Name: האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: למדו פרוטוקול לטיהור אינטגרז של וירוס קצפית מסוג PFV ללא זיהום נוקלאזי באמצעות כרומטוגרפיית הפארין. השיטה מאפשרת ניתוח ביוכימי מדויק של מנגנוני אינטגרציה רטרו-ויראליים ב-Escherichia coli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH AI099854 ו- AI126742 למפתח.

<ol><li>Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
<li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li>
<li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li>
<li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li>
<li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+reaction+pathway+and+critical+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li>
<li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li>
<li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li>
<li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

חומרים המקיימים אינטראקציה עם ה-DNA, כגון ה-DNA לתקן חלבונים, אוכלי נבלות חמצן עבור יישומים מיקרוסקופ מולקולה בודדת, או retroviral integrases, צריך להיות חופשי של זיהום חיידקי nucleases2,3. מזהמים אלה עשוי לבלבל את הפרשנות של תוצאות במהלך מבחני ביוכימית או יחיד מולקולה בצובר.
מצאנו כי נוקלאז חיידקי לעתים קרובות שותף מטהרת עם PFV IN... אולם, ב PFV יציג זיקה sepharose הפארין זה בקלות ניתן להבחנה בין מזהם חיידקי נוקלאז1<...

מחקרים ביוכימיים, רווק מולקולה של אינטראקציות חלבון עם ה-DNA דורשים חומרים טהור במיוחד. מזהם nucleases מחיידקים, ניתן להסתיר את התוצאות של מבחני אלה. נוקלאז מזהמים נמצא בתוך ההכנות של חומרים חמצן נבלות protocatechuate-3,4-dioxygenase (יהלומים), אב-טיפוס קצפית וירוס (PFV) integrase (ב) מבודד Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.
שילוב retroviral מבחני להסתמך על ההמרה של ה-DNA supercoiled עצור או ליניארי מוצרים כאמצעי של פעילות4. במהלך זיהום הסלולר ב מצטרף בשני קצותיו של cDNA ויראלי כרומטין מארח5. בכל קצה מצטרף התגובה נקרא העברה strand. מבחני של recombinant ב פעילות יכול להצטרף oligomers דנ א שני מחקה את cDNA ויראלי נגמר אל יעד ה-DNA אינטגרציה מתואמת תגובה4,5,6,7,8. לחלופין IN רקומביננטי עשוי להצטרף קצה דנ א אחד רק9,10תגובה אינטגרציה שאינה פיזיולוגית הרלוונטיים באתר חצי. כאשר הדנ א פלסמיד supercoiled היעד של אינטגרציה, אינטגרציה מתואמת המוצרים הם לליניארית דנ א, חצי אתר שילוב מוצרים עיגולים רגועה. מוצרים אלה התגובה מזוהים על ידי ניידות היחסי שלהם במהלך agarose ג'ל אלקטרופורזה1. אם IN רקומביננטי של נוקלאז מזהמים, יהיה כדין עיגולים רגועה או על פלסמיד ליניארית יכול להיות מבלבל את תוצאות הניסוי. נגיפי DNA oligomers עשוי להיות מסומן fluorescently באופן סופי לזהות מוצרים אינטגרציה, בניגוד נוקלאז מוצרים. עם זאת, ב מאוד טובות מטרות DNA supercoiled; אובדן של פלסמיד supercoiled עיגולים רגועה או DNA ליניארי על ידי מזהמים נוקלאז יכול להטות תוצאות ופרשנות של נתונים11. לכן יש הכרח להסיר את nucleases חיידקי retroviral בהכנות.
ב PFV יש זיקה שונה עבור sepharose הפארין בהשוואה של נוקלאז חיידקי1. ב PFV, את נוקלאז עשוי להיות מופרדים של • תנאי מעבר צבע ליניארי של הפארין sepharose. נוקלאז אינה מזוהה בקלות על-ידי של ספיגת אולטרה סגול (UV) בשיא 280 ננומטר או נתרן אנליטית dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד). במקום זאת, נוקלאז מאותרים על ידי assay פעילות נוקלאז העסקת את ההמרה של פלסמיד supercoiled עיגולים רגועה או מוצרים. כל שבר בעקבות הפארין sepharose כרומטוגרפיה נבדק נוקלאז פעילות. ב PFV את הזיהום נוקלאז יש הבדל אהדה עבור מונו-Q אניון שרף. יש הבדל קטן אהדה עבור מונו-S הקטיון שרף. עם זאת, הרזולוציה מונו-S של נוקלאז חיידקי ו PFV לא תאפשר הפרדה יעילה בין החלבונים. בסופו של דבר, הפארין sepharose זיקה טיהור מציע ההפרדה הטוב ביותר של נוקלאז חיידקי מ PFV IN ויש לו היתרון של נפח בלתי מוגבל.
בדיקה של מזהם נוקלאז פעילות עשוי להיות מותאם חלבונים אחרים. החלבון עניין סביר להניח יש זיקה חלופי מאפיינים מאשר ב PFV; ההבדל מחייבים המאפיינים של החלבון של עניין את הזיהום נוקלאז להיקבע מדעית. מתודולוגיה זו לזיהוי נוקלאז הזיהום עשוי להיות מותאם כדי אחרים שרפים כולל הקטיון מונו-S או מונו-Q אניון exchange שרפים. זיקה, יונים שרפים עשויים להציע שיטה אמינה כדי לבודד חלבון רקומביננטי עניין ובלחות nucleases ללא מגבלות באמצעי האחסון של חלבון במהלך כרומטוגרפיה.

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 רוזטה E. coli</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB מרק</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol&nbsp;</td><td>אמרסקו</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira כימיקלים עדינים</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp;</td><td>אמרסקו</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>דנוויל סיינטיפיק</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>הפרין ספרוז 6 זרימה מהירה</td><td>GE בריאות מדעי החיים</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C פרוטאז&nbsp;</td><td>EMD כימיקלים</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס integrase

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

החלבון integrase (ב) של רטרווירוס אב טיפוס קצפית וירוס (PFV) הוא אנזים מודל לימוד המנגנון של retroviral אינטגרציה. בהשוואה ל- IN של רטרווירוסים אחרים, PFV IN הוא מסיס יותר נוטה יותר מניפולציה ניסויית. בנוסף, הוא רגיש מעכבי IN הרלוונטית קלינית וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1), רומז כי מנגנון PFV IN קטליטי דומה כי של HIV-1 ב- IN IN מזרז קוולנטיות בהצטרפות של נגיפי DNA משלימים (cDNA) למטרה DNA בתהליך שנקרא העברה strand. כזאתי העברה סטרנד מציג ניקס יעד ה-DNA. ניתוח של אינטגרציה התגובה מוצרים יכול להיות מבולבל על ידי הנוכחות של nucleases שניק באופן דומה ה-DNA. נוקלאז חיידקי הוכח לטהר במשותף עם רקומביננטי IN PFV לידי ביטוי Escherichia coli (e. coli). כאן אנו מתארים שיטה לבודד PFV ב מ נוקלאז משחיתה מאת הפארין כרומטוגרפיית זיקה. שברים מוקרנים בקלות עבור נוקלאז זיהום עם פלסמיד supercoiled, agarose בג'ל. ב PFV ו נוקלאז משחיתה את להציג הזיקות חלופי עבור sepharose הפארין ומאפשר נוקלאז ללא הכנת IN PFV רקומביננטי מתאים לניתוח ביוכימית או יחיד מולקולה בצובר של אינטגרציה.

ב PFV רקומביננטי נגוע לעיתים קרובות עם חיידקי נוקלאז1. שילוב הביוכימי מבחני תלויים כימות תשובתו של פלסמיד supercoiled DNA עיגולים רגועה ומוצרים ליניארי. הנוכחות של נוקלאז מזהמים עלול להוביל כדין כימות של מבחני אלה. הביטוי של PFV IN עם תג hexahistidine המושרה ב e. coli (איור 1), תחילה מטוהרת על-ידי ניקל כרומטוגרפיית זיקה (איור 2). השברים עם טהור ב PFV משולבים, התג hexahistidine הוא ביקע על ידי פרוטאז. אנחנו קבעו כי PFV IN נוקלאז מ...

אב טיפוס רקומביננטי וירוס קצפית integrase חלבון נגוע לעיתים קרובות נוקלאז חיידקי במהלך טיהור. שיטה זו מזהה נוקלאז זיהום ומסירה אותו הכנת הסופי של האנזים.

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לזהות ולהסיר פעילות נוקלאז מזוהמת במהלך טיהור חלבונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הרטרו-וירוסים, כגון ביוכימיה, מבנה ודינמיקה של אינטגרציה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי והסרה של פעילות נוקלאז של DNA מזוהמת מחלבון רקומביננטי רצוי במהלך הטיהור.התחילו בהפשרה על קרח של כדור (pellet) אחד של E.coli המבטא אינטגרז של וירוס קצפי (foamy virus) טיפוס. השתמשו בסוניקטור המצויד בביוהורן (biohorn) בעל קוטר 0.5-inch ומיקרוטיפ קוני בעל קוטר 0.125-inch כדי לבצע סוניקציה למשך 30 שניות ב-30% amplitude כאשר המבחנה נמצאת על קרח. לאחר הסוניקציה, העבירו את דגימת התאים למבחנה קרה של אולטרה-צנטריפוגה, וסובבו במהירות של 120,000 ×g למשך 60 דקות בטמפרטורה של 4 °C.לאחר הצנטריפוגה, אמור להיווצר משקע ברור, והנוזל העליון עשוי להיות בעל גוון צהוב. העבירו את הנוזל העליון למבחנה קונית קרה בנפח 50-milliliter. לאחר מכן, הכינו עמודת FPLC באורך 110-millimeter ובקוטר five-millimeter עם 1.5 milliliter של שרף טעון בניקל.ראשית, חברו את העמוד למכשיר ה-FPLC והזרים בו באפר. המכשיר אמור לאסוף נתונים בזמן אמת של מוליכות ובליעת UV באורך גל של 280 ננומטר. קריאות המוליכות וה-UV צריכות להתייצב.במידת הצורך, המשיכו להזרים בופרים דרך העמודה עד לקבלת קריאות יציבות. באמצעות superloop, טענו את דגימת החלבון אל העמודה בקצב זרימה של 0.15 milliliters per minute עם הגבלת לחץ מרבית של 0.5 megapascal. חברו את ה-superloop למערכת ה-AKTA FPLC.לאחר שטיפת העמודה ואלוציית החלבונים, קחו מנות של 15 µL מהזרימה הראשונית (flowthrough), מהשטיפה ומפראקציות שיא הבליעה ב-280 nm, והוסיפו 15 µL של באפר לדגימות 2X SDS-PAGE לכל דגימה. הרתיחו את הדגימות למשך שלוש דקות. טענו 10 µL מכל דגימה על ג'לי 10% SDS-PAGE, יחד עם ארבעה µL של סממני חלבון צבועים מראש.בצעו בדיקה חזותית של הג'ל כדי לזהות פראקציות שנראה שהן מכילות אינטגרז של וירוס קצפי פרוטוטיפי בדרגת טוהר גבוהה. שילו פראקציות אלו, ורשמו את הנפח בעת הפפיטה. בדרך כלל מדובר ב-8 עד 10 milliliters.באמצעות ספקטרופוטומטר, מדדו את בליעת ה-UV באורך גל של 280 ננומטר של הפראקציות המאוחדות, וחשבו את הכמות הכוללת של חלבון האינטגראז של prototype foamy virus. תנובה טיפית היא כ-10 מיליגרם לליטר של תרבית מושרה. כדי להסיר את תג ההקסה-היסטידין, הוסיפו לחלבון האינטגראז של prototype foamy virus ריכוז סופי של 10-millimolar DTT ו-0.1-millimolar EDTA.לאחר מכן, הוסיפו 15 micrograms של human rhinovirus 3C protease לכל milligram של prototype foamy virus integrase, והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. כדי לבצע הפרדה של prototype foamy virus integrase באמצעות כרומטוגרפיית זיקה להפרין, הפחיתו את ריכוז ה-sodium chloride של הדגימה ל-200 millimolar על ידי הוספת 1.5 נפחים של באפר C. לאחר מכן, טענו את דגימת ה-prototype foamy virus integrase המדוללת לעמודת heparin Sepharose בקצב זרימה של 0.5 milliliters לדקה, תחת הגבלת לחץ מקסימלית של 1 megapascal. לאחר שטיפת העמודה ואיסוף הגרדיאנט והשטיפה הסופית, נתחו את הדגימה שנטענה, את השבירה (flowthrough), את השטיפה ואת הפרקציות באמצעות 8%SDS-PAGE.לאחר מכן, העריכו את הפראקציות על ידי צביעת הג'ל ב-Coomassie blue. לאינטגראז של prototype foamy virus ולנוקלאז המזהם יש זיקות שונות לכרומטוגרפיית heparin Sepharose. זהו את פראקציות ה-heparin Sepharose שנראה כי הן מכילות prototype foamy virus integrase טהור כמעט, לצורך שימוש במבחן הנוקלאז.כדי להתחיל את בדיקת הנוקלאז, ערבבו 3 µL של פראקציית הפרין, 50 ng של plasmid DNA סופר-סלילי (supercoiled) בגודל 3 kb ותמיסת בפר תגובה לנפח סופי של 15 µL. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 90 דקות. עצרו את התגובה באמצעות Proteinase K בריכוז 1 mg/mL ו-0.5% SDS, ודגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.לאחר מכן, הוסיפו 3.5 µL של צבע טעינה 6X לתגובות של בדיקת הנוקלאז, וטענו את כל הנפח על ג'ל אגרוז 1%. הריצו את הג'ל במתח של 100 V בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת או עד שחזית הצבע תגיע לסוף הג'ל. עם סיום האלקטרופורזה, תמונה של הג'ל שנסרקה בסורק פלואורסצנטי צריכה להראות כי DNA ליניארי רץ בהתאם לגודלו ב-3 kb, DNA סופר-סלילי (supercoiled) רץ מהר יותר לכיוון 2 kb, ו-DNA במבנה מעגל רפוי (relaxed circle) רץ לאט יותר, קרוב ל-3.5 kb.באמצעות תוכנה לניתוח תמונות, חשבו את נפח הפיקסלים של הפלסמיד בצורות supercoiled, לינארית ומעגלית רלקסית (relaxed circle) בכל נתיב. הגדירו את סכום נפח הפיקסלים של שלושת צורות ה-DNA הללו כערך ה-DNA הכולל, והשתמשו בו כדי לחשב את האחוזים של הצורות הלינאריות והמעגליות הרלקסיות. פרקציות המכילות זיהום של נוקלאז יציגו אחוז גבוה יותר של מעגלים לינאריים ורלקסיים בהשוואה לבקרת השלילה.יש לשלב את פראקציות ה-heparin Sepharose שאינן מראות פעילות נוקלאז מזוהמת, ולהעבירן לשקיות דיאליזה בעלות נקבוביות של 10 מילימטר וסף חיתוך של משקל מולקולרי של שש עד שמונה kilodalton. בצעו דיאליזה בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה כנגד ליטר אחד של תמיסת דיאליזה. למחרת, הוציאו את דגימת ה-prototype foamy virus integrase נקייה מהנוקלאז משקיות הדיאליזה.מדדו את הבליעה ב-280 nanometers, וחשבו את ריכוז החלבון הסופי. חלקו את החלבון לאליקוטים, והקפיאו אותם בהקפאה מהירה (snap freeze) בחנקן נוזלי. לאחר מכן, אחסנו את האליקוטים בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.בדיקת הנוקלאז בוצעה כפי שפורט בסרטון זה. ביקורות שליליות כוללות plasmid DNA ללא חלבון וניקוי קודם של prototype foamy virus integrase מסוג wild-type הידוע כנטול נוקלאז. ביקורת חיובית לפעילות נוקלאז מזוהמת היא ניקוי קודם של prototype foamy virus integrase שאינו פעיל קטליטית וידוע כבעל זיהום של נוקלאז.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות ביוכימיות או דימות של מולקולה בודדת, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון קינטיקה ודינמיקה של אנזימים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות ולהסיר פעילות של נוקלאז מזוהמת מחלבון רקומביננטי.

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הגנום של שפעת וירוס כוללת שמונה מתחמים נפרדים של רנ"א וחלבונים, כינה מתחמי ribonucleoprotein ויראלי (vRNPs). מאמר זה מתאר את שיפוע גליצרול טיהור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים להדמיה של שפעת vRNPs.

טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי עופרת. המאמר הבא מדגיש עד כמה מרכז ג'נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות מנצל גישה רב יעד לקביעת גן למבנה של שפעת PB2 מקטע.

גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

המטרה של פרוטוקול זה היא במיוחד לתייג באופן סלקטיבי לבודד את ה-DNA הנגיפי של תאים נגועים על האפיון של גנום ויראלי הקשורים חלבונים.

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

Integrase retroviral רקומביננטי oligomers DNA מחקה מסתיים DNA נגיפי יכול יוצרים קומפלקס פעיל enzymatically המכונה של intasome. Intasomes עשוי לשמש ללימודי הביוכימי, מבניים קינטי. פרוטוקול זה מפרט כיצד להרכיב ולטהר intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס.

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

נתאר כאן במבחנה הדור של HBV DNA באמצעות מערכת זיהום וירוס הפטיטיס B, זיהוי רגישה מאוד שלה אינטגרציה (1-2 עותקים) באמצעות ההופכי מקונן PCR.

זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירה וטיהור של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות שיטת כרומטוגרפיית זיקה אופטימלית מבוססת הפרין. הוא מציג גישה פשוטה, ניתנת להרחבה וחסכונית, ומבטל את הצורך באולטרה-צנטריפוגה. הווקטורים המתקבלים מפגינים טוהר גבוה ופעילות ביולוגית, מה שמוכיח את ערכם במחקרים פרה-קליניים.

בידוד של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות פרוטוקול כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבי וחצי אוטומטי

מוטגנזה החדרתית היא כלי חיוני בגנטיקה קדימה לזיהוי אלמנטים גנומיים פונקציונליים. כאן, אנו מתארים את המסך מבוסס החדרה עבור אלמנטים ותעתיקים פונקציונליים (InSET), שיטה לאיתור אתרי אינטגרציה של lentivirus בתוך ספריית תאי מוטגנזה מבוססת lentivirus.

זיהוי אתרי אינטגרציה של Lentivirus רלוונטיים מבחינה תפקודית בספריית תאי מוטגנזה החדרתית

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ביוכימית של שינוי ג'ל למדידת פעילות FEN1 (Flap Endonuclease 1) והתפתחות מעכבים.

זיהוי מבוסס פלואורסצנטי של פעילות נוקלאז FEN1 וסינון של מעכבי מולקולות קטנות

למדו פרוטוקול לטיהור אינטגרז של וירוס קצפית מסוג PFV ללא זיהום נוקלאזי באמצעות כרומטוגרפיית הפארין. השיטה מאפשרת ניתוח ביוכימי מדויק של מנגנוני אינטגרציה רטרו-ויראליים ב-Escherichia coli.

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

גלה סרטונים נוספים