תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

המטרה הכוללת של גישת הדמיה פלואורסצנטית זו היא לקבוע את זמן מחצית החיים של חלבון מעניין בתאים חיים בודדים באמצעות תג SNAP. חלבונים תאיים הופכים באופן נרחב כאשר שיעורי הסינתזה והפירוק הם ספציפיים לכל חלבון, וכפופים לוויסות פיזיולוגי. עם זאת, השיטות הנפוצות ביותר לקביעת זמן מחצית החיים של חלבון מוגבלות לממוצעי אוכלוסייה מתאי כינים, או דורשות שימוש במעכבי סינתזת חלבון.

בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בתג SNAP בשילוב עם מיקרוסקופ זמן פלואורסצנטי כדי למדוד זמן מחצית חיים של חלבונים בתאים חיים. היתרון בשיטה זו הוא בכך שהיא משיגה רזולוציה של תא בודד, ולכן מספקת אומדן להטרוגניות של זמן מחצית חיים באוכלוסייה של תאים מתורבתים. ניתן ליישם את הליך הניסוי המוצג כאן על כל סוג של תאים מתורבתים דבקים, המבטאים חלבון מעניין המותך לתג SNAP.

ניתן להשיג זאת על ידי תיוג חלבון אנדוגני או על ידי שימוש בביטוי יתר של חלבונים מתויגים. תג ה-SNAP הוא גרסה מוטנטית של אנזים תיקון ה-DNA, O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase המגיב באופן ספציפי עם בנזילגואנין, שניתן לחבר לבדיקות מולקולריות. לכן, ניתן לתייג באופן בלתי הפיך כל חלבון היתוך של תג SNAP בצבע חדיר לתאי תפרחת.

עם שטיפת שאריות הצבע, אוכלוסיית החלבון המסומנת תתפרק באופן אקספוננציאלי, וניתן להסיק את זמן מחצית החיים של החלבון המתאים. בסרטון זה אנו משתמשים בתאי גזע עובריים, היוצרים מושבות הדוקות כאשר מגדלים אותם באופן קלאסי על כלים מצופים ג'לטין. כדי לאפשר להם לגדול כשכבה אחת של תאים, ובכך להשיג רזולוציה של תא בודד לניסויי הדמיית תפרחת, תרבנו אותם על לוחות מצופים נצמדים, מה שמפחית את האינטראקציות בין התא לתא המתווכות על ידי היצמדות inc תאית המתבטאת בקרום הפלזמה.

לדלל את ה-inc הרקומביננטי הנצמד לחמישה ננוגרם למיקרוליטר ב-PBS, ולהוסיף 30 מיקרוליטר של inc מדולל הדבק לכל שסתום בצלחת 96 שסתומים, המתאימה להדמיה. הימנע מפיפטה נרחבת, מכיוון שהיצמדות רקומביננטית היא שבירה מאוד. דגירה בחום של 37 מעלות למשך שעה וחצי.

שאפו את התמיסה הדבקה בע"מ, שטפו פעם אחת עם 100 מיקרוליטר PBS, והוסיפו עד 200 מיקרוליטר מדיום תרבית ESL מתולעים מראש. השתמש בקווי ESL המבטאים חלבון מעניין המותך לתג SNAP. שוטפים את התאים עם חמישה מ"ל PBS.

לאחר מכן מוסיפים שני מ"ל טריפסון, ודוגרים במשך ארבע דקות בחום של 37 מעלות. הוסף ארבעה מ"ל של מדיום תרבית ESL, השהה מחדש וסובב ב -1000 T למשך ארבע דקות. שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש במדיום טרי וספרו את התאים.

מושב 30,000 תאים לסנטימטר רבוע בלוחית ההדמיה המצופה הנצמדת. המשך עם צביעת צבע SNAP 24 שעות לאחר הישיבה בתא. יש לדלל את צבע התא במדיום תרבית ELS לריכוז האופטימלי שנקבע קודם לכן.

שואבים את המדיום בעזרת פיפטה ומוסיפים בזהירות 50 מיקרוליטר מצבע ה- SNAP המדולל. דוגרים במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות. שאפו את הצבע ושטפו שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS לפני תולעת.

מוסיפים 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית ESL, ודוגרים למשך 15 דקות בחום של 37 מעלות. בצע את שלבי הכביסה על ידי פיפטה עדינה, ואל תשתמש בשואב אוטומטי מכיוון שתאים נוטים להתנתק בקלות. חזור על אותם שלבי כביסה פעמיים נוספות, ולאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום הדמיה.

השתמש במדיום חופשי פנול אדום כדי להפחית את רקע הפריחה. השתמש במיקרוסקופ המאפשר טמפרטורה מבוקרת ו-CO2. הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות, ואת ה-CO2 לחמישה אחוזים לפני השימוש, ואפשר שיווי משקל למשך שעה עד שעתיים.

הנח את הצלחת במיקרוסקופ, ובחר מקום המתאים להדמיה. תמונות השדה הבהיר מראות את ה-ESL מחובר ל-inc נצמד לצלחת מצופה בשכבה חד-שכבתית. בחר את המטרה, יעד פי 20 מתאים לגודל זה של ESL.

בחר את הגדרות התאורה עבור ערוץ הפריחה שיש להקליט. כוונן את עוצמת הלייזר והחשיפה כדי לקבל אות חזק, מכיוון שהוא יפחת במהלך הסרט. בחר את פרמטרי הרכישה עבור ניסוי ה-time lapse.

עבור חלבונים עם זמן מחצית חיים צפוי של שעתיים עד עשרים שעות, בחר זמני רכישה של 12 עד 24 שעות עם מרווחי זמן של 15 דקות. התחל את ניסוי ההדמיה. השתמש בתוכנת פיג'י לעיבוד וניתוח הסרט.

אסוף את התמונות שנרכשו כערימה ועיוות אותן. השתמש בפונקציית הפחתת רקע FIJI כדי להסיר רקע מכל התמונות בערימה. בחר תא מעניין, צייר סביבו אזור עניין באמצעות סרגל הכלים של פיג'י, והוסף את אזור העניין למנהל ההחזר על ההשקעה.

המשך למסגרת הבאה וחזור על הפעולות הקודמות. עקוב אחר התא המעניין לאורך כל הסרט ושמור את ערכת ההחזר על ההשקעה עבור כל תא במעקב. לחץ על מדידה כדי לקבל ערכים עבור העוצמה הממוצעת ואזור ההחזר על ההשקעה.

כדי להעריך את הרקע המקומי, הוסף אזור עניין קרוב לתא המעניין עבור כל מסגרת זמן. בסופו של דבר, לחץ על מדידה כדי לקבל ערכים עבור עוצמת הרקע הממוצעת. ראשית, חשב את העוצמה הממוצעת של התא על ידי הכפלת הערך המתקבל עבור העוצמה הממוצעת של החזר ה-ROI הסלולרי בשטחו.

לאחר מכן, המשך לחישוב ערך הרקע המשולב של התא, על ידי הכפלת העוצמה הממוצעת של החזר ה-ROI ברקע עם שטח ה-ROI הסלולרי. לבסוף, כדי לקבל ערך מתוקן ברקע עבור העוצמה המשולבת של התא, הפחיתו את ערך עוצמת הרקע המשולב מערך עוצמת התא המשולב. כדי להשיג מחצית חיים ממוצעת של אוכלוסיית התאים, נרמל את הערכים המתקבלים לערך העוצמה של המסגרת הראשונה עבור כל תא.

זה מבטיח שכל תא תורם באותו משקל לערך מחצית החיים הממוצע ללא תלות בעוצמת הפריחה המוחלטת שלו. לאחר חלוקת התאים עוקבים אחר שני תאי הבת בנפרד ומסכמים את העוצמות המשולבות שלהם לאחר חיסור הרקע כדי להסביר את דילול החלבון במהלך חלוקת התא. שמור את ערכות ההחזר על ההשקעה עבור שני תאי הבת.

להערכת מחצית החיים של החלבון, השתמש בכלי התאמת העקומה ב-MATLAB. דעיכת החלבון עוקבת אחר מעריכי כאשר F(x) היא עוצמת הפריחה בנקודת הזמן הנתונה, a"העוצמה ההתחלתית, ו-b"קצב הדעיכה. לאחר קבלת הערכים עבור קצב הדעיכה b"מההתאמה, ניתן לחשב את מחצית החיים על ידי חלוקת הלוגריתם של שניים ב-b"סרט זה מציג את הדעיכה של תפרחת הצבע של SNAP בקו תאי היתוך של דוקסיציקלין שאינו שמיש ב-SNAP-tag.

אות התפרחת הנצפה יהיה תלוי בקו התאים בו נעשה שימוש, ברמת הביטוי של החלבון המתאים המעניין, כמו גם בתכונות הצבע בו נעשה שימוש. לניסויי ריקבון חלבון חשוב להשתמש בריכוז צבע SNAP הולם. הריכוז צריך להיות גבוה מספיק כדי להניב אות תפרחת בהיר בתחילת חלוף הזמן.

עם זאת, שימוש בריכוזי צבע גבוהים מדי עלול לגרום להשארת שאריות צבע במדיום, גם לאחר הכביסה. הצבע החופשי עשוי להיקשר לאחר מכן למולקולות SNAP-tag חדשות שיוצרו במהלך הסרט, מה שיעוות את עקומת הדעיכה. לכן חיוני לייעל את ריכוז הצבע של SNAP על ידי בדיקת דילולים שונים.

איור זה מציג את עקומות הדעיכה עבור שמונה ריכוזים שונים של צבע SNAP תפרחת שנבדק על קו תאים בלתי שמיש של דוקסיציקלין. ריכוז צבע ראשוני של 3 מיקרומולר נבחר על פי הוראות היצרן להדמיית תאים חיים, ובוצע דילול סדרתי של 1 עד 3 עד לריכוז של 1.4 ננו-מולארי. עבור שני הריכוזים הגבוהים ביותר האות אינו פוחת, בעוד שהדעיכה הנצפית עוקבת אחר עקומה מעריכית עבור ריכוזים נמוכים יותר.

בדוגמה זו נבחר ריכוז אופטימלי של 12 ננו-מולאר, מכיוון שריכוז זה מבטיח כמויות מינימליות של שאריות צבע שנותרו בתווך לאחר הכביסה, אך אות התפרחת עדיין בהיר מספיק כדי לצפות בעקומת דעיכה ברורה. הפרוטוקול המתואר מספק אומדן של השונות מתא לתא ומחצית החיים עבור כל חלבון נתון שהתמזג ל-SNAP-tag. איור זה מציג את דעיכת התא הבודד, ואת ממוצע האוכלוסייה עבור שלושה קווי תאי היתוך SNAP-tag שונים שאינם שמישים של דוקסיציקלין.

Nanog" ו-Oct4" הם קצרי חיים למדי עם זמן מחצית חיים ממוצע של 2.9 ו-4.8 שעות. בעוד ש-Srsf11 "חי זמן רב יותר, עם זמן מחצית חיים ממוצע של 25.3 שעות. תרשימי הקופסה מציגים את התפלגות מחצית החיים עבור שלושת החלבונים.

הראינו כי השימוש בתג SNAP, בשילוב עם מיקרוסקופ זמן תפרחת, מאפשר לקבוע את זמן מחצית החיים של כל חלבון מעניין. מדידות דעיכת התא הבודד מספקות אומדן להטרוגניות של מחצית חיים באוכלוסיית תאים, אשר מושמטת כאשר משתמשים בשיטות אחרות לקביעת מחצית חיים של חלבון. אחד השלבים החשובים ביותר בעת שימוש בתג SNAP לניטור ריקבון חלבון, הוא להבטיח שלא יישארו שאריות צבע לא קשור במדיום או בתאים לאחר הכביסה.

אחרת הוא עלול להיקשר למולקולות SNAP-tag שיוצרו לאחרונה בהמשך הניסוי ובכך לסכן את עקומת הדעיכה. זה מושג מצד אחד על ידי ביצוע קפדני של כל שלבי הכביסה המתוארים. מצד שני, יש לשמור על ריכוז הצבע של SNAP נמוך ככל האפשר תוך שהוא עדיין נמצא בטווח המאפשר להשיג יחס אות לרעש טוב.

יש לבצע אופטימיזציה של ריכוז הצבע של SNAP עבור כל ניסוי בהתאם לקו התאים ולסוג הצבע בו נעשה שימוש. אמנם ייתכן שתג ה-SNAP עשוי לשנות את מחצית החיים של חלבונים מועמדים במקרים מסוימים, אך איננו רואים עדות להשפעות כאלה, מכיוון שמחצית החיים שנקבעה של החלבונים המועמדים לבדיקה דבקים בערכים שפורסמו בהתאמה הדוקה. כדי לשלול עוד יותר את ההשפעה של תג ה-SNAP על פירוק החלבון, אפשרות אחת תהיה לחסום סינתזת חלבון עם ציקלוהקסימיד, ולבצע כתמים בשירותים בנקודות זמן שונות, באמצעות נוגדן שמזהה את החלבון המקומי.

ולהשוות ישירות את הדעיכה של החלבון המועמד ל-SNAP-tag עם הגרסה המקומית הלא מתויגת.