האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לזהות ולהסיר פעילות נוקלאז מזוהמת במהלך טיהור חלבונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הרטרו-וירוסים, כגון ביוכימיה, מבנה ודינמיקה של אינטגרציה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי והסרה של פעילות נוקלאז של DNA מזוהמת מחלבון רקומביננטי רצוי במהלך הטיהור.

התחילו בהפשרה על קרח של כדור (pellet) אחד של E.coli המבטא אינטגרז של וירוס קצפי (foamy virus) טיפוס. השתמשו בסוניקטור המצויד בביוהורן (biohorn) בעל קוטר 0.5-inch ומיקרוטיפ קוני בעל קוטר 0.125-inch כדי לבצע סוניקציה למשך 30 שניות ב-30% amplitude כאשר המבחנה נמצאת על קרח. לאחר הסוניקציה, העבירו את דגימת התאים למבחנה קרה של אולטרה-צנטריפוגה, וסובבו במהירות של 120,000 ×g למשך 60 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר הצנטריפוגה, אמור להיווצר משקע ברור, והנוזל העליון עשוי להיות בעל גוון צהוב. העבירו את הנוזל העליון למבחנה קונית קרה בנפח 50-milliliter. לאחר מכן, הכינו עמודת FPLC באורך 110-millimeter ובקוטר five-millimeter עם 1.5 milliliter של שרף טעון בניקל.

ראשית, חברו את העמוד למכשיר ה-FPLC והזרים בו באפר. המכשיר אמור לאסוף נתונים בזמן אמת של מוליכות ובליעת UV באורך גל של 280 ננומטר. קריאות המוליכות וה-UV צריכות להתייצב.

במידת הצורך, המשיכו להזרים בופרים דרך העמודה עד לקבלת קריאות יציבות. באמצעות superloop, טענו את דגימת החלבון אל העמודה בקצב זרימה של 0.15 milliliters per minute עם הגבלת לחץ מרבית של 0.5 megapascal. חברו את ה-superloop למערכת ה-AKTA FPLC.

לאחר שטיפת העמודה ואלוציית החלבונים, קחו מנות של 15 µL מהזרימה הראשונית (flowthrough), מהשטיפה ומפראקציות שיא הבליעה ב-280 nm, והוסיפו 15 µL של באפר לדגימות 2X SDS-PAGE לכל דגימה. הרתיחו את הדגימות למשך שלוש דקות. טענו 10 µL מכל דגימה על ג'לי 10% SDS-PAGE, יחד עם ארבעה µL של סממני חלבון צבועים מראש.

בצעו בדיקה חזותית של הג'ל כדי לזהות פראקציות שנראה שהן מכילות אינטגרז של וירוס קצפי פרוטוטיפי בדרגת טוהר גבוהה. שילו פראקציות אלו, ורשמו את הנפח בעת הפפיטה. בדרך כלל מדובר ב-8 עד 10 milliliters.

באמצעות ספקטרופוטומטר, מדדו את בליעת ה-UV באורך גל של 280 ננומטר של הפראקציות המאוחדות, וחשבו את הכמות הכוללת של חלבון האינטגראז של prototype foamy virus. תנובה טיפית היא כ-10 מיליגרם לליטר של תרבית מושרה. כדי להסיר את תג ההקסה-היסטידין, הוסיפו לחלבון האינטגראז של prototype foamy virus ריכוז סופי של 10-millimolar DTT ו-0.1-millimolar EDTA.

לאחר מכן, הוסיפו 15 micrograms של human rhinovirus 3C protease לכל milligram של prototype foamy virus integrase, והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. כדי לבצע הפרדה של prototype foamy virus integrase באמצעות כרומטוגרפיית זיקה להפרין, הפחיתו את ריכוז ה-sodium chloride של הדגימה ל-200 millimolar על ידי הוספת 1.5 נפחים של באפר C. לאחר מכן, טענו את דגימת ה-prototype foamy virus integrase המדוללת לעמודת heparin Sepharose בקצב זרימה של 0.5 milliliters לדקה, תחת הגבלת לחץ מקסימלית של 1 megapascal. לאחר שטיפת העמודה ואיסוף הגרדיאנט והשטיפה הסופית, נתחו את הדגימה שנטענה, את השבירה (flowthrough), את השטיפה ואת הפרקציות באמצעות 8%SDS-PAGE.

לאחר מכן, העריכו את הפראקציות על ידי צביעת הג'ל ב-Coomassie blue. לאינטגראז של prototype foamy virus ולנוקלאז המזהם יש זיקות שונות לכרומטוגרפיית heparin Sepharose. זהו את פראקציות ה-heparin Sepharose שנראה כי הן מכילות prototype foamy virus integrase טהור כמעט, לצורך שימוש במבחן הנוקלאז.

כדי להתחיל את בדיקת הנוקלאז, ערבבו 3 µL של פראקציית הפרין, 50 ng של plasmid DNA סופר-סלילי (supercoiled) בגודל 3 kb ותמיסת בפר תגובה לנפח סופי של 15 µL. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 90 דקות. עצרו את התגובה באמצעות Proteinase K בריכוז 1 mg/mL ו-0.5% SDS, ודגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.

לאחר מכן, הוסיפו 3.5 µL של צבע טעינה 6X לתגובות של בדיקת הנוקלאז, וטענו את כל הנפח על ג'ל אגרוז 1%. הריצו את הג'ל במתח של 100 V בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת או עד שחזית הצבע תגיע לסוף הג'ל. עם סיום האלקטרופורזה, תמונה של הג'ל שנסרקה בסורק פלואורסצנטי צריכה להראות כי DNA ליניארי רץ בהתאם לגודלו ב-3 kb, DNA סופר-סלילי (supercoiled) רץ מהר יותר לכיוון 2 kb, ו-DNA במבנה מעגל רפוי (relaxed circle) רץ לאט יותר, קרוב ל-3.5 kb.

באמצעות תוכנה לניתוח תמונות, חשבו את נפח הפיקסלים של הפלסמיד בצורות supercoiled, לינארית ומעגלית רלקסית (relaxed circle) בכל נתיב. הגדירו את סכום נפח הפיקסלים של שלושת צורות ה-DNA הללו כערך ה-DNA הכולל, והשתמשו בו כדי לחשב את האחוזים של הצורות הלינאריות והמעגליות הרלקסיות. פרקציות המכילות זיהום של נוקלאז יציגו אחוז גבוה יותר של מעגלים לינאריים ורלקסיים בהשוואה לבקרת השלילה.

יש לשלב את פראקציות ה-heparin Sepharose שאינן מראות פעילות נוקלאז מזוהמת, ולהעבירן לשקיות דיאליזה בעלות נקבוביות של 10 מילימטר וסף חיתוך של משקל מולקולרי של שש עד שמונה kilodalton. בצעו דיאליזה בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה כנגד ליטר אחד של תמיסת דיאליזה. למחרת, הוציאו את דגימת ה-prototype foamy virus integrase נקייה מהנוקלאז משקיות הדיאליזה.

מדדו את הבליעה ב-280 nanometers, וחשבו את ריכוז החלבון הסופי. חלקו את החלבון לאליקוטים, והקפיאו אותם בהקפאה מהירה (snap freeze) בחנקן נוזלי. לאחר מכן, אחסנו את האליקוטים בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.

בדיקת הנוקלאז בוצעה כפי שפורט בסרטון זה. ביקורות שליליות כוללות plasmid DNA ללא חלבון וניקוי קודם של prototype foamy virus integrase מסוג wild-type הידוע כנטול נוקלאז. ביקורת חיובית לפעילות נוקלאז מזוהמת היא ניקוי קודם של prototype foamy virus integrase שאינו פעיל קטליטית וידוע כבעל זיהום של נוקלאז.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות ביוכימיות או דימות של מולקולה בודדת, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון קינטיקה ודינמיקה של אנזימים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות ולהסיר פעילות של נוקלאז מזוהמת מחלבון רקומביננטי.