Name: בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: למדו לבודד ולטפח אבות עצבית ממוח עוברי ולאחר לידה לניתוח שינויים אפיגנטיים. שיטת ChIP זו מאפשרת חקר מתקדם של סימני היסטון H3K79me2 בהתפתחות המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים הנרייטה Bertemes שעזרת להקים פרוטוקול טיפוח CGN בתוך המעבדה. הנייר בשיטה זו נתמכה על ידי במימון DFG CRC992 אפיגנטיקה רפואי על ידי מימון לטלוויזיה. המחברים להכיר את התמיכה של קבוצת גלקסי פרייבורג (freiburg): Pavankumar Videm, ביורן Grüning, פרופסור רולף Backofen, ביואינפורמטיקה, אוניברסיטת פרייבורג, גרמניה ממומן על ידי שיתופי מחקר מרכז 992 אפיגנטיקה רפואי (DFG גרנט SFB 992/1/2012) גרמניה הפדרלית שר החינוך ואת המחקר (BMBF גרנט 031 A538A RBC (de. אי)).

<ol><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).</li>
<li>Kandel, E. R., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+breaking+down+scientific+barriers+to+the+study+of+brain+and+mind%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind.</a> Science. 290, 1113-1120 (2000).</li>
<li>Götz, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+development%3A+the+art+of+generating+cell+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Cortical development: the art of generating cell diversity.</a> Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).</li>
<li>Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+neural+precursor+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of neural precursor cell fate during development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).</li>
<li>Davis, A. A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-renewing+multipotential+stem+cell+in+embryonic+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex.</a> Nature. 372, 263-266 (1994).</li>
<li>Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+cortical+gliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).</li>
<li>McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+dependence+of+laminar+determination+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex.</a> Science. 254, 282-285 (1991).</li>
<li>Desai, A. R., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+restriction+in+fate+potential+by+neural+progenitors+during+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development.</a> Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).</li>
<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellum%3A+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li>
<li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).</li>
<li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).</li>
<li>Sanders, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H4+lysine+20+controls+recruitment+of+Crb2+to+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage.</a> Cell. 119, 603-614 (2004).</li>
<li>Martin, C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+histone+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of histone lysine methylation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).</li>
<li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation%3A+a+dynamic+mark+in+health%2C+disease+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).</li>
<li>Ng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+within+the+globular+domain+of+histone+H3+by+Dot1+is+important+for+telomeric+silencing+and+Sir+protein+association%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association.</a> Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).</li>
<li>Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+types+and+sites+of+histone+modifications+emerge+as+players+in+the+transcriptional+regulation+contest%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest.</a> FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).</li>
<li>Roidl, D., Hacker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+during+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methylation during neural development.</a> Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).</li>
<li>Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tale+beyond+the+tail%3A+histone+core+domain+modifications+and+the+regulation+of+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).</li>
<li>van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot1p+Modulates+Silencing+in+Yeast+by+Methylation+of+the+Nucleosome+Core%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core.</a> Cell. 109, 745-756 (2002).</li>
<li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190(2008).</li>
<li>Woo Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RE-IIBP+Methylates+H3K79+and+Induces+MEIS1-mediated+Apoptosis+via+H2BK120+Ubiquitination+by+RNF20%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20.</a> Sci. Rep. 5, 12485(2015).</li>
<li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. , (2016).</li>
<li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190(2008).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+mammalian+erythropoiesis+requires+the+Dot1L+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase.</a> Blood. 116, 4483-4491 (2010).</li>
<li>Cattaneo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L-mediated+H3K79me2+modification+critically+regulates+gene+expression+during+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation.</a> Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Af9%2FMllt3+interferes+with+Tbr1+expression+through+epigenetic+modification+of+histone+H3K79+during+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).</li>
<li>Roidl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L+Activity+Promotes+Proliferation+and+Protects+Cortical+Neural+Stem+Cells+from+Activation+of+ATF4-DDIT3-Mediated+ER+Stress+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dayt.+Ohio%22%5BJournal%5D)">DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9, R137(2008).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Roidl, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoidl%2C+D+%22Histone+modifications+during+cerebral+cortex+development%22">Histone modifications during cerebral cortex development</a>. , (2015).</li>
<li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP+with+Native+Chromatin%3A+Advantages+and+Problems+Relative+to+Methods+Using+Cross-Linked+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Mapping+Protein%2FDNA+Interactions+by+Cross-Linking%22%5BJournal%5D)">ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material.</a> Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).</li>
<li>Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cortical+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים לא מתחרה

ישנם שתי דרכים עיקריות לביצוע כרומטין immunoprecipitation כדי לזהות את תפוסת גנומית של שינויים היסטון, גורמי שעתוק, הקוראים קוד היסטון, סופרים או מחקים. אחת היא שיטת צ'יפ מקורי בעזרת נוקלאז מתעכל, יליד כרומטין עבור immunoprecipitation, והשני הוא הציג השיטה באמצעות כרומטין מחברים-קבוע, הוטו, שבו את נוקליאוזומים וחלבונים אחרים צמוד-DNA covalently מאוגדים ל- DNA 39. צ'יפ מקורי עם קצב זיהוי נוגדנים גבוה שלה צריך להיות ישימים עבור היסטון מתילציה מאז כרומטין, methylations היסטון יציבים יחסית לאורך השבב....

הפונקציות חושית, מוטורי, קוגניטיבי של המוח הם מורכבים מאוד רגישים לשינויים פיזיים וסביבתיים. המוח מורכב שלושה חלקים כללי הינד-, אמצע, הקדמי, אשר מחוברים עמוקות. בתוך הקדמי, ניתן לחלק את telencephalon של telencephalon הגבי (DT), של telencephalon הגחוני (וי טי). DT של עכברים מורכב שש שכבות קורטיקלית אשר נוצרים בין E11.5 לבין E18.5 אופן "הפוכה"1. VT כולל את הרוחביים ganglionic בפיתוח, המהווים את2,של גרעיני הבסיס3מאוחר יותר. מספר סוגי תאים יכולים להיות מסווגים במערכת העצבים המרכזית יונקים כמו נוירונים, האסטרוציטים או oligodendrocytes להפוך4, אשר להתפתח באופן מרחבי בעיות מפרק5. קודם כל, עצבי ובתאים (NPCs) להצמיח סוגים שונים של נוירונים, interneurons VT ולאחר ההקרנה נוירונים ב- DT, ובהמשך תאי גליה (למשל, האסטרוציטים6). במהלך פיתוח קורטיקלית, השכבה השטחית ביותר (שכבה אני), אשר מכיל תאים Cajal Retzius, נוצר לראשונה. לאחר מכן, בין E12.5 ו E14.5, NPCs צור עצביים לשכבות העמוקות (השישי, V) בזמן בין 14.5, 16.5, אבות להצמיח השכבה העליונה (IV-II) נוירונים7,8. זהות עצביים צוין על ידי מורפוגן-induced בעיות מפרק מרחבי תעתיק תוכניות שונות, בנוסף על-ידי תוכניות epigenetic2.
המוח הקטן, אשר הוא מעורב קואורדינציה, ממוקם על hindbrain ומפתחת בין E10 בערך P20 עכברים9. הוא מכיל קליפת אסטרוציטומה ואת הגרעינים אסטרוציטומה10. קליפת אסטרוציטומה למבוגרים מורכב משלוש שכבות, שבהפסד מולקולרית, השכבה Purkinje תא, השכבה הפנימית ביותר פרטנית המכיל נוירונים פרטנית10. התאים גרגר אסטרוציטומה הנוירונים הקטן ביותר, מייצגים כ- 80% של הנוירונים בכל המוח חוליות11. להתפתח סימנים מקדימים ממוקם באזור נבטי חיצוניים והם נודדים דרך השכבה Purkinje תא היעד שלהם12. כמו ב- telencephalon, ההתפתחות של הצרבלום מוסדר על ידי אורגניזם חשוב מספר, אשר יש פונקציות ספציפיות זמן-מרחב ותלוי וליזום תוכניות תעתיק10מוגדרים.
הפיתוח של שכבות קורטיקליים ו אסטרוציטומה נשלטת על ידי ביטוי גנים ברמת השעתוק של אורגניזם מסוים ועל, לכן, ידי המדינה כרומטין של ה-DNA. בתצוגה פשוטה, כרומטין הברית יכולה להיות מחולקת euchromatin כפעיל transcriptionally הטרוכרומטין כמו אזורים שקטים transcriptionally. נוקלאוזום היחידה הבסיסית של כרומטין מכיל שני עותקים של כל היסטון הליבה H2A, ויזת עבודה H2B, H3 ו- H4, מוקף 147 בסיסי זוגות של הדנ א13. שינויים היסטוניים עוברות שינוי מאוד post-translationally על ידי מתילציה, acetylation, זרחון, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, דיאמינציה פרולין isomerization14,15. היסטון ליזין מתילציה נחשב השינוי היסטון היציב ביותר ששולטת שעתוק, שכפול, רקומבינציה16, נזק לדנ א תגובה17, ו החתמה גנומית18. Lysines יכול להיות מונו, di- או תלת-מפוגל19 , מופיעים לא רק על זנבות היסטון נגיש, אלא גם בתוך תחום הכדוריים של שינויים היסטוניים20. Methylations ספציפי ב H3K4 ו H3K36 קשורים בעיקר עם euchromatin, methylations מסוים H3K9, H3K27 או H4K20 מצויים בעיקר באזורים heterochromatic, למרות כל שאריות ממוקמים בתוך הזנב היסטון14, 19,21. מתילציה H3K79 הינו ממוקם בתוך תחום הכדוריים היסטון, שויכה פעילות גנים ברמת השעתוק, אבל גם עם אזורים גנומית אינרטי transcriptionally22. השינוי אבולוציונית כולו מאז זה נצפתה שמרים, התימוס עגל, עוף ו האנושי23. מונו H3K79 di, trimethylation (H3K79me1, me2, me3) הם מזורז על ידי24,methyltransferases DOT1L25 היסטון גרעיני להגדיר תחום המכיל חלבון 2 (Nsd2)26. DOT1L הייתה שם התפשטות, DNA לתקן ו סלולריים reprograming27. אובדן Dot1l בעכברים מוביל למוות טרום לידתי סביב28,E10.529שלב התפתחותי. במהלך התפתחות הלב, בידול myocardiocyte, DOT1L חיוני עבור ג'ין ביטוי תקנה30. במערכת העצבים המרכזית, פונקציה DOT1L עשוי להיות מעורב בשפופרת פגמים בתעלה פיתוח31, מעורב בדיכוי Tbr1-ביטוי במהלך פיתוח הקדמי32, עשוי לתפקד בוויסות של ER-מתח התגובה הגנים33. תלויי-הקשר הפעלה או המדחיק הפעולה של H3K79me, במיוחד עם ויוו מצבים כמו הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית, הוא תאריך רק חלקית הבין32. מאז H3K79 מתילציה ממוקם בתחום הכדוריים היסטון 3, זה sterically פחות נגיש לעומת שינויים על זנבות היסטון גמיש23. כדי להבין את תפקוד H3K79 מתילציה, דרושות שיטות ניתוח לשחזור ואמין כדי לקבוע את מיקום שלה ואת הסביבה גנומית. שיטות העבודה אנו מציגים שיטות בידוד של אבות עצביות שונות (CPCs של קליפת המוח) ו- CGNPs עבור המוח הקטן, טיפול יעיל של מעכבי DOT1L שיטה שבב לנתח מתילציה H3K79 דרך qPCR או רצף זמן שונים נקודות במהלך הפיתוח קורטיקליים ו אסטרוציטומה. לקבלת מבט כולל על הפרוטוקול והאפשרויות שלה, ראה איור 1.

<table><tbody><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>קטגוריה:</חזק> נוגדן <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> דילול אימונובלוט 1:5000</td></tr><tr><td>אנטי-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> נוגדן <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> דילול כתם חיסון 1:3000</td></tr><tr><td>אנטי-H3K79me2</td><td>דיאגנוד</td><td>pAb-051-050</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> נוגדן <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> נוגדן ChIP</td></tr><tr><td>אנטי-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> נוגדן <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> דילול כתם חיסון 1:1000</td></tr><tr><td>אנטי-ארנב-IgG</td><td>דיאגנוד</td><td>C15410206</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> נוגדן <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> נוגדן ChIP Ctrl</td></tr><tr><td>אנטי-טובולין אלפא</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> נוגדן <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> דילול אימונובלוט 1:3000</td></tr><tr><td>אפו-טרנספרין (1 מ"ג/מ"ל)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1147</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לתוסף CCM</td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לטכנולוגיות CCM</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent G2940CA</td><td></td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לניתוח כרומטין גזוז</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> אולטרסאונד</td></tr><tr><td>חומצה בורית pH 8.4</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B6768</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לתרבית CPC</td></tr><tr><td>CFX Connect RT מערכת זיהוי PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ניתוח ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> מערכת איתור עבור qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> עבור</td></tr><tr><td>חלבון CGM Dynabeads A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> חרוזים מגנטיים, עבור ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> עיכוב DOT1L <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לעיכוב DOT1L בתרבית תאים</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמין טטראצטית</td><td>SERVA</td><td>39760.01<</td><td>חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> EDTA</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי 10% (v/v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לבידוד CPC ו-CGM</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5767</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לבידוד CGNP</td></tr><tr><td>גלוטתיון (1.25 מ"ג/מ"ל)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G4251</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> עבור CCM</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>קארל רות'</td><td>3187</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לקיבוע תאים</td></tr><tr><td>GoTaq mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ניתוח ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> תערובת מאסטר DNA פולימראז עבור qPCR</td></tr><tr><td>האנק' s Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-100</td><td>Category: Cell Culture קיצור/תגובה: HBSS</td></tr><tr><td>L-glutamine (200 מ"מ)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td>Category: Cell Culture קיצור/תגובה: עבור CCM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לתרבית CPC</td></tr><tr><td>ליתיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L4408</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק></td></tr><tr><td>תוסף LiCl N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> עבור CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> פלואורוספקטרומטר לכימות DNA</td></tr><tr><td>NEB ערכת הכנה לספריית אולטרה DNA הבאה עבור Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645S</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ניתוח ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> ערכה להכנת ספרייה</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos עבור Illumina</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ניתוח ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> אוליגוס להכנת ספרייה</td></tr><tr><td>מדיום נוירו-בזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> עבור CCM</td></tr><tr><td>NP-40 חלופי</td><td>קלביוכימיה</td><td>492016</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> עבור מאגר ChIP</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> PFA, לקיבוע תאים</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-ניאומיצין 1% (v/v)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> PSN, עבור CCM ו-CGM</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Life Technologies</td><td>10010023</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> PBS, לבידוד CPC</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ניתוח ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> ויזואליזציה של צבע לכימות DNA</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6407</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לבידוד CGNP</td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין הידרוברומיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P3655</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לתרבית CPC</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>תרמו פישר</td><td>AM9640G</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> KCl, עבור</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז</td><td>CGM רוש</td><td>4693159001</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> עבור ChIP</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>3115879001</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> עבור ChIP</td></tr><tr><td>Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> ערכה לטיהור DNA</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק> קיצור/תגובה: עבור ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td><td>Category: עיכוב DOT1L קיצור/תגובה: לעיכוב DOT1L בתרבית תאים</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>קארל רות</td>' <td>8551.1</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP קיצור/תגובה: </חזק> עבור מאגר אלוטיון</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>קארל רות'</td><td>9265</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> NaCl, עבור מאגר ChIP</td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>30970</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> עבור נתרן ChIP</td></tr><tr><td> דודצילסולפט</td><td>קארל רות'</td><td>183</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> SDS, עבור קיפוד ChIP</td></tr><tr><td>סוניק (SHH)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SRP6004</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לבידוד CGNP</td></tr><tr><td>סופראוקסיד דיסמוטאז (1 מ"ג/מ"ל)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7571</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> עבור CCM</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>Category: ChIP קיצור/תגובה: TRIS, עבור מאגר ChIP</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> עבור מאגר ChIP</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA 0,05% (w/v)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>59417C</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> תרבית תאים <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> לבידוד CPC</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td><חזק>קטגוריה:</חזק> ChIP <חזק>קיצור/תגובה:</חזק> להכנת חרוזים</td></tr><tr><td>מכשירי מעבדה אחרים: תא ספירת נויבאואר, אינקובטור, מסובב, שייקר, סט חיתוך, אמבט</td><td></td><td></td><td></td>מים</tr><tr><td>CCM: מדיום</td><td></td><td></td><td></td>תא קליפת המוח</tr><tr><td>CGM: מדיום</td><td></td><td></td><td></td> תרבית תאים CGNP</tr></tbody></table>

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation מארק

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

התפתחות המוח הוא תהליך מורכב, שבשליטת באופן מרחבי בעיות מפרק מעברי צבע של אורגניזם ותוכניות תעתיק שונה. בנוסף, שינויים epigenetic כרומטין, כמו היסטון מתילציה, יש תפקיד חשוב עבור ביסוס ושמירה על גורלם תא ספציפי בתוך התהליך הזה. הרוב המכריע של היסטון מתילציה מתרחשת על הזנב היסטון גמיש, הנגיש מכפילי היסטון, מחקים של חלבונים קורא היסטון. לעומת זאת, H3K79 מתילציה ממוקם בתחום הכדוריים היסטון 3, הייתה שם בפונקציות התפתחותיים שונים. מתילציה H3K79 אבולוציונית כולו, ניתן למצוא מגוון רחב של מינים של הומו ספיינס כדי האפייה. השינוי מתרחש בקרב אוכלוסיות תאים שונים בתוך אורגניזמים, כולל אבות עצבית. המיקום של מתילציה H3K79 בתחום הכדוריים של היסטון 3 מקשה להעריך. כאן, אנו מציגים שיטות כדי לבודד, קדמון קורטיקלית התרבות תאים (CPCs) של רקמת מוח קליפתי עובריים (E11.5-E14.5) או אסטרוציטומה נוירון פרטנית אבות (CGNPs) מרקמות כמחנכת (P5-P7), וכדי ביעילות immunoprecipitate H3K79me2 עבור ה-PCR כמותי (qPCR) ורצף הגנום כולו.

ערכת כללי של קדמון העצבי בידוד, טיפוח, שבב H3K79me2 ושיטות ניתוח שבב: איור 1 מציג תרשים זרימה כדי לבצע שבב H3K79me2 של ובתאים קורטיקלית בנקודות זמן שונות במהלך התפתחות המוח עובריים או של נוירון פרטנית אסטרוציטומה אבות בשלבים כמחנכת. כצעד ראשון, המוח צריך להיות מבודד, את telencephalon (בין E11.5 ו E14.5) או המוח הקטן (P5-P7) יש לאחזר. ניתן לנתח את מחוזות שונים telencephalon על-ידי חלוקתו DT ו VT. לאחר מכן הרקמה להיות הומוגני, המוצא לאגס עצבית ...

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח שינויים אפיגנטיים במהלך התפתחות המוח, במיוחד בקליפת המוח ובמוח הקטן. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון כיצד שינויים בהיסטון כמו מתילציה של H3K79 יכולים להשפיע על התפתחות שכבות קליפת המוח והמוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לחקור in vivo את השינויים בהיסטון, ספציפיים ללוקוס או בכל הגנום, באזורי מוח שונים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות.התחל עם מוחות מ-P5 עד P7 ועכברי MRI. הסר את כל קרומי המוח וכלי הדם. לאחר מכן העבירו שלושה עד חמישה מוח קטן לכל שבב לצינורות של 15 מיליליטר.שטפו את המוח הקטן עם גלוקוז HBSS לפני הצנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינורות כדי לאסוף את הרקמה. לאחר הכביסה הסופית, הומוגניזציה של המוח הקטן על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש עם פיפטה של מיליליטר עד שהשברים בגודל של 0.5 עד מילימטר אחד קוביות.הסר בעדינות את כל הנוזלים עד שנותרים 2.5 מיליליטר. לאחר מכן הוסף 0.05% טריפסין לתוך הצינור עם גלוקוז HBSS המכיל את המוח הקטן. ולדגור את הרקמה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.הפוך את הרקמה כל דקה עד שלוש דקות. לאחר הדגירה, עצרו את העיכול על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיום תרבית תאי CGNP, או CGM, ואספו את הרקמה על ידי צנטריפוגה כמו קודם. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והוסף מיליליטר CGM אחד.יש לשלש את הרקמה עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד, ולהימנע מהיווצרות בועות אוויר. לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר של CGM ומדגרים את התערובת במשך שתי דקות על קרח כדי ליישב שאריות רקמות. לאחר שהרקמה התייצבה, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 15 מיליליטר.לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של CGM לרקמה הנותרת וחזור על הליך הטריטורציה לפני קצירת הסופרנטנט והשלכת שאריות הרקמה. אסוף את הסופרנטנטים מכל צינור של 15 מיליליטר של רקמה וצנטריפוגה כדי לאסוף את תאי המוח הקטן. השעו מחדש את הגלולה ב -10 מיליליטר CGM.מכיוון שאסטרוציטים נצמדים מהר יותר וחזק יותר לפולי-D-ליזין מאשר CGNPs, הוסיפו עד ארבעה מיליליטר של תרחיף תאים לבארות של לוחות 6 בארות מצופים פולי-D-ליזין ודגרו במשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי להסיר אסטרוציטים. לנער את הצלחת, לאסוף את הסופרנטנט בצינור של 15 מיליליטר ואז לצנטריפוגה את הסופרנטנט כמו קודם. השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של CGM וספרו את התאים עם תא ספירה של נויבאואר.לאחר ארבע עד שש שעות, ה-CGNPs המודבקים נראים עגולים ומתרבים. זרעו את התאים ב-CGM על צלחות מצופות פולי-L-אורניתין ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-100% לחות יחסית. לאחר יום אחד במבחנה, או DIV1, רוב ה-CGNPs עגולים ומתרבים.חלק מה-CGNPs יתחילו להתמיין ויתחילו לצמוח מבליטות עצביות. כדי לתקן את התאים המתורבתים, הוסף עד מיליליטר אחד של 1% PFA ישירות לבארות המכילות CGNPs. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, מוסיפים 53 מיקרוליטר גליצין ושוטפים פעמיים עם שלושה מיליליטר PBS קר כקרח.השתמש במגרד תאים כדי לקצור את התאים במיליליטר אחד של PBS. העבירו את התאים לצינורות של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה למשך חמש דקות בחום של 1, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסף 700 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל מעכב פרוטאז ודגר את הדגימות למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.מערבל את הדגימות כל חמש דקות במהלך תקופה זו. לאחר הדגירה, חלקו את צינורות הדגימה כדי להבטיח שהנפח לא יעלה על 400 מיקרוליטר לצינור. לאחר מכן סוניקציה למשך 10 דקות בעוצמה מקסימלית כדי לגזור את הכרומטין של תאי הליזה.לאחר 10 דקות, מערבל את הדגימות ולאחר מכן חזור על הסוניקציה והמערבולת פעמיים נוספות. בדוק את הליזט עבור הגרעינים הנותרים באמצעות מיקרוסקופ ניגוד פאזה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות DAPI. גלולה את שאריות התאים על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בחום של 13, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.בסיום, השתמש בסופרנטנט לשלב הניקוי המקדים. כדי לנקות מראש את הדגימות, יש לשטוף תחילה 20 מיקרו ליטר של חרוזים מגנטיים לא מצומדים לכל דגימה ב-PBS Tween קר כקרח. הסר את הכביסה בעזרת מעמד מגנטי.לאחר מכן הוסיפו 600 מיקרוליטר של מאגר דילול ו-20 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים שטופים לכל דגימה לניקוי מוקדם ודגרו במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס על מסובב. לאחר הדגירה, הסר את החרוזים באמצעות מעמד מגנטי. לאחר מכן קח 5% מכל ליזאט כדגימות קלט והקפיא אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס.ניתן לבצע צימוד נוגדנים בזמן שהדגימות עוברות ניקוי מראש. שטפו 45 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של חלבון A לכל שבב עם PBS Tween קר כקרח, כמו קודם. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו מיליליטר PBS קר כקרח לחרוזים.לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוגרם של נוגדן לכל 45 מיקרוליטר חרוזים. דגירה במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס על מסובב כדי לקשור את הנוגדנים לחרוזים. לאחר שחלף זמן הדגירה, השעו מחדש חרוזים שטופים המחוברים לנוגדנים בנפח חרוז אחד של PBS קר כקרח.חלקו כל תמצית שנוקה מראש לשתי שפופרות של כ-643.5 מיקרוליטר. הוסף את אותו נפח של מאגר דילול וחרוזים הקשורים לנוגדנים ודגר את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה על מסובב. למחרת, שטפו את החרוזים עם בוגרי שבבים קרים כקרח אחד עד שלושה למשך 10 דקות כל אחד על מסובב בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שלוש שטיפות של חמש דקות עם מאגר TE.הוסף חוצץ פליטה ודלל במשך שעה אחת ב-1,400 סל"ד בשייקר בטמפרטורת החדר. לאחר שחלפה השעה, הוסף 10 מיקרוגרם של רנאז לכל דגימת שבב וחמישה מיקרוגרם לדגימות הקלט. דגרו את הדגימות על השייקר למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.לבסוף, הוסף 100 מיקרוגרם של Proteinase K לכל דגימת שבב ו-50 מיקרוגרם לכל קלט. דגירה למשך הלילה ב-65 מעלות צלזיוס ב-1,400 סל"ד. רמות הדימתילציה של H3K79 יורדות לאחר שלושה ימים של תרבית CPC ועיכוב DOT1L על ידי SGC 0946.QCPR לאחר ניתוח שבב גילה כי גנים עם רמות מתילציה גבוהות של היסטון-3-ליזין-79 בנקודת ההתחלה היו המגיבים ביותר לטיפול במעכב. גנים עם כיסוי דימתילציה נמוך יותר של H3K79 לא הראו שינוי משמעותי ברמות המתילציה. מפת חום זו מראה שרמות המתילציה של היסטון-3-ליזין-79 מגיעות לשיא סביב אתר התחלת השעתוק ויורדות לקראת אתר סיום השעתוק.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשבוע, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע משקעים חיסוניים של כרומטין על שינויים בהיסטון בתאי מוח מבודדים.

isolation-cultivation-neural-progenitors-followed-chromatin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית לחקר סימונים epigenetic ב הכרומטין כי רוב מבחני חוסר ברזולוציה תא בודד. נוירונים הם בדרך כלל התערבבו עם גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולאסוף גרעינים העצבית מהמוח האנושי.

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

כאן אנו מתארים כיצד לייצר, להתרחב, immunolabel תאים בהיפוקמפוס לאחר הלידה אבי עצביים (NPCs) בתרבות (3D) תלת ממדי. בשלב הבא, תוך שימוש בטכנולוגיות הדמיה היברידית, אנו מדגימים כיצד תמונות דיגיטליות של cryosections immunolabelled יכול לשמש כדי לשחזר ולמפות את המיקום המרחבי של תאים immunopositive ברחבי neurosphere 3D כולו.

חלבון לוקליזציה ב 3D תרבות גזע עצביים נייד: מתודולוגיה ויזואליזציה היברידי

פרוטוקול זה מדגים שיטות להקים סביבות 2 ד ו 3D ב אישית מעוצבת חדרי electrotactic, אשר יכולים לעקוב אחר...

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את...

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד תאי אב עצביים מושרים (iNPCs) שמקורם בפיברובלסטים אנושיים בוגרים. הוא מתאר את הצעדים הכרוכים בבידוד מושבות iNPC וגידולן בבארות מרובות בארות מצופות למינין בנוכחות אמצעי תרבות מתאימים המאפשרים את המשך ההתרבות וההתרחבות של אוכלוסיית iNPC.

בידוד מושבות תאי אב עצביים המושרים שמקורם בפיברובלסטים אנושיים בוגרים

סרטון זה מדגים את הבידוד והטיפוח של תאי אב עצביים במוח הקטן של גור עכברים. אבות נוירון גרגיר המוח הקטן מבודדים ומטוהרים באמצעות הידבקות דיפרנציאלית, ומסירים ביעילות אסטרוציטים. אבות מתורבתים אלה מתמיינים לאחר מכן לנוירונים גרגיריים צרבלריים.

בידוד וטיפוח אבות נוירונים גרעיניים של המוח הקטן מורין

מקור: Mendez, F. M. et al., Native Chromatin immunoprecipitation using Moine Tumor Tumor Neurospheres. J. Vis. exp. (2018). סרטון זה מדגים את הבידוד של קומפלקסים של חלבון-DNA מתאי נוירוספרה שמקורם בגידול מוח של עכבר באמצעות משקעים חיסוניים מקוריים של כרומטין. הוא מפרט את השלבים להכנת כרומטין, משקעים חיסוניים, שטיפה ועיכול חלבון לשחרור DNA לניתוח במורד הזרם.

כרומטין מקורי אימונו-משקעים של תאי נוירוספרה

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

מנגנוני epigenetic משתנים לעתים קרובות ב glioma. כרומטין immunoprecipitation יכול לשמש כדי לחקור את ההשלכות של שינויים גנטיים ב glioma הנובעות משינויים שינויים היסטון המסדירה שעתוק גנים ומבנה כרומטין. פרוטוקול זה מתאר כרומטין יליד immunoprecipitation על המוח מאתר הגידול neurospheres.

כרומטין יליד Immunoprecipitation באמצעות המוח מאתר הגידול Neurospheres

אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור טנדם כרומטין רצף immunoprecipitation (tChIP-Seq) המאפשרת הניתוח של שינוי היסטון הגנום כולו ייחודיים לסוג התא.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

למדו לבודד ולטפח אבות עצבית ממוח עוברי ולאחר לידה לניתוח שינויים אפיגנטיים. שיטת ChIP זו מאפשרת חקר מתקדם של סימני היסטון H3K79me2 בהתפתחות המוח.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

גלה סרטונים נוספים