ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D
2 באפריל 2018
פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה בדיית רקמות עצמית שהורכב טבעות בגדלים משתנים באמצעות תבנית מותאמת אישית פלסטיק מודפס 3D. PDMS התשלילים נרפאים ב כייר מודפס 3D; אז agarose הוא ליהק את התשלילים PDMS נרפא. התאים הם נזרע לתוך בארות agarose וכתוצאה מכך היכן הם מצטברים לטבעות רקמות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תבניות זריעת תאים מותאמות אישית המשמשות לייצור טבעות רקמה בהרכבה עצמית במידות שונות. שיטה זו מאפשרת לנו ליצור טבעות רקמה תלת מימדיות מתאים אנושיים שניתן להשתמש בהן כדי להעריך את מבנה הרקמה, חוזקה ותפקודה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה פשוטה לייצור תבניות לרקמות בהרכבה עצמית במידות מותאמות אישית.
כדי להתחיל בהליך, השתמש בתוכנת עיצוב בעזרת מחשב כדי ליצור ציור של תבנית במידות הרצויות. שלח את קובץ ה-CAD למדפסת תלת מימד ברזולוציה גבוהה. מדפיסים את התבנית בפלסטיק בגימור מבריק ויציב ב-50 מעלות צלזיוס.
שוטפים היטב את התבנית המודפסת בעזרת מברשת, חומר ניקוי ומים. שוטפים את התבנית במים מזוקקים, ונותנים לה להתייבש באוויר ברשת. חשוב לבחור פלסטיק מודפס בתלת מימד יציב בטמפרטורת הריפוי של PDMS.
שאריות המועברות ל-PDMS במהלך החימום עלולות להשפיע על היווצרות הטבעת. לאחר מכן, מדוד 25 גרם של בסיס PDMS בסירת שקילה חד פעמית. מוסיפים חומר ריפוי ביחס של 1:10 לפי משקל ומערבבים במרץ עד שהבסיס וחומר הריפוי מעורבבים היטב.
לאחר מכן, תקן סרט מעבדה סביב דפנות התבנית ליצירת קיר בגובה של כסנטימטר אחד סביב הפנים עם הבארות המודפסות. ודא שאין פערים בקיר הקלטת. יוצקים את תערובת ה-PDMS לתבנית המודפסת בתלת מימד.
הסר את הגז מה-PDMS בתא ואקום למשך 30 עד 60 דקות או עד שלא נשארות בועות. רפאו את ה-PDMS ב-50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות או עד שה-PDMS מוצק מספיק כדי להסיר אותו מהתבנית. לאחר מכן, הסר את הסרט והפרד בזהירות את נגטיב ה-PDMS מהתבנית.
דגרו את ה-PDMS השלילי בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להבטיח שהוא נרפא במלואו. לאחר מכן, שטפו היטב את השלילי עם חומר ניקוי ומים. שוטפים את התבנית במים מזוקקים ונותנים לה להתייבש באוויר.
לפני ייצור תבנית האגרוז, יש לבצע חיטוי של נגטיב ה-PDMS, זוג מלקחיים קהים וכל כלי רצוי אחר. כדי להתחיל בייצור, הכינו וחיטו לפחות 50 מיליליטר של שני אחוז אגרוז ב-DMEM. הכן בארות אגרוז יום אחד לפני זריעת הטבעת.
פיפטה ארבעה מיליליטר של אגרוז מותך לתוך נגטיב ה-PDMS האוטומטי, תוך הקפדה לא למלא יתר על המידה את התבנית. לאחר מכן, פיפטה מותכת אגרוז לתוך החללים עבור עמודי באר האגרוז. השתמש בקצה הפיפטה כדי להסיר את כל בועות האוויר.
משטח האגרוז הסופי חייב להיות שטוח. מניחים לאגרוז להתקרר כ -10 דקות. לאחר מכן, השתמש במלקחיים קהים כדי להפריד בזהירות את תבנית האגרוז המקוררת מהשלילי PDMS.
מניחים את התבנית עם הפנים כלפי מעלה בבאר אחת של צלחת שש בארות. הוסף היטב את מדיום התרבות השלם המתאים לצלחת כך שבארות האגרוז יהיו שקועות לחלוטין. אזנו את בארות האגרוז ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה לפני השימוש.
ראשית, בצלחת תרבית של 15 סנטימטרים, תרבית תאי שריר חלק אבי העורקים של חולדה ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5 אחוז פחמן דו חמצני עד להשגת מפגש של 70 אחוז. לאחר הכנת תבנית האגרוז הרצויה ואיזון במהלך הלילה, שטפו את צלחת התרבות פעמיים עם חמישה מיליליטר מי מלח עם פוספט. לאחר הסרת PBS, הוסיפו למנה שלושה מיליליטר של 0.25 אחוז טריפצין.
דגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים-שלוש דקות או עד שהתאים התרוממו מהצלחת. נטרל את הטריפזין עם שלושה מיליליטר ממדיום התרבות השלם. העבירו את התאים לצינור חרוטי, והעבירו בעדינות את התאים עד להשעיה יסודית.
לדלל אליקווט של תרחיף התאים בנפח שווה של צבע כחול טריפאן, ולספור את התאים בעזרת המוציטומטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את המתלה ב -200 פעמים G למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים במדיום תרבית שלם כדי להשיג ריכוז של 10 מיליון תאים למיליליטר.
השלבים החשובים ביותר להבטחת היווצרות טבעת עקבית הם אופטימיזציה של מספר התאים ומדיום התרבית עבור קו התאים שבו אתה משתמש. לאחר מכן, השג את בארות האגרוז המאוזנות. שאפו בזהירות את כל התווך הן סביב החלק החיצוני של האגרוז, והן בתוך בארות האגרוז, והקפידו לא לנקב את קרקעית הבארות.
פיפטה 50 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באר. מוסיפים שני מיליליטר של מדיום טרי סביב החלק החיצוני של בארות האגרוז מבלי לתת למדיום להישפך לבארות. דגרו על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של חמישה אחוזי CO2 כדי לאפשר לתאים להצטבר.
לאחר מכן, שאפו את המדיום מחוץ לאגרוז. מוסיפים היטב 4.5 מיליליטר מדיום טרי לצלחת כך שבארות האגרוז יתמלאו וכל תבנית האגרוז שקועה לחלוטין. המשיכו לדגור את הצלחת עד שטבעות הרקמה יתפתחו מספיק, והחליפו את המדיום בכל יום.
לאחר מכן, החלק בעדינות כל טבעת רקמה ממקומה באמצעות מלקחיים. מיד, תקן את הטבעות להיסטולוגיה, או השתמש בטבעות להערכות פונקציונליות או מכניות. הדפסת תלת מימד אפשרה עיצוב תבניות גמיש יותר.
קוטר העמודים השתנה בקלות, כפי שהוצג טבעות תאי השריר החלק של החולדה שלי שיוצרו סביב עמודים בקוטר של שניים, ארבעה ושנים-עשר מילימטרים. טבעות רקמה הוכנו גם מ-SMCs אנושיים ראשוניים, תאי גזע מזנכימליים אנושיים ו-SMCs שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. הטבעות שימשו כמודלים של רקמות במבחנה להערכות של תפקוד הרקמה וחוזק מכני.
למרות ששיטה זו תוכננה במקור לייצר ולדגמן רקמת כלי דם, ניתן להשתמש בה גם לייצור מקטעים של סוגי רקמות אחרים, כגון סחוס, שריר השלד ורקמת לב. שיטה זו מספקת דרך פשוטה לחוקרים ליצור תבניות מותאמות אישית לייצור טבעות רקמה תלת מימדיות במידות שונות. ניתן להשתמש בטבעות אלו כדי להעריך מבנה, תכונות מכניות ותפקוד של רקמות מהונדסות העשויות מסוגי תאים שונים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה ליצירת טבעות רקמה המורכבות באופן עצמי בגדלים שונים באמצעות תבנית מודפסת בתלת-ממד בהתאמה אישית. התהליך כולל ייצור של תבניות שליליות מ-PDMS ויציקת אגרוז ליצירת בארות לצורך אגרגציה של תאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסת רקמות
- תרבית תאים
- הדפסה בתלת-ממד
רקע
- ניתן להשתמש בטבעות רקמה בהרכבה עצמית כדי לחקור את מבנה הרקמה ותפקודה.
- הדפסה בתלת-ממד מאפשרת עיצובים מותאמים אישית של תבניות.
- ניתן להחיל טכניקה זו על סוגי רקמות שונים, כולל רקמות כלי דם ורקמות לב.
- אופטימיזציה של מספר התאים ותנאי התרבית חיונית להצלחה ביצירת טבעות רקמה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה לייצור טבעות רקמה בעלות ממדים ספציפיים.
- הערכת התכונות המכניות והתפקודיות של רקמות מהונדסות.
- אספקת פלטפורמה למחקר של סוגי תאים שונים בהנדסת רקמות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- תכנון תבניות באמצעות תוכנת CAD והדפסתן בתלת-ממד מפלסטיק יציב.
- יצירת תבניות שליליות מ-PDMS ובארות אגרוז עבור זריעת תאים.
- זריעת תאים לתוך בארות האגרוז והמתנה לצבירתם לטבעות רקמה.
- הערכת טבעות הרקמה שנוצרו מבחינת תכונות מבניות ותפקודיות.
תוצאות עיקריות
- טבעות רקמה נוצרו בהצלחה מסוגי תאים שונים, כולל תאי שריר חלק אנושיים.
- השיטה הדגימה גמישות בתכנון התבנית וביצירת הרקמה.
- הטבעות שימשו להערכות in vitro של תפקוד הרקמה ועמידות מכנית.
- ממדים שונים של טבעות רקמה הושגו על ידי שינוי קשרי הגודל של העמודים בתבניות.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ואפקטיבית ליצירת טבעות רקמה מותאמות אישית.
- ניתן להתאימו ליישומים שונים בהנדסת רקמות.
- הטכניקה משפרת את חקר הרקמות ההנדסיות ותכונותיהן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת לצוותי מו"פ בביופארמה לייצר טבעות רקמה הניתנות להתאמה אישית וללא פיגום (scaffold-free) לצורך מידול פרה-קליני, ובכך לתמוך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מועמדים טיפוליים. על ידי מתן שליטה מדויקת במימדי הרקמה ובהרכבה, היא מגבירה את הביטחון החזוי בתהליכי תיקוף מטרות ובפיתוח מערכי בדיקה (assays) בשלבים מוקדמים. גישה זו מפחיתה את ההסתמכות על מערכות מבוססות פיגום, ובכך משפרת את הרלוונטיות התרגומית (translational relevance) עבור סריקת תרופות ויישומי מידול מחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות טבעות רקמה המורכבות באופן עצמי, המבהירות את התפקוד של מסלולים ואת המעורבות של מטרות טיפוליות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת מערכת הניתנת לשחזור להערכת מודולציה של מטרות בהקשרי רקמה תלת-ממדיים.
- ערך ניבוי: משפר את מיון הפורטפוליו על ידי יצירת מדדים תפקודיים המתואמים עם תגובות ברמת הרקמה לתרכובות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר טבעות רקמה סטנדרטיות ללא פיגום (scaffold-free), המתאימות להערכה כמותית של השפעות תרכובות על מכניקה ותפקוד של רקמות.
- ערך תפעולי: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות ייצור הדיר של בארי agarose, ובכך מפחית שונות בסבבי סריקה עוקבים.
- יכולת הרחבה: מקל על שימוש חוזר בפלטפורמה עבור סוגי תאים ומודלי רקמות מרובים, ובכך תומך ברצפי הערכה יעילים של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי יצירת טבעות רקמה המדמות את מבנה הרקמה הטבעית ואת תכונותיה המכניות.
- מערכת רלוונטית למחלה: תומכת במידול של רקמות כלי דם, לב, שריר שלד וסחוס תוך שימוש במקורות של תאים ראשוניים או תאים נגזרים מתאי גזע.
- קידום מותאם סיכון: מספק מדדים תפקודיים והיסטולוגים המשמשים לקבלת החלטות של go/no-go לפני מחקרים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אפשור ייצור רקמות מונחה-השערה, המנחה את זיהוי המולקולות המובילות (leads) באמצעות פנוטיפ תפקודי ומכני.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לצוותים להעריך היווצרות רקמה, חוזק ותפקוד תלויי-מטרה בסביבת תלת-ממד מבוקרת.
- סריקה: מספקת טבעות רקמה מוכנות לבדיקה עם ממדים עקביים, המאפשרות סריקה מהימנה של תרכובות עבור פנוטיפים ברמת הרקמה.
- אנליטיקה: מספקת פלטים כמותיים הכוללים קוטר רקמה, כוח התכווצות וסמנים היסטולוגיים לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מבטיחה רציפות משלב הגילוי ועד לשימוש פרה-קליני על ידי יצירת מודלים של רקמה המתאימים להערכה מכנית, תפקודית והיסטולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציבה את זרימת העבודה של התבנית המודפסת בתלת-ממד כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר ליצירת טבעות רקמה מגוונות על פני פרויקטים וסוגי תאים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באינטראקציות בין רקמה למטרה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות ייצור תבניות הניתנות להתאמה אישית עם שונות נמוכה.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי כך שמאפשר חזרתיות מהירה של מודלי רקמה ללא ארטיפקטים הקשורים לפיגומים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתונים תפקודיים מוקדמים על מודלים של הנדסת רקמות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון CAD, הדפסה תלת-ממדית וטכניקות סטריליות לתרבית רקמה.
- נדרשת גישה למדפסת תלת-ממדית המסוגלת להפיק חלקים מפלסטיק מבריקים ויציבים בחום, וכן ציוד סטנדרטי להכנת PDMS/agarose.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי תכנון התבנית, צפיפויות זריעת תאים ותנאי תרבית לצורך קבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה לסוגי תאים או יעדי רקמה שונים, בייחוד בנוגע לריכוז ה-agarose ולקוטר העמוד.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך ביציקה מדויקת של agarose כדי למנוע דפורמציה של הבארות, וחשיבות האופטימיזציה של מספר התאים לכל באר להשגת היווצרות עקבית של טבעות.
