ב-b"סרט זה מציג את הדעיכה של תפרחת הצבע של SNAP בקו תאי היתוך של דוקסיציקלין שאינו שמיש ב-SNAP-tag.אות התפרחת הנצפה יהיה תלוי בקו התאים בו נעשה שימוש, ברמת הביטוי של החלבון המתאים המעניין, כמו גם בתכונות הצבע בו נעשה שימוש. לניסויי ריקבון חלבון חשוב להשתמש בריכוז צבע SNAP הולם. הריכוז צריך להיות גבוה מספיק כדי להניב אות תפרחת בהיר בתחילת חלוף הזמן.עם זאת, שימוש בריכוזי צבע גבוהים מדי עלול לגרום להשארת שאריות צבע במדיום, גם לאחר הכביסה. הצבע החופשי עשוי להיקשר לאחר מכן למולקולות SNAP-tag חדשות שיוצרו במהלך הסרט, מה שיעוות את עקומת הדעיכה. לכן חיוני לייעל את ריכוז הצבע של SNAP על ידי בדיקת דילולים שונים.איור זה מציג את עקומות הדעיכה עבור שמונה ריכוזים שונים של צבע SNAP תפרחת שנבדק על קו תאים בלתי שמיש של דוקסיציקלין. ריכוז צבע ראשוני של 3 מיקרומולר נבחר על פי הוראות היצרן להדמיית תאים חיים, ובוצע דילול סדרתי של 1 עד 3 עד לריכוז של 1.4 ננו-מולארי. עבור שני הריכוזים הגבוהים ביותר האות אינו פוחת, בעוד שהדעיכה הנצפית עוקבת אחר עקומה מעריכית עבור ריכוזים נמוכים יותר.בדוגמה זו נבחר ריכוז אופטימלי של 12 ננו-מולאר, מכיוון שריכוז זה מבטיח כמויות מינימליות של שאריות צבע שנותרו בתווך לאחר הכביסה, אך אות התפרחת עדיין בהיר מספיק כדי לצפות בעקומת דעיכה ברורה. הפרוטוקול המתואר מספק אומדן של השונות מתא לתא ומחצית החיים עבור כל חלבון נתון שהתמזג ל-SNAP-tag. איור זה מציג את דעיכת התא הבודד, ואת ממוצע האוכלוסייה עבור שלושה קווי תאי היתוך SNAP-tag שונים שאינם שמישים של דוקסיציקלין.Nanog" ו-Oct4" הם קצרי חיים למדי עם זמן מחצית חיים ממוצע של 2.9 ו-4.8 שעות. בעוד ש-Srsf11 "חי זמן רב יותר, עם זמן מחצית חיים ממוצע של 25.3 שעות. תרשימי הקופסה מציגים את התפלגות מחצית החיים עבור שלושת החלבונים.הראינו כי השימוש בתג SNAP, בשילוב עם מיקרוסקופ זמן תפרחת, מאפשר לקבוע את זמן מחצית החיים של כל חלבון מעניין. מדידות דעיכת התא הבודד מספקות אומדן להטרוגניות של מחצית חיים באוכלוסיית תאים, אשר מושמטת כאשר משתמשים בשיטות אחרות לקביעת מחצית חיים של חלבון. אחד השלבים החשובים ביותר בעת שימוש בתג SNAP לניטור ריקבון חלבון, הוא להבטיח שלא יישארו שאריות צבע לא קשור במדיום או בתאים לאחר הכביסה.אחרת הוא עלול להיקשר למולקולות SNAP-tag שיוצרו לאחרונה בהמשך הניסוי ובכך לסכן את עקומת הדעיכה. זה מושג מצד אחד על ידי ביצוע קפדני של כל שלבי הכביסה המתוארים. מצד שני, יש לשמור על ריכוז הצבע של SNAP נמוך ככל האפשר תוך שהוא עדיין נמצא בטווח המאפשר להשיג יחס אות לרעש טוב.יש לבצע אופטימיזציה של ריכוז הצבע של SNAP עבור כל ניסוי בהתאם לקו התאים ולסוג הצבע בו נעשה שימוש. אמנם ייתכן שתג ה-SNAP עשוי לשנות את מחצית החיים של חלבונים מועמדים במקרים מסוימים, אך איננו רואים עדות להשפעות כאלה, מכיוון שמחצית החיים שנקבעה של החלבונים המועמדים לבדיקה דבקים בערכים שפורסמו בהתאמה הדוקה. כדי לשלול עוד יותר את ההשפעה של תג ה-SNAP על פירוק החלבון, אפשרות אחת תהיה לחסום סינתזת חלבון עם ציקלוהקסימיד, ולבצע כתמים בשירותים בנקודות זמן שונות, באמצעות נוגדן שמזהה את החלבון המקומי.ולהשוות ישירות את הדעיכה של החלבון המועמד ל-SNAP-tag עם הגרסה המקומית הלא מתויגת.

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים את שיטת האבטיפוס לייצור coverslips מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצופה ג'לטין להמחשת הפחתת מטריצת invadopodia בתיווך. טכניקות חישוב באמצעות תוכנה זמינה מוצגות לכימות הרמות כתוצאה של proteolysis מטריצה ​​של תאים בודדים בתוך אוכלוסייה מעורבת וקבוצות תאיות המקיפות את השדות מיקרוסקופים שלמים.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

סרטון זה מתאר בדיקת מיקרו-צלחות מבוססת פלואורסצנטיות במבחנה כדי לחקור את קינטיקה הפירוק של חלבון מוטנטי לוציפראז מקופל בצורה פלואורסצנטית המבוטא בגרעינים של תאי יונקים נגועים. הבדיקה כוללת טיפול בתאים המבטאים את החלבון המוטנטי הפלואורסצנטי עם מעכב תרגום ומעכב פרוטאזום כדי להעריך את הפירוק בתיווך פרוטאזום של החלבון המקופל בצורה שגויה.

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: טכניקה לניטור קינטיקה של פירוק חלבונים גרעיניים פלואורסצנטיים שאינם מקופלים כהלכה

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית חזקה לכימות השיעור היחסי של פרוטאוליזה על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום. קריאת הבדיקה היא קצב גידול השמרים בתרבית נוזלית, התלוי ברמות התאיות של חלבון מדווח הכולל אות פירוק המותך לסמן מטבולי חיוני.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

דוח זה מתאר פרוטוקולים למדידת שיעורי פירוק של חלבונים לא מקופלים על ידי כתם מערבי או מבחנים מבוססי פלואורסצנטיות. ניתן ליישם את השיטות לניתוח של חלבונים אחרים שקופלו בצורה לא נכונה ולסינון תפוקה גבוהה.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו למדידת מקצבים ביולוגיים בקטוליזם חלבונים באמצעות הוראות משוב ושוב בכבד העכבר.

מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

אנו מציגים שיטה לרכישת קורסי זמן לכתב פלואורסצנטי מתאים בודדים באמצעות מערכים micropatterned. הפרוטוקול מתאר הכנת מערכים חד-תאיים, התקנה ותפעול של מיקרוסקופיית זמן-לשגות של סריקת תאים חיים וכלי לניתוח תמונות בקוד פתוח לצורך בחירה מראש אוטומטית, בקרה חזותית ומעקב אחר קורסי זמן פלואורסצנטיים משולבים בתאים לכל אתר הידבקות.

הדמיית תא חי של מערכים חד-תאיים (LISCA) - טכניקה רב-תכליתית לכימות קינטיקה תאית

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה לתיוג מטבולי של תאים סניסנטיים ולא מתחלקים עם SILAC פועם, ניתוח ספקטרומטריית מסה לא ממוקדת וחישוב יעיל של זמן מחצית חיים של חלבונים.

מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בתאי תרבית סנסנטיים ולא מתחלקים באמצעות תיוג מטבולי וספקטרומטריית מסה

למדו כיצד למדוד חצי חיים של חלבונים בתאים חיים ברמת תא בודד באמצעות SNAP-tag ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה זמן-מעבר. השיטה מאפשרת לחקור את ההטרוגניות בתחלופת חלבונים באוכלוסיית תרביות תאים.

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

גלה סרטונים נוספים