מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

המטרה הכוללת של מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית גמא-H2AX ו-53BP1 היא לנתח את היווצרותם ותיקון של שברים דו-גדיליים של DNA ברקמות שונות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר הסרטן, כגון כיצד נוצרת חוסר יציבות גנטית בתאי גידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין שבירות של מחרוזת כפולה של DNA בודד, וכי ניתן לנתח את תהליכי התיקון.

שתדגים את ההליך תהיה סוזן ברנדל, טכנאית במעבדה שלנו. התחל את הניסוי בהכנת תמיסות, החל מתמיסת המלאי נוגדת הקרישה עם 200 יחידות בינלאומיות של הפרין למיליליטר ב-0.9 אחוז נתרן כלורי. מלאו כל אחד מצינורות האיסוף בשני מיליליטר של תמיסת מלאי נוגדי קרישה לפני משיכת דגימות הדם או מח העצם.

לאחר מכן, הכינו את תמיסת 10X Lysis לתאים אדומים עם 82.91 גרם אמוניום כלוריד, 7.91 גרם אמוניום ביקרבונט ושני מיליליטר של תמיסת חומצה אתילנדיאמנטית מולרית 0.5 ל-pH של 8.0 על ידי המסת החומרים במים מזוקקים כפולים לנפח כולל של ליטר אחד. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הקיבוע על ידי הוספת 8.3 מיקרוליטר של תמיסת אשלגן הידרוקסיד טוחנת אחת ל-360 מיליגרם של פרפורמלדהיד, או PFA, בצינור מיקרוטיטר. מלאו את הצינור במי מלח עם פוספט, או PBS, עד לסימן המיליליטר של הצינור וחממו את הצינור בבלוק חימום ב-95 מעלות צלזיוס כדי לקבל מיליליטר אחד של תמיסת PFA של 36 אחוז

העבירו את המיליליטר האחד של תמיסת PFA של 36 אחוז לצינור של 15 מיליליטר. והוסף שמונה מיליליטר PBS כדי לקבל תמיסת מלאי PFA של תשעה מיליליטר וארבעה אחוזים. קחו את תמיסת מלאי ה-PFA של ארבעה אחוזים ואחסנו אותה בטמפרטורה שלילית של 18 מעלות צלזיוס עד לשימוש לקיבוע תאים.

לאחר מכן, הכינו את תמיסת החדירה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של אוקטוקסינול 9 עד 50 מיליליטר של PBS כדי לקבל תמיסה של כ-0.1 אחוז אוקטוקסינול 9. לבסוף, הכינו תמיסות חוסמות של חמישה אחוזים ושני אחוזים על ידי ערבוב החומר חוסם החלבון עם PBS. כדי להכין את דגימות הדם או מח העצם, אחזר את הצינורות המלאים בשני מיליליטר של תמיסת המלאי נוגדת הקרישה.

משוך שבעה מיליליטר דם או מח עצם לכל צינור בתנאים סטריליים על ידי ניקוב ורידים או ניקוב מח עצם בהתאמה. אחסן את הדגימות במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר האחסון למשך הלילה, יש לדלל את דגימת הדם ההפרינית אחת לאחת עם PBS ואת דגימת מח העצם ההפריני ביחס של אחד לשלושה עם PBS.

תלו את התאים בעדינות על ידי משיכתם פנימה והחוצה מהפיפטה פעמיים. לאחר מכן, הוסף נפח אחד של מדיום שיפוע צפיפות לצינור טרי. שכבו בעדינות את הדם המדולל או מח העצם על גבי מדיום שיפוע הצפיפות והקפידו לא לערבב את שתי השכבות.

צנטריפוגה את הצינור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ו -400 גרם.משוך את שכבת הפלזמה העליונה בעזרת פיפטה. לאחר מכן, קצרו בזהירות את התאים החד-גרעיניים בשכבה שמעל מדיום שיפוע הצפיפות. העבירו את התאים החד-גרעיניים לצינור טרי והוסיפו לפחות שלושה נפחים של PBS.

תלו את התאים בעדינות על ידי משיכתם פנימה והחוצה מהפיפטה פעמיים. צנטריפוגה את הצינור. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט.

הוסף 10 מיליליטר של תמיסת ליזה של ארבע מעלות צלזיוס 1x לתאים אדומים. השעו מחדש את התאים בעדינות על ידי משיכתם פנימה והחוצה מהפיפטה פעמיים והניחו את הצינור על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 30 מיליליטר PBS בארבע מעלות צלזיוס וצנטריפוגה את הצינור.

השתמש במיקרו חרוזי CD34 ובעמודות הפרדת תאים לבידוד תאים חיוביים CD34. הכן שני ציטו-ספינים עם תאים חד-גרעיניים של דגימות המטופל על ידי צנטריפוגה של אחת כפול 10 חמשת התאים לכל תכשיר. תקן את התאים עם 200 מיקרוליטר של ארבעה אחוז PFA למשך 10 דקות.

לאחר הקיבוע יש לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר PBS למשך חמש דקות כל אחד על שייקר. לאחר מכן, לחדור לתאים עם 200 מיקרוליטר של 0.1 אחוז אוקטוקסינול 9 למשך 10 דקות. שטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר של תמיסת חסימה של חמישה אחוזים למשך חמש דקות כל אחד על שייקר מעבדה.

חסום את התאים ב-30 מיליליטר של תמיסת חסימה טרייה של חמישה אחוזים למשך שעה. הקיבוע והחדירה של התאים עם 4 אחוז פרפורמלדהיד ב-0.1 אחוז אוקטוקסינול 9 משמר את מוקדי הגמא-H2AX ו-53BP1 באופן מובהק. דגרו תכשיר אחד של התאים עם נוגדן חד-שבטי נגד גמא-H2AX של עכבר ואת התכשיר השני של התאים עם נוגדן חד-שבטי נגד גמא-H2AX של עכבר ונוגדנים נגד 53BP1 של ארנב רב-שבטי למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

מומלץ מאוד להשתמש בנוגדנים מוכחים נגד גמא-H2AX ואנטי-53BP1. לאחר הדגירה, שטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר של תמיסת חסימה של שני אחוזים לכל חמש דקות בשייקר מעבדה. לאחר מכן, דגרו את ההכנה הראשונה של התאים עם נוגדן משני נגד עכברים מצומד Alexa 488 מדולל אחד ל-500 בתמיסת חסימה של שני אחוזים.

דגרו את התכשיר השני של התאים עם נוגדן משני נגד עכברים מצומד של אלקסה 488 ונוגדנים משניים נגד ארנבים מצומדים של אלקסה 555 מדולל אחד מכל 500 לתמיסה חוסמת של שני אחוזים. שטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר PBS על שייקר מעבדה. הסר את ה- PBS והרכיב את התאים עם מדיום הרכבה.

הניחו בזהירות החלקת כיסוי על גבי מדיום ההרכבה כך שלא יוטבעו בועות אוויר. המתן לפחות שלוש שעות עד שמדיום ההרכבה יתקשה לפני ניתוח התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לבסוף, נתח את מוקדי הגמא-H2AX ו-53BP1 בגרעיני התא עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים עבור DAPI, Alexa 488 ו-Cy3 במהלך הדמיה בהגדלה של 100x אובייקט.

ניתוח מוקדי גמא-H2AX בתאים הוא המדויק ביותר בשלב G0 G1 ובשלב G2 כאשר מוקדי גמא-H2AX מופיעים כנקודות פלואורסצנטיות נפרדות כפי שמוצג בתמונה מייצגת זו של פיברובלסטים. לעומת זאת, ניתוח מוקדי גמא-H2AX בתאים במהלך שלב S מסובך על ידי כתמי גמא-H2AX פאן-גרעיניים מפוזרים הנגרמים על ידי תהליך השכפול. צביעה אימונופלואורסצנטית של גמא-H2AX שימשה לכימות של שברים דו-גדיליים של DNA ברקמות מוקרנות והבהירה כי רמות מוקדי גמא-H2AX בלימפוציטים מוקרנים פרופורציונליות למינון ההקרנה.

לוקליזציה משותפת של מוקדי גמא-H2AX ו-53BP1 בתאים חיוביים ל-CD34 של חולה עם לוקמיה מיאלואידית חריפה מצביעה על קידום של מנגנוני תיקון לא הומולוגיים לא הומולוגיים בתיווך 53BP1 באתרים של שבירת גדיל כפול של DNA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית גמא-H2AX ו-53BP1 לניתוח שבירות גדיל כפול של DNA. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונובלוטינג של כספומט הקשור לזרחן, ATR, צ'ק פוינט קינאז 1, צ'ק פוינט קינאז 2 ו-TP53 בתאי גידול על מנת לנתח שינויים בתגובת הנזק ל-DNA.