ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תבניות זריעת תאים מותאמות אישית המשמשות לייצור טבעות רקמה בהרכבה עצמית במידות שונות. שיטה זו מאפשרת לנו ליצור טבעות רקמה תלת מימדיות מתאים אנושיים שניתן להשתמש בהן כדי להעריך את מבנה הרקמה, חוזקה ותפקודה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה פשוטה לייצור תבניות לרקמות בהרכבה עצמית במידות מותאמות אישית.

כדי להתחיל בהליך, השתמש בתוכנת עיצוב בעזרת מחשב כדי ליצור ציור של תבנית במידות הרצויות. שלח את קובץ ה-CAD למדפסת תלת מימד ברזולוציה גבוהה. מדפיסים את התבנית בפלסטיק בגימור מבריק ויציב ב-50 מעלות צלזיוס.

שוטפים היטב את התבנית המודפסת בעזרת מברשת, חומר ניקוי ומים. שוטפים את התבנית במים מזוקקים, ונותנים לה להתייבש באוויר ברשת. חשוב לבחור פלסטיק מודפס בתלת מימד יציב בטמפרטורת הריפוי של PDMS.

שאריות המועברות ל-PDMS במהלך החימום עלולות להשפיע על היווצרות הטבעת. לאחר מכן, מדוד 25 גרם של בסיס PDMS בסירת שקילה חד פעמית. מוסיפים חומר ריפוי ביחס של 1:10 לפי משקל ומערבבים במרץ עד שהבסיס וחומר הריפוי מעורבבים היטב.

לאחר מכן, תקן סרט מעבדה סביב דפנות התבנית ליצירת קיר בגובה של כסנטימטר אחד סביב הפנים עם הבארות המודפסות. ודא שאין פערים בקיר הקלטת. יוצקים את תערובת ה-PDMS לתבנית המודפסת בתלת מימד.

הסר את הגז מה-PDMS בתא ואקום למשך 30 עד 60 דקות או עד שלא נשארות בועות. רפאו את ה-PDMS ב-50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות או עד שה-PDMS מוצק מספיק כדי להסיר אותו מהתבנית. לאחר מכן, הסר את הסרט והפרד בזהירות את נגטיב ה-PDMS מהתבנית.

דגרו את ה-PDMS השלילי בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להבטיח שהוא נרפא במלואו. לאחר מכן, שטפו היטב את השלילי עם חומר ניקוי ומים. שוטפים את התבנית במים מזוקקים ונותנים לה להתייבש באוויר.

לפני ייצור תבנית האגרוז, יש לבצע חיטוי של נגטיב ה-PDMS, זוג מלקחיים קהים וכל כלי רצוי אחר. כדי להתחיל בייצור, הכינו וחיטו לפחות 50 מיליליטר של שני אחוז אגרוז ב-DMEM. הכן בארות אגרוז יום אחד לפני זריעת הטבעת.

פיפטה ארבעה מיליליטר של אגרוז מותך לתוך נגטיב ה-PDMS האוטומטי, תוך הקפדה לא למלא יתר על המידה את התבנית. לאחר מכן, פיפטה מותכת אגרוז לתוך החללים עבור עמודי באר האגרוז. השתמש בקצה הפיפטה כדי להסיר את כל בועות האוויר.

משטח האגרוז הסופי חייב להיות שטוח. מניחים לאגרוז להתקרר כ -10 דקות. לאחר מכן, השתמש במלקחיים קהים כדי להפריד בזהירות את תבנית האגרוז המקוררת מהשלילי PDMS.

מניחים את התבנית עם הפנים כלפי מעלה בבאר אחת של צלחת שש בארות. הוסף היטב את מדיום התרבות השלם המתאים לצלחת כך שבארות האגרוז יהיו שקועות לחלוטין. אזנו את בארות האגרוז ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה לפני השימוש.

ראשית, בצלחת תרבית של 15 סנטימטרים, תרבית תאי שריר חלק אבי העורקים של חולדה ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5 אחוז פחמן דו חמצני עד להשגת מפגש של 70 אחוז. לאחר הכנת תבנית האגרוז הרצויה ואיזון במהלך הלילה, שטפו את צלחת התרבות פעמיים עם חמישה מיליליטר מי מלח עם פוספט. לאחר הסרת PBS, הוסיפו למנה שלושה מיליליטר של 0.25 אחוז טריפצין.

דגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים-שלוש דקות או עד שהתאים התרוממו מהצלחת. נטרל את הטריפזין עם שלושה מיליליטר ממדיום התרבות השלם. העבירו את התאים לצינור חרוטי, והעבירו בעדינות את התאים עד להשעיה יסודית.

לדלל אליקווט של תרחיף התאים בנפח שווה של צבע כחול טריפאן, ולספור את התאים בעזרת המוציטומטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את המתלה ב -200 פעמים G למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים במדיום תרבית שלם כדי להשיג ריכוז של 10 מיליון תאים למיליליטר.

השלבים החשובים ביותר להבטחת היווצרות טבעת עקבית הם אופטימיזציה של מספר התאים ומדיום התרבית עבור קו התאים שבו אתה משתמש. לאחר מכן, השג את בארות האגרוז המאוזנות. שאפו בזהירות את כל התווך הן סביב החלק החיצוני של האגרוז, והן בתוך בארות האגרוז, והקפידו לא לנקב את קרקעית הבארות.

פיפטה 50 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באר. מוסיפים שני מיליליטר של מדיום טרי סביב החלק החיצוני של בארות האגרוז מבלי לתת למדיום להישפך לבארות. דגרו על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של חמישה אחוזי CO2 כדי לאפשר לתאים להצטבר.

לאחר מכן, שאפו את המדיום מחוץ לאגרוז. מוסיפים היטב 4.5 מיליליטר מדיום טרי לצלחת כך שבארות האגרוז יתמלאו וכל תבנית האגרוז שקועה לחלוטין. המשיכו לדגור את הצלחת עד שטבעות הרקמה יתפתחו מספיק, והחליפו את המדיום בכל יום.

לאחר מכן, החלק בעדינות כל טבעת רקמה ממקומה באמצעות מלקחיים. מיד, תקן את הטבעות להיסטולוגיה, או השתמש בטבעות להערכות פונקציונליות או מכניות. הדפסת תלת מימד אפשרה עיצוב תבניות גמיש יותר.

קוטר העמודים השתנה בקלות, כפי שהוצג טבעות תאי השריר החלק של החולדה שלי שיוצרו סביב עמודים בקוטר של שניים, ארבעה ושנים-עשר מילימטרים. טבעות רקמה הוכנו גם מ-SMCs אנושיים ראשוניים, תאי גזע מזנכימליים אנושיים ו-SMCs שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. הטבעות שימשו כמודלים של רקמות במבחנה להערכות של תפקוד הרקמה וחוזק מכני.

למרות ששיטה זו תוכננה במקור לייצר ולדגמן רקמת כלי דם, ניתן להשתמש בה גם לייצור מקטעים של סוגי רקמות אחרים, כגון סחוס, שריר השלד ורקמת לב. שיטה זו מספקת דרך פשוטה לחוקרים ליצור תבניות מותאמות אישית לייצור טבעות רקמה תלת מימדיות במידות שונות. ניתן להשתמש בטבעות אלו כדי להעריך מבנה, תכונות מכניות ותפקוד של רקמות מהונדסות העשויות מסוגי תאים שונים.