שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation
8 בדצמבר 2017
במסמך זה, אנו מציגים עבור התרבות תלת-ממד של עכברוש פרוטוקול תאי המוח-derived עכשיו, דונלד, לרבות האסטרוציטים, מיקרוגלייה oligodendrocytes להפוך. נדגים התרבות התא הראשי, סינתזה הידרוג חומצה היאלורונית methacrylated (חמה), HAMAphoto-הפילמור ותא כימוס, דוגמת עיבוד עבור הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים קונאפוקלית של סריקה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול תרבית תאים תלת מימדית זה היא למדל את אירוע צלקת הגליה של מערכת העצבים המרכזית באמצעות תאי אינדיקטור מרכזיים: מיקרוגליה, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירו-דלקתי, כגון הפוטנציאל של תאי גליה לשפר אסטרטגיות התחדשות ולפענח את צלקת הגליה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לאפיין במהירות ביולוגיה של גליה במיקרו-סביבה תלת מימדית עם מניפולציות שיטתיות וגבוהות. להכנת פתקי כיסוי לזריעה, התחל בהוספת מיליליטר אחד של 3-פרופיל מתאקרילט ל-49 מיליליטר מים מזוקקים כדי ליצור תמיסה של 2%. לאחר מכן הניחו את כיסוי הזכוכית בגודל 18 מילימטר לתוך התמיסה והתנדנדו למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, שטפו את החלקות הכיסוי על ידי טבילה סדרתית של כל החלקת כיסוי בשלוש כוסות של 100 מיליליטר מים נטולי יונים. לאחר מכן יבש את הכיסוי מחליק בוואקום עם מייבש ותנור בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השתמש במלקחיים כדי לטבול במהירות החלקות כיסוי בודדות באתנול 70%. לאחר מכן, מבלי לייבש, זרוק כל החלקת כיסוי לבאר של צלחת 12 בארות. לאחר מכן, שטפו כל באר עם מיליליטר אחד של מים סטריליים נטולי יונים. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של פולי סטרילי
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לתרבית תלת-ממדית (3D) של תאי גלייה המופקים ממוח של חולדה, כולל אסטרוציטים, מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים. הוא מפרט את התהליכים של תרבית תאים ראשונית, סינתזה של הידרוג'ל וטכניקות דימוי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- הנדסת רקמות
רקע
- מערכות תרבית תאים בתלת-ממד הן חיוניות לחקר תאי גליה.
- תאי גליה המופקים ממוח של חולדה ממלאים תפקיד מכריע בנוירוביולוגיה.
- הידרוגלים מספקים סביבה תומכת לצמיחת תאים.
- טכניקות דימיגון הן חיוניות לניתוח מורפולוגיה של תאים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן לתרבית של תאי גליה בתלת-ממד (3D).
- שיפור ההבנה של האינטראקציות בין תאי גליה.
- סיוע בדימות מתקדם של תאים בתרבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרבית ראשונית של תאי גליה המופקים ממוח של חולדה.
- סינתזה של הידרוג'ל חומצה היאלורונית מתאקרילית (HAMA).
- פוטו-פולימריזציה של HAMA לצורך כליאת תאים.
- עיבוד דגימות עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית ומיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת.
תוצאות עיקריות
- הכמיסה מוצלחת של תאי גליאה בתוך הידרוג'ל HAMA.
- הוכחת חיוניות ותפקוד של תאים בתרבית.
- השגת דימויים באיכות גבוהה של מורפולוגיית התאים.
- הפרוטוקול מספק בסיס למחקרי תאי גליאה עתידיים.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח יעיל לתרבית תלת-ממדית של תאי גליה.
- ניתן ליישם שיטה זו בתחומי מחקר שונים במדעי העצבים.
- מחקרים עתידיים יכולים להישען על תשתית זו לצורך חקירות מתקדמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מידול תהליכים של דלקת עצבית בסביבה תלת-ממדית בעלת רלוונטיות פיזיולוגית מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית עבור תרופות המכוונות לתאי גליה. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי באימות המטרה על ידי שחזור היווצרות צלקת גליאלית, מאפיין פתולוגי מרכזי בפגיעות במערכת העצבים המרכזית ובניוון עצבי. השיטה מקלה על הרצף התרגומי משלב הגילוי להערכה פרה-קלינית על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה לסריקת תרכובות אימונומודולטוריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של אינטראקציות בין תאי גליה במיקרו-סביבה תלת-ממדית כדי להבהיר מנגנונים פתוגניים של נוירו-דלקת.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מיקרוגליה, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים כמטרות טיפוליות בהפרעות של ה-CNS.
- ערך חיזוי: מגביר את הביטחון במטרת הטיפול על ידי מידול של היווצרות צלקת גליאלית, גורם מרכזי לציטוטוקסיות ולפגיעה ברגנרציה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור להכנת הידרוגלים המכילים תאי גליה לצורך סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה כמותית של תגובות גליאליות באמצעות דימוי קונפוקאלי ו-SEM, ובכך תומך במוכנות הבדיקה.
- יכולת הרחבה: תואם למניפולציות בתסריק גבוה ולשינוי של תת-מצעים ביו-אקטיביים לצורך אופטימיזציה של הבדיקה.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לעבודה הפרה-קלינית על ידי מידול מערכת רלוונטית למחלה של היווצרות צלקת גליאלית.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת הערכה של השפעות התרכובת על הפעלת גליות והבשלת הצלקת, ובכך מספקת מידע לקידום מותאם-סיכונים.
- סנכרון עם סמנים ביולוגיים: תומכת בהערכת מורפולוגיה וריאקטיביות גליאלית כסמנים ביולוגיים תרגומיים לתגובה נוירו-דלקתית.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד למחקרים פרה-קליניים, על ידי אספקת מערכת תרבית גליאלית תלת-ממדית המדמה פתולוגיה של דלקת עצבית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת השערות לגבי מסלולים דלקתיים המתווכים על ידי גלייאל ותקשורת תאית בסביבה ביו-מימטית.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות ותוצאות כמותיות להערכת השפעות אימונו-מודולטוריות על הפנוטיפ והתפקוד של הגלייאל.
- אנליטיקה: מספק תוצרי דימות ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ו-SEM לכימות מורפולוגיית התאים, התפלגותם ומצבי ההפעלה שלהם.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מודולציה מוקדמת של מטרות גלייאליות לתוצאות פרה-קליניות על ידי שחזור של תהליך פתולוגי מרכזי בפגיעות ומחלות של ה-CNS.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת הידרוג'ל לשימוש חוזר עבור מודלים של נוירו-דלקת כרונית ואקוטית בפרויקטי גילוי שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות תובנה מכניסטית לגבי היווצרות הצלקת הגליאלית ושלשלאות דלקתיות נוירוגניות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של תרביות גליאליות בתלת-ממד לצורך ניסויים עקביים בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות הביולוגית במעורבות מטרה גליאלית ובמודולציה של מסלולים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף של טיפולים במערכת העצבים המרכזית (CNS) מותאם סיכון, בהתבסס על יעילות במודולציה של תגובות גליאליות במערכת רלוונטית למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד תאי גלייה ראשוניים, סינתזה של הידרוג'ל וטכניקות של תרבית תלת-ממדית (3D).
- המכשור כולל מערכות פוטו-פולימריזציה ב-UV, מיקרוסקופים קונפוקאליים ומיקרוסקופים אלקטרוניים סורקים לאפיון.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת פורמולציה עקבית של ההידרוג'ל, צפיפות זריעת תאים ופרוטוקולי דימות.
- התאמה למקורות גלייה אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של קשיחות ההידרוג'ל והציפוי הביואקטיבי.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות ביבול התאים הראשוניים והצורך בטכניקה אספטית במהלך שלבי הכמיסה (encapsulation) והפולימריזציה.
