Name: מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: למד מיקרוסקופיית immunofluorescence של γH2AX ו-53BP1 לניתוח קריעות DNA דו-גדיליות ותהליכי תיקון בתאי גידול. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברמת תא בודד של נזק גנטי ומנגנוני יציבות גנומית במחקר סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט נתמך על ידי קרן לוקמיה קאררס חוסה (DJCLS 14 R/2017) הגרמני.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ה השני ועדת האתיקה של מנהיים בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת היידלברג. נכתב מדעת הושג מאנשים כל.
 1. הכנה של חומרים <ol><li>פתרון מניות קרישה: להכין פתרון מניות קרישה של הפארין I.U. 200 לכל מ ב- 0.9% נתרן כלורי. למלא כל אחד הצינורות אוסף (לצייר כרך 9 מ ל) 2 מ של הפתרון מניות קרישה לפני נסיגה של דגימות דם או מח עצם.</li>
	<li>פתרון פירוק כדוריות אדומות: הכן 10 x פתרון פירוק כדוריות אדומות עם 82.91 g אמוניום כלוריד, 7.91 ג'י אמוניום ביקרבונט, 2 מ ל תמיסה חומצית ethylenediaminetetraacetic 0.5 M ל pH של 8.0 על ידי המסת הסוכנים ב מזוקק פעמיים מים עבור הנפח הכולל של 1 ל'</li>
	<li>קיבוע פתרון: 8.3 להוסיף µL של 1 מ' אשלגן הידרוקסידי פתרון 360 מ"ג paraformaldehyde (PFA) צינור microtiter. ממלאים את הצינור buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לסימון 1 מ"ל של הרכבת התחתית, חום הצינורית בתוך גוש חימום ב 95 ° C כדי לקבל 1 מ"ל של פתרון PFA 36%. להעביר את הפתרון מחברים של 36% 1 מ"ל צינור עם קיבולת של 15 מ"ל. הוסף 8 מ"ל PBS הפתרון PFA 36% 1 מ"ל, להשיג 9 מ של פתרון מניות של כדורגלן 4%. 4% PFA פתרון מלאי החנות ב-18 ° C עד ולהשתמש עבור קיבעון של תאי aliquot. 
	התראה: 1) אשלגן הידרוקסידי פתרון הוא מאכל. להיות מודע העין והגנה על העור. 2) כדורגלן הוא מסרטנים. להימנע במגע עם העור אינהלציה. להכין את הפתרון קיבוע ברדס.</li>
	<li>Permeabilization פתרון: להוסיף 50 µL Octoxinol 9-50 מ"ל PBS כדי לקבל פתרון כ- 0.1% Octoxinol 9-</li>
	<li>חוסם פתרון: להכין 5% 2% חסימת פתרונות על ידי ערבוב הסוכן חסימת חלבון עם PBS, חנות-6 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. הכנת הדגימות <ol><li>Fibroblasts בתרבות תא: מטפחים fibroblasts האנושי של הקו תא NHDF ב 5% humidified האווירה 2 CO ב 37 מעלות צלזיוס בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% עגל עוברית סרום, 4 מ מ גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
	<ol><li>הכנת שקופית מיקרוסקופ עם חסיד fibroblasts <ol><li>הסר המדיום הבקבוק (אזור הצמיחה של 2 75 ס מ) עם שמתקדמות NHDF fibroblasts. להוסיף 10 מ"ל PBS הבקבוקון. לשטוף את fibroblasts חסיד בעדינות ע י ניעור באופן ידני את הבקבוקון עבור מינימלית 1</li>
			<li>להסיר את PBS ולהוסיף טריפסין 1 מ"ל לתוך הבקבוק. לנער את הבקבוק בעדינות כדי לוודא כי כל תאים חסיד מכוסים על ידי טריפסין. הסר את טריפסין הבקבוקון. לשים את הבקבוק לתוך החממה במשך 5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>לקחת את הבקבוק מתוך החממה ולהוסיף 10 מ"ל RPMI 1640 בינוני לתוך הבקבוק. Pipette של המדיום לאורך מספר פעמים כדי לפזר את fibroblasts.</li>
			<li>פיפטה 0.3 מיליליטר fibroblasts מפוזרת על גבי כל אחד מהשדות שני של השקופית מיקרוסקופ ולשים את השקופית לתוך החממה במשך 24 שעות ביממה כך fibroblasts לדבוק השקופית. עבור immunostaining של γH2AX ו 53BP1 ב הגרעינים של fibroblasts, נעבור לשלב 3.1.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>דגימות החולה <ol><li>ודגימות הדם: להשתמש הצינורות אוסף מילוי עם 2 מ"ל של הפתרון מניות קרישה ולהוסיף 7 מ ל דם לתוך הצינורות. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 ° C). למחרת, לבודד את שלב G0/G1 קייזרכרכט תאי תאי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (שלב 2.2.3).</li>
		<li>דגימות מח עצם: להשתמש הצינורות אוסף מילוי עם 2 מ"ל של הפתרון מניות קרישה (שלב 1.1) ולהוסיף מח עצם 7 mL לתוך הצינורות. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 ° C). למחרת, לבודד את שלב G0/G1 קייזרכרכט תאי תאי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (שלב 2.2.3). השתמש CD34 גרגרי וסלולרי ההפרדה עמודות עבור הבידוד של תאי CD34 +.</li>
		<li>בידוד תאי תאי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות 
		הערה: תאי תאים מבודדים דגימות מח עצם ודם על ידי צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות 17 , 18 , 19.
		<ol><li>Dilute את דגימת הדם heparinized על יחס של 1:1 עם PBS ולדגום את מח העצם heparinized על יחס של 1:3 עם PBS. להשעות את התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים.</li>
			<li>להוסיף נפח של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור טריים. בעדינות שכבת דם מדולל או מח עצם על המדיום הדרגתיות צפיפות. הקפידו לא לערבב שתי שכבות.</li>
			<li>Centrifuge הצינור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, 400 x ג להרחיק את השכבה העליונה פלזמה עם פיפטה. ואז בזהירות לקצור תאי תאי השכבה שמעל המדיום הדרגתיות צפיפות. העברת תאי תאי לתוך צינור טריים.</li>
			<li>להוסיף לפחות שלושה כרכים של PBS תאי תאי בצינור. להשעות את התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים. Centrifuge את הצינור 10 דקות-בטמפרטורת החדר ו- g x 400</li>
			<li>לאחר הספין להסיר את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל של 4 ° C, 1 x פתרון פירוק כדוריות אדומות. Resuspend התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים, ולמקם את הצינורית על קרח למשך 5 דקות. ואז להוסיף 30 מ ל PBS ב 4 ° C, centrifuge את הצינור 10 דקות-בטמפרטורת החדר ו- g x 400</li>
		</ol></li> <li>הכנת cytospins <ol><li>להכין שני cytospins עם תאי תאי של הדגימות החולה (קרי, cytospin אחד עבור צביעת immunofluorescence γH2AX, cytospin אחד עבור γH2AX ו- 53BP1 משולב immunofluorescence מכתים) על ידי צנטריפוגה (x 300 גרם, 10 דקות) של 1.0 x 10 5 תאים עבור כל הכנה ( איור 3 ו-4)-</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX, צביעת Immunofluorescence 53BP1 <ol><li>קיבעון, permeabilization: לתקן את התאים עם 200 µL של 4% PFA למשך 10 דקות. לאחר קיבוע, לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של PBS למשך 5 דקות כל על המעבדה מטרף. ואז permeabilize את התאים עם 200 µL של 0.1% Octoxinol 9 עבור 10 דקות לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של 5% פתרון חסימה למשך 5 דקות כל על המעבדה מטרף. לחסום את התאים 30 מ של טרי 5% חסימת פתרון עבור ה 1</li>
	<li>הדגירה עם נוגדנים <ol><li>דגירה בתכשיר אחד של התאים עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX העכבר (שבערך) והכנות אחרות של התאים עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX העכבר (שבערך) ו- a נוגדן anti-53BP1 ארנב polyclonal (שבערך) בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>לאחר דגירה לשטוף את התאים בעדינות 3 פעמים עם 30 מ של 2% חסימה פתרון עבור כל 5 דקות על מטרף המעבדה.</li>
		<li>להסיר הפתרון חסימה, דגירה ההכנה הראשונים של התאים עם עז Alexa488 מצומדת אנטי-העכבר המשני נוגדן (שבערך) והכנת השני את התאים עם (נוגדן אנטי עכבר משני עז מצומדת-Alexa488 שבערך) ואת החמור Alexa555 מצומדת ארנב אנטי משני נוגדן (שבערך) לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li> <li>הרכבה בינונית: לשים את השקופית הכוללת התאים בקערה ולשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של PBS עבור כל 5 דקות על המעבדה מטרף. הסר את PBS והר התאים הרכבה בינונית המכיל 4, 6-diamidino-2-phenylindole. בזהירות לשים את coverslip על המדיום הרכבה כך אין בועות אוויר משובץ. לחכות לפחות 3 h עבור התקשות של המדיום הרכבה לפני ניתוח בתאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.</li>
</ol> 4. ניתוח של γH2AX ושל 53BP1 מוקדים <ol><li>קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה: לנתח את מוקדים γH2AX ו 53BP1 ב גרעינים תא עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד מסננים דאפי, 488 אלקסה של Cy3 במהלך דימות-מטרה X 100 ההגדלה. שיא תמונות עם מצלמה ולעבד את התמונות עם תוכנת הדמיה המתאימה.</li>
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , 
 <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
<li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li>
<li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li>
<li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li>
<li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX+in+cancer+cells%3A+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics%2C+prediction+and+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li>
<li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li>
<li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair%3A+53BP1+comes+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li>
<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+White+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX, 53BP1 היא שיטה שימושית לניתוח היווצרות ותיקון של DSB, בקשת רחבה של תחומי מחקר. פרמטרים קריטיים המשפיעים על התוצאה של הניסויים הם השלב של מחזור התא, הסוכנים המשמש את הקיבעון ואת permeabilization של התאים, הבחירה של הנוגדנים, ורכיבי חומרה ותוכנה של המיקרוסקופ זריחה.
ההשפעה של מחזור התא על דפוסי מוקדים γH2AX הודגם על ידי שמתקדמות נורמלי fibroblasts של הקו תא NHDF. מוקדים γH2AX הופיע כנקודות פלורסנט נפרדות בתוך ה-G0/G1 G2 שלבים לעומת ספאקלס התפזרו ...

הדנ א פגום באופן רציף על ידי אנדוגני (למשל, השכפול מתחים, מינים חמצן תגובתי, חוסר יציבות פנימי של ה-DNA), אקסוגני (למשל, רדיקלים כימי, הקרנה) מקורות (איור 1)1,2 3, ,4. בין נזק לדנ א, מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) נגעים רציני במיוחד, עשוי לגרום מוות של תאים או carcinogenesis. כ-50 DSB שעלולים להתעורר לכל מחזור התא ותא.5. בתרבית של תאים, רקומבינציה הומולוגית (HR) והצטרפות nonhomologous סוף-(NHEJ) פיתח כמו מסלולים עיקריים עבור התיקון של DSB (איור 2). HR מתרחשת בשלב מאוחר S/G2 ומשתמש אחות שלם כרומטידה כתבנית לתיקון פוטנציאלי ללא שגיאות. לשם השוואה, NHEJ הוא פעיל במהלך מחזור התא, פוטנציאל מוטגניות כפי בסיסי זוגות ניתן להוסיף או resected לפני מצדו של הקצוות השבורים. בנוסף, סוף-הצטרפות אלטרנטיבית עשויים להיות עסוקים כמנגנון איטי מוטגניות גיבוי תיקון במקרה של NHEJ מחסור6,7.
DSB לגרום זירחון של היסטון H2AX-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase סביב כל DSB. מוקדים הגרעין ויוצרים נקראים γH2AX מוקדים, ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence8. ΓH2AX מקדמת את גיוס נוסף DSB מגיב חלבונים, ומעורב כרומטין שיפוץ, תיקון ה-DNA, ואת האות התמרה חושית9. כמו כל פוקוס γH2AX נחשב לייצוג של DSB יחיד, כימות של DSB על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence הוא אפשרי, אשר הוכח שורות תאים סרטן, דגימות מטופלים10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא חלבון מפתח אחר במתווכים DSB תיקון. . מעורב בלשכת הגיוס של DSB מגיב חלבונים, מחסום איתות את synapsis של DSB קצוות15. בנוסף, 53BP1 ממלאת תפקיד קריטי בבחירת מסלול תיקון DSB. זה מפעיל התיקון של DSB לכיוון NHEJ אמנם HR מנעו16. בהתחשב בפונקציות מקורית של γH2AX ו- 53BP1 תיקון DSB, ניתוח בו זמנית של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות שיטה שימושית עבור ניתוח מדויק של היווצרות והתיקון של DSB.
כתב יד זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע immunofluorescence מיקרוסקופיה של γH2AX ושל 53BP1 בתוך גרעין התא. באופן ספציפי, השיטה מיושמת fibroblasts נורמלי של קו תא NHDF, רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא, תאי CD34 + של חולה עם לוקמיה מיאלואידית חריפה. הפרטים של השיטה הם הצביע בהקשר של התוצאות שהוצגו.

<table><tbody><tr><td>מדיום RPMI</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R0883</td><td>מדיום לתרבית תאים</td></tr><tr><td>יחס נתרן הפרין</td><td></td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp; הפרין 5,000 יחב"ל / מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת נתרן כלורי 0.9%</td> <td>B. בראון</td><td>PZN 1957154</td><td>רכיב בתמיסת המלאי נוגד הקרישה</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>מדיום לבידוד תאים חד-גרעיניים</td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין 10X</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>59427C</td><td>אנזים לדיסוציאציה של פיברובלסטים בתרבית תאים</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>בידוד של תאי אב מיאלואידים CD34+</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ אבחון</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>שקופיות מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מגפוגה 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp; צנטריפוגה שולחנית&nbsp;</td></tr><tr>מכשיר <td></td><td></td><td></td><td>ציטוספין</td></tr><tr><td>מכסה</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>מכסה לעבודה ללא מיקרו צינורות</td></tr><tr><td>מיכל Cyto מיכל</td><td>Heraeus</td><td>75003416</td><td>Cyto עם 2 קדחים חרוטיים</td></tr><tr><td>מנשא</td><td>קליפ Heraeus</td><td>75003414</td><td>מנשא להחזקת מיכל cyto ומגלשה</td></tr><tr><td>הכנס תמיכה</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td><td>תמיכה הכנס עבור אוחז במנשא קליפ</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>חומר ניקוי לחדירות קרומי התאים</td></tr><tr><td>תמיסת אשלגן הידרוקסיד 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>הכרחי להכנת תמיסת הפרפורמלדהיד</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6148</td><td>חומר קיבוע</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537</td><td>תמיסת מלח מאוזנת</td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>סוכן חוסם</td></tr><tr><td>עכבר חד שבטי אנטי וגמא; נוגדן H2AX (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>נוגדן ראשוני לזיהוי &גמא; H2AX</td></tr><tr><td>נוגדן ארנב פוליקלונלי נגד 53BP1 (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>נוגדן ראשוני לזיהוי 53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-מצומד עז נגד עכבר נוגדן</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-חמור מצומד נוגדן נגד ארנב</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>Vectashield הרכבה בינונית</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-1200</td><td>מכילה DAPI לצביעה של DNA</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Zeiss</td><td>490035</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>קובייה מגניבה 1 מצלמת CCD</td><td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td><td>מערכת מצלמה להקלטה</td></tr><tr><td>דיגיטלית תוכנת Isis</td><td>Metasystems</td><td>לא ישימה</td><td>תוכנת מיקרוסקופ</td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופ immunofluorescence של γh2ax ו 53bp1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-dna

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) הם נגעים DNA רציני. ניתוח היווצרות ותיקון של DSB רלוונטי, בקשת רחבה של תחומי מחקר כולל גנום שלמות, genotoxicity, קרינה ביולוגיה, הזדקנות, סרטן של פיתוח תרופות. בתגובה DSB, היסטון H2AX הוא phosphorylated-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase ויוצרים foci גרעיני דיסקרטית לזיהוי על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. בנוסף, 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא עוד חלבון מגיב DSB חשוב בקידום תיקון של DSB ומצטרף nonhomologous סוף-תוך מניעת רקומבינציה הומולוגית. על פי הפונקציות ספציפית של γH2AX, 53BP1, ניתוח משולב של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות גישה סבירה עבור ניתוח מפורט של DSB. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורטות בתוספת הערות שיטתי על ביצוע הטכניקה. באופן ספציפי, ההשפעה של מחזור התא על דפוסי מוקדים γH2AX הוא הפגינו fibroblasts נורמלי של הקו תא NHDF. יתר על כן, הערך של מוקדים γH2AX כמו סמן מתואר רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא. לבסוף, אי-יציבות גנטית ייחקר בתאים CD34 + של מטופל עם לוקמיה מיאלואידית חריפה על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים הוא המדויק ביותר בין שלב G0/G1 לשלב G2 כאשר מוקדים γH2AX מופיעים כנקודות פלורסנט ברורים (איור 5A). לעומת זאת, ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים במהלך שלב S הינו מסובך γH2AX פאן-גרעיני התפזרו ספאקלס הנגרמת על ידי תהליך השכפול (איור 5B).
קיבוע התאים בוצעה עם 4% מחברים (10 דקות), permeabilization עם 0.1% Octoxinol 9 (10 דקות). מתנול ניתן להשתמש עבור ק...

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

המטרה הכוללת של מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית גמא-H2AX ו-53BP1 היא לנתח את היווצרותם ותיקון של שברים דו-גדיליים של DNA ברקמות שונות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר הסרטן, כגון כיצד נוצרת חוסר יציבות גנטית בתאי גידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין שבירות של מחרוזת כפולה של DNA בודד, וכי ניתן לנתח את תהליכי התיקון.מי שתדגים את ההליך תהיה סוזן ברנדל, טכנאית במעבדה שלנו. התחל את הניסוי בהכנת תמיסות, החל מתמיסת המלאי נוגדת הקרישה עם 200 יחידות בינלאומיות של הפרין למיליליטר ב-0.9 אחוז נתרן כלורי. מלאו כל אחד מצינורות האיסוף בשני מיליליטר של תמיסת מלאי נוגדי קרישה לפני משיכת דגימות הדם או מח העצם.לאחר מכן, הכינו את תמיסת 10X Lysis לתאים אדומים עם 82.91 גרם אמוניום כלוריד, 7.91 גרם אמוניום ביקרבונט ושני מיליליטר של תמיסת חומצה אתילנדיאמנטית מולרית 0.5 ל-pH של 8.0 על ידי המסת החומרים במים מזוקקים כפולים לנפח כולל של ליטר אחד. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הקיבוע על ידי הוספת 8.3 מיקרוליטר של תמיסת אשלגן הידרוקסיד טוחנת אחת ל-360 מיליגרם של פרפורמלדהיד, או PFA, בצינור מיקרוטיטר. מלאו את הצינור במי מלח עם פוספט, או PBS, עד לסימן המיליליטר של הצינור וחממו את הצינור בבלוק חימום ב-95 מעלות צלזיוס כדי לקבל מיליליטר אחד של תמיסת PFA של 36 אחוז.העבירו את המיליליטר האחד של תמיסת PFA של 36 אחוז לצינור של 15 מיליליטר. והוסף שמונה מיליליטר PBS כדי לקבל תמיסת מלאי PFA של תשעה מיליליטר וארבעה אחוזים. קחו את תמיסת מלאי ה-PFA של ארבעה אחוזים ואחסנו אותה בטמפרטורה שלילית של 18 מעלות צלזיוס עד לשימוש לקיבוע תאים.לאחר מכן, הכינו את תמיסת החדירה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של אוקטוקסינול 9 עד 50 מיליליטר של PBS כדי לקבל תמיסה של כ-0.1 אחוז אוקטוקסינול 9. לבסוף, הכינו תמיסות חוסמות של חמישה אחוזים ושני אחוזים על ידי ערבוב החומר חוסם החלבון עם PBS. כדי להכין את דגימות הדם או מח העצם, אחזר את הצינורות המלאים בשני מיליליטר של תמיסת המלאי נוגדת הקרישה.משוך שבעה מיליליטר דם או מח עצם לכל צינור בתנאים סטריליים על ידי ניקוב ורידים או ניקוב מח עצם בהתאמה. אחסן את הדגימות במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר האחסון למשך הלילה, יש לדלל את דגימת הדם ההפרינית אחת לאחת עם PBS ואת דגימת מח העצם ההפריני ביחס של אחד לשלושה עם PBS.תלו את התאים בעדינות על ידי משיכתם פנימה והחוצה מהפיפטה פעמיים. לאחר מכן, הוסף נפח אחד של מדיום שיפוע צפיפות לצינור טרי. שכבו בעדינות את הדם המדולל או מח העצם על גבי מדיום שיפוע הצפיפות והקפידו לא לערבב את שתי השכבות.צנטריפוגה את הצינור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ו -400 גרם.משוך את שכבת הפלזמה העליונה בעזרת פיפטה. לאחר מכן, קצרו בזהירות את התאים החד-גרעיניים בשכבה שמעל מדיום שיפוע הצפיפות. העבירו את התאים החד-גרעיניים לצינור טרי והוסיפו לפחות שלושה נפחים של PBS.תלו את התאים בעדינות על ידי משיכתם פנימה והחוצה מהפיפטה פעמיים. צנטריפוגה את הצינור. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט.הוסף 10 מיליליטר של תמיסת ליזה של ארבע מעלות צלזיוס 1x לתאים אדומים. השעו מחדש את התאים בעדינות על ידי משיכתם פנימה והחוצה מהפיפטה פעמיים והניחו את הצינור על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 30 מיליליטר PBS בארבע מעלות צלזיוס וצנטריפוגה את הצינור.השתמש במיקרו חרוזי CD34 ובעמודות הפרדת תאים לבידוד תאים חיוביים CD34. הכן שני ציטו-ספינים עם תאים חד-גרעיניים של דגימות המטופל על ידי צנטריפוגה של אחת כפול 10 חמשת התאים לכל תכשיר. תקן את התאים עם 200 מיקרוליטר של ארבעה אחוז PFA למשך 10 דקות.לאחר הקיבוע יש לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר PBS למשך חמש דקות כל אחד על שייקר. לאחר מכן, לחדור לתאים עם 200 מיקרוליטר של 0.1 אחוז אוקטוקסינול 9 למשך 10 דקות. שטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר של תמיסת חסימה של חמישה אחוזים למשך חמש דקות כל אחד על שייקר מעבדה.חסום את התאים ב-30 מיליליטר של תמיסת חסימה טרייה של חמישה אחוזים למשך שעה. הקיבוע והחדירה של התאים עם 4 אחוז פרפורמלדהיד ב-0.1 אחוז אוקטוקסינול 9 משמר את מוקדי הגמא-H2AX ו-53BP1 באופן מובהק. דגרו תכשיר אחד של התאים עם נוגדן חד-שבטי נגד גמא-H2AX של עכבר ואת התכשיר השני של התאים עם נוגדן חד-שבטי נגד גמא-H2AX של עכבר ונוגדנים נגד 53BP1 של ארנב רב-שבטי למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.מומלץ מאוד להשתמש בנוגדנים מוכחים נגד גמא-H2AX ואנטי-53BP1. לאחר הדגירה, שטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר של תמיסת חסימה של שני אחוזים לכל חמש דקות בשייקר מעבדה. לאחר מכן, דגרו את ההכנה הראשונה של התאים עם נוגדן משני נגד עכברים מצומד Alexa 488 מדולל אחד ל-500 בתמיסת חסימה של שני אחוזים.דגרו את התכשיר השני של התאים עם נוגדן משני נגד עכברים מצומד של אלקסה 488 ונוגדנים משניים נגד ארנבים מצומדים של אלקסה 555 מדולל אחד מכל 500 לתמיסה חוסמת של שני אחוזים. שטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר PBS על שייקר מעבדה. הסר את ה- PBS והרכיב את התאים עם מדיום הרכבה.הניחו בזהירות החלקת כיסוי על גבי מדיום ההרכבה כך שלא יוטבעו בועות אוויר. המתן לפחות שלוש שעות עד שמדיום ההרכבה יתקשה לפני ניתוח התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לבסוף, נתח את מוקדי הגמא-H2AX ו-53BP1 בגרעיני התא עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים עבור DAPI, Alexa 488 ו-Cy3 במהלך הדמיה בהגדלה של 100x אובייקט.ניתוח מוקדי גמא-H2AX בתאים הוא המדויק ביותר בשלב G0 G1 ובשלב G2 כאשר מוקדי גמא-H2AX מופיעים כנקודות פלואורסצנטיות נפרדות כפי שמוצג בתמונה מייצגת זו של פיברובלסטים. לעומת זאת, ניתוח מוקדי גמא-H2AX בתאים במהלך שלב S מסובך על ידי כתמי גמא-H2AX פאן-גרעיניים מפוזרים הנגרמים על ידי תהליך השכפול. צביעה אימונופלואורסצנטית של גמא-H2AX שימשה לכימות של שברים דו-גדיליים של DNA ברקמות מוקרנות והבהירה כי רמות מוקדי גמא-H2AX בלימפוציטים מוקרנים פרופורציונליות למינון ההקרנה.לוקליזציה משותפת של מוקדי גמא-H2AX ו-53BP1 בתאים חיוביים ל-CD34 של חולה עם לוקמיה מיאלואידית חריפה מצביעה על קידום של מנגנוני תיקון לא הומולוגיים לא הומולוגיים בתיווך 53BP1 באתרים של שבירת גדיל כפול של DNA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית גמא-H2AX ו-53BP1 לניתוח שבירות גדיל כפול של DNA. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונובלוטינג של כספומט הקשור לזרחן, ATR, צ'ק פוינט קינאז 1, צ'ק פוינט קינאז 2 ו-TP53 בתאי גידול על מנת לנתח שינויים בתגובת הנזק ל-DNA.

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

כימות של גדיל הדנ"א הכפול פסים באמצעות היווצרות γH2AX כסמן המולקולרית הפכה כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור כימות γH2AX מוקדים לאחר חשיפה לקרינה של תאים.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

Quantitation של גדיל הדנ"א הכפול נשבר על בסיס γH2AX מוקדים הפך כלי רב ערך, במיוחד בביולוגיה קרינה, להערכת radiosensitivity רקמות ההשפעות של תרכובות קרינה שינוי. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

ניתוח מיקרוסקופי של γH2AX מוקדים, אשר הטופס הבא זירחון של H2AX ב Ser-139 בתגובה פעמיים גדיל הדנ"א נשבר, הפך להיות כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן השתמשנו נוגדנים מונו מפוגל היסטון H3 ב ליזין 4 כסמן epigenetic של euchromatin פעיל לתעתוק, כדי להעריך את הפריסה המרחבית של היווצרות γH2AX קרינה הנגרמת בתוך הגרעין.

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת האימונופלואורסנציה כדי לדמיין את הלוקליזציה של חלבוני תיקון הדנ"א γH2AX ו- 53BP1 באתרים של הפסקות DNA דו-גדילי בגרעין התא המוקרנ.

הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי כדי לזהות חלבונים ספציפיים של תגובת נזק לדנ"א הממוקמים באתרים של שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאים חד-גרעיניים אנושיים. החלבונים מזוהים על ידי נוגדנים ראשוניים ספציפיים, אשר בתורם נקשרים לנוגדנים משניים המתויגים בפלואורופור הפולטים פלואורסצנט במהלך הדמיה מיקרוסקופית, ומאפשרים הדמיה של החלבונים כמוקדים פלואורסצנטיים נפרדים בתוך גרעיני התא.

מיקרוסקופ אימונופלואורסנציה לניתוח שברים דו-גדיליים של DNA

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא הוקמה במלואה. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לזהות וקדי המושרה קרינה (רי ' ף) של תיקון חלבונים על ידי immunofluorescence כתמים של סרטן המעי הגס האנושי התאים לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרות ותיקון של פריצות דו-גדילי DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעינים בין-פאזיים של לימפוציטים היקפיים אנושיים שטופלו בבלומיצין.

אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומהיר לזיהוי אינטראקציה של חלבונים באתרי נזק לדנ"א.

בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

למד מיקרוסקופיית immunofluorescence של γH2AX ו-53BP1 לניתוח קריעות DNA דו-גדיליות ותהליכי תיקון בתאי גידול. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברמת תא בודד של נזק גנטי ומנגנוני יציבות גנומית במחקר סרטן.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

גלה סרטונים נוספים