מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

המטרה הכוללת של שיטה זו היא טרנספקציה יציבה של הפטוציטים in vivo, עם מבנים וקטוריים לביטוי גנים או shRNA הניתנים להשראה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הכבד. לדוגמה, ניתן ליישם אותו כדי לחקור מנגנונים בסרטן הכבד והתחדשות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הביטוי המשולב של CreER יחד עם ביטוי טרנסגן R shRNA הניתן להשראה בהפטוציטים של עכברים in vivo המושג על ידי הזרקת וריד זנב הידרודינמי. מדגים את ההליך יהיה אריק האבנר, סטודנט לרפואה מהמעבדה שלנו. התחל בשילוב של 150 ננוגרם של וקטור כניסה המכיל את ה-RNA הקצר של סיכת הראש עבור החלבון הממוקד עם 150 ננוגרם של וקטור pTC Tet ומאגר TE לנפח כולל של שמונה מיקרוליטר.

לאחר מכן העבירו את תערובת האנזים קלונאז LR II לקרח ודגרו למשך שתי דקות. מערבולת פעמיים במהלך הדגירה. לאחר מכן הוסיפו לתגובה שני מיקרוליטרים של תערובת אנזים קלונאז LR ודגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר הדגירה, עצרו את התגובה על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של תמיסת פרוטאינאז K. לאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עשר דקות. לאחר מכן, הפוך חיידקים מוכשרים Stbl3 עם שני מיקרוליטרים של תערובת שיבוט באמצעות פרוטוקול הלם חום סטנדרטי.

לאחר ציפוי הטרנספורמציה על צלחות אגר המכילות אמפיצילין, יש לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, בחר מושבות בודדות וחסן כמויות קטנות של מצע גידול חיידקים לדגירה למשך הלילה. לאחר בידוד ה-DNA ואישור שלמות הווקטור על ידי ריצוף סנגר, הכינו הכנת DNA בקנה מידה מקסימלי של המבנה להזרקה.

התחל בשקילת העכברים. לאחר מכן הכינו תמיסת מלח סטרילית המכילה 15 מיקרוגרם למיליליטר של מבנה וקטור היפהפייה הנרדמת נטול אנדוטוקסין ומיקרוגרם אחד למיליליטר pchsB5 נטול אנדוטוקסין. הכן מספיק תמיסה כדי להזריק לכל עכבר נפח שהוא 10% ממשקל גופו.

מלאו מזרק סטרילי של 3 מיליליטר בנפח הנדרש לעכבר אחד והצמידו מחט בגודל 27. לאחר הוספת כמות מתאימה של נייר טישו כדי להשאיר מקום מינימלי לתנועה אך מספיק מקום לנשימה, הכנס את העכבר לריסון מתאים עם חורי נשימה. חממו את הזנב באמצעות מנורת אינפרא אדום למשך 30 עד 60 שניות תוך מעקב מדוקדק אחר סימני התחממות יתר כגון תנועה מהירה של הזנב או סימני תסיסה אחרים.

לאחר מכן נקו את הזנב בעזרת ספוגית אלכוהול. הכנס את המחט כמעט אופקית לאחד משני ורידי הזנב הצדדיים הקרובים לבסיס הזנב. אם יונח בהצלחה, כמות קטנה של דם עשויה לזרום בחזרה לתוך חרוט המחט.

הזריק את הנפח הכולל לווריד הזנב תוך שמונה עד עשר שניות. לאחר ההזרקה, הסר מיד את העכבר מהמסנן. דחסו את פצע ההזרקה עם גזה סטרילית למשך 30 שניות לפחות או עד שהדימום שוכך.

הזרקת וריד זנב הידרודינמית מוצלחת היא חיונית לטרנספקציה ותלויה במיוחד במהירות ההזרקה, בנפח ובזמן ההזרקה. כדי להקל על הזרקה תוך ורידית, ודא שהעכברים אינם לחוצים או מיובשים ביום ההזרקה. לאחר 30 עד 60 דקות של שהייה סולו בכלוב התאוששות, העבירו את העכבר בחזרה לכלוב המקורי שלו.

התחל אינדוקציה של Cre recombinase 10 עד 15 ימים לאחר הזרקת וריד הזנב כדי לאפשר פינוי של וקטורים לא משולבים. ממיסים עשרה מיליגרם טמוקסיפן ב -40 מיקרוליטר אתנול ודוגרים בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך עשר דקות בניעור. מערבולת מספר פעמים עד שהטמוקסיפן נמס.

לאחר מכן מוסיפים 960 מיקרוליטר שמן תירס ודוגרים במשך חמש דקות בחום של 55 מעלות צלזיוס. לאחר הקירור, משוך את התמיסה למזרק אינסולין של 1 מיליליטר עם מחט בגודל 20. לאחר מכן החלף למחט בגודל 27.

כדי להזריק, תחילה קשקש את העכבר על ידי תפיסת צוואר העכבר בזהירות עם האגודל והאצבע השנייה, קיבוע הזנב בין בסיס היד לאצבע הרביעית והחמישית. לאחר מכן יש להזריק תוך צפקית 0.1 מיליליטר מהתמיסה לרבע התחתון השמאלי של הבטן. לניסויים של פחות מעשרה ימים, יש לתת דוקסיציקלין באופן רציף באמצעות מי שתייה באמצעות הפרוטוקול הבא.

ראשית, ממיסים חמישה גרם סוכרוז ב 100 מיליליטר מי ברז וחיטוי. לאחר מכן ממיסים 100 מיליגרם של דוקסיציקלין היקלט בחמישה מיליליטר מתמיסת הסוכרוז בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש במזרק של 10 מיליליטר כדי לסנן את התמיסה דרך מסנן 0.2 מיקרון.

לאחר מכן הוסף את תמיסת הדוקסיציקלין המסוננת ל-95 מיליליטר תמיסת הסוכרוז הנותרים וספק את התמיסה לעכבר במקום מי שתייה. בדוק מדי יום והחלף מיד אם התמיסה נעשית מעוננת, מכיוון שהדבר מעיד על צמיחת יתר של חיידקים. הכן מזרק של 1 מיליליטר עם מחט בגודל 27 עם מיליליטר אחד של תמיסת פרפורמלדהיד 4%.

השתמש במספריים מנתחים ומלקחיים אנטומיים כדי לבצע לפרוטומיה חציונית ולחשוף את הכבד של העכבר המורדם. הזיזו את המעי הדק ימינה כדי לחשוף את וריד השער ואת הווריד הנבוב התחתון. הכנס את המחט של המזרק המוכן לווריד הנבוב התחתון וחתך את וריד הפורטל.

הזריק מיליליטר אחד של PFA לאט כדי להגדיל את רקמת הכבד ולהסיר כדוריות דם אדומות אוטו-פלואורסצנטיות. לאחר הסרת הכבד, שטפו אותו במים והעבירו לחמישה עד עשרה מיליליטר של תמיסת 4% PFA לתיקון לאחר החיתוך. הזרקת מבנה טרנספוזון המשלב את הביטוי המכונן של Cre recombinase הניתן להשראה עם ביטוי השראת של טרנסגן או shRNA לבחירה לעכברים מדווחים Cre הראו ביטוי חזק של הגן המדווח GFP לאחר הפעלת Cre recombinase על ידי טמוקסיפן.

לאחר הטיפול בדוקסיציקלין, ניתן לדמיין ביטוי טרנסגן הניתן להשראה על ידי נוגדנים מתאימים בהפטוציטים שעברו טרנספטציטים. עבור ביטוי shRNA השראה, ביטוי GFP ציטופלזמי שזוהה על ידי צביעה חיסונית יכול לשמש כסמן חלופי לביטוי shRNA. הוזרק מבנה טרנספוזון המכיל קלטת ביטוי לוציפראז בשליטה של מבנה מקדם ספציפי לכבד.

לאחר הזרקת לוציפרין, העכברים צולמו באמצעות מערכת הדמיה in vivo שבועיים לאחר הזרקת וריד הזנב ההידרודינמי. הדמיה הראתה ביולומינסנציה חזקה ויציבה של לוציפראז בכבד 15 יום לאחר ההזרקה, מה שמדגים שניתן להשתמש במערכת בהצלחה כדי לעקוב אחר נוכחותם של תאים שעברו טרנספטציה in vivo על ידי הדמיה ביולומינסנציה. לאחר השליטה, ניתן לבצע הזרקות הידרודינמיות לווריד הזנב תוך כ-15 דקות, בעוד שכל ההליך משיבוט הזרקת העכברים שלנו, השראת ביטוי טרנסגן R shRNA ועד הכנת הכבד ייקח כשלושה עד ארבעה שבועות.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את הגודל ושלמות הרצף של הפלסמידים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם את מערכת pTC Tet עם הטרנסגן R shRNA לבחירתך על כל דגם עכבר Crelux Pbase.