חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

אנו מציגים פרוטוקולים עבור בידוד של מעיים 3D מבנים מרקמות ויוו ומוטבעים במבחנה המרתף מטריקס organoids, ואת קיבוע שונות פרט מכתים פרוטוקולים אופטימיזציה עבור תיוג חיסונית של microtubule, חלבונים centrosomal, מהחיבור באותה מידה כמו תא סמני כולל החלבון בתאי גזע Lgr5.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד אורגנואידים במעי משובצים מטריצת מרתף תלת מימדית במבחנה ולאחר מכן לתקן ולתייג את המיקרו-צינורות והאורגנואידים הצנטרוזומיים proteins. 3D במבחנה הם מודלים אידיאליים לחקר שאלות ביולוגיות מרכזיות בביולוגיה תאית והתפתחותית. אבל לוקליזציה של חלבונים ומבנים אנדוגניים במודלים תלת-ממדיים היא מורכבת יותר מאשר בתרביות דו-ממדיות.

חשוב לציין, הקיבוע צריך לשמר את הארכיטקטורה התלת-ממדית העדינה תוך שמירה על האנטיגניות של הנוגדנים. השיטות המוצגות כוללות בידוד, קיבוע ותיוג חיסוני של אורגנואידים במעי תלת מימדיים במבחנה. אך ניתן להשתמש בפרוטוקולי הקיבוע והתיוג החיסוני גם ברקמות מבודדות ex vivo.

היתרון העיקרי של פרוטוקול קיבוע המתנול פורמלדהיד המוצג הוא בכך שהוא משמר את המבנים התלת מימדיים תוך שמירה על אנטיגניות. הוא מאפשר חדירה ופינוי טוב של נוגדנים לתיוג יעיל של מיקרו-צינורות, חוטי אקטין וחלבוני קישור ומספר חלבונים צנטרוזומיים כולל נינין. מי שידגים את ההליך יהיו ד"ר דבורה גולדספינק, פוסט-דוקטורנטית רשמית במעבדה שלי, ודוקטור זואי מתיוס, מחברת שותפה.

לאחר בידוד קריפטות מעיים ווילי, ניתן לתקן מבני אפיתל מבודדים לצביעה חיסונית. הקריפטות המבודדות יכולות להיות מושבות לסירוגין בתוך כיפות מטריצה אשר לאחר מכן ייצרו אורגנואידים. לאחר כחמישה עד שבעה ימים של דגירה, ייווצרו אורגנואידים.

השתמש ב -500 מיקרוליטר של RT-PBS כדי לשטוף את הבארות המכילות את כיפות מטריצת המרתף עם אורגנואידים. לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת התאוששות תאים קרים לכל באר. לאחר מכן, בעזרת מיקרופיפטה P1000, מגרדים את כיפות מטריצת המרתף ומעבירים בזהירות למעלה ולמטה לאורך הבאר כדי לפרק ולהסיר את מטריצת המרתף מהפלסטיק.

ודא שתמיסת ההתאוששות קרה כדי לסייע בפירוק המטריצה. בעת גירוד, השתמש רק במיקרופיפטה P1000 כדי שלא תפרק את האורגנואידים ושהם יישארו שלמים. אסוף את הסופרנטנט בצינורות מיקרו-צנטריפוגה בעלי קשירה נמוכה של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, הפוך את הצינור מספר פעמים ובדוק במיקרוסקופ לפעמים בהגדלה של 50 שהאורגנואידים בודדו, נעים בחופשיות ואינם בגושים. גלולה את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב -1, 000 גרם וטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את מגיב השחזור והמשך מיד לקיבוע.

כדי לתקן אורגנואידים שבודדו בעבר עם פורמלדהיד ומתנול, השעו מחדש את האורגנואידים בתמיסת קיבוע מתנול פורמלדהיד שלילית של 20 מעלות צלזיוס. דגרו על האורגנואידים בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס במקפיא למשך 15 דקות, והפכו את הצינור כל חמש דקות. לאחר מכן, גלולה את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב -1, 000 גרם למשך חמש דקות.

הסר את הקיבוע ולאחר מכן הוסף את תמיסת הכביסה המורכבת מ-PBS עם סרום של 1% נוגדנים משניים או PBS עם 0.1% חומר ניקוי ו-1% סרום. לאחר גלולת הדגימה כמו קודם, הסר את תמיסת הכביסה והשהה מחדש את הדגימה בתמיסת כביסה טרייה. השתמש במסובב צינור כדי לשטוף את התאים למשך שעה בסך הכל, לגלול את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה כל 15 דקות ולהחליף את תמיסת הכביסה.

כדי לחסום את דגימות האורגנואידים במעי, הוסף 10% סרום של מיני נוגדנים משניים ל-PBS. גלולה את האורגנואידים ב-1,000 גרם למשך חמש דקות והוציאו את הסופרנטנט. הוסף תמיסת חסימה אחת של מיליליטר לכל דגימה שתדגור בנוגדנים השונים.

לאחר מכן, דגרו את הדגימות ואת תמיסת החסימה על מסובב צינור בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדנים העיקריים ב-PBS המכילים 10% סרום ו-0.1% חומר ניקוי. לאחר מכן, לאחר סיבוב הדגימות והסרת תמיסת החסימה, השתמש בתמיסת הנוגדנים העיקרית כדי להשעות מחדש את גלולת האורגנואיד.

סובב את הצינורות ב-20 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לשמור על האורגנואידים בתרחיף. למחרת, החזירו את הדגימות לטמפרטורת החדר על מסובב הצינור למשך שעה. לאחר סיבוב הדגימה, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת כביסה לכל צינור והשהה מחדש את כדורי האורגנואיד.

לאחר מכן, הסר מיד את התמיסה באמצעות צנטריפוגה. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת שטיפה טרייה וערבב את התאים על מסובב צינור ב -20 סל"ד למשך שעתיים. לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדנים המשניים ב-PBS עם 1% סרום ו-0.1% חומר ניקוי.

לאחר מכן, לאחר גלולת הרקמה, השעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית. דגרו את הצינורות על מסובב צינור בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר סיבוב והסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה בתמיסת כביסה ומיד צנטריפוגה את הדגימות כדי לגלול את האורגנואידים.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תמיסת שטיפה טרייה. מערבבים את הדגימות על מסובב צינור בטמפרטורת החדר למשך 1.5 עד שעתיים, ומחליפים את תמיסת הכביסה כל 20 עד 30 דקות כמתואר קודם לכן. כדי להרכיב את האורגנואידים, לאחר סיבוב והסרת כל תמיסת הכביסה, הוסף שתי טיפות של מדיום הרכבה קשיח עם מגיב נגד דהייה לגלולה.

חותכים את הקצה של מיקרופיפטה P200 ומשעים בזהירות את הגלולה במדיום ההרכבה. בעת השעיית אורגנואידים קבועים ומוכתמים במדיום הרכבה, היזהר לא להכניס בועות. אם קיימות בועות, אפשר להן לצוף אל פני השטח ולאחר מכן הימנע מהעברתן למגלשה.

השתמש במיקרופיפטה כדי להוציא את האורגנואידים עם מדיום הרכבה בקו לאורך מרכז שקופית מיקרוסקופ. לאחר מכן, הניחו בזהירות כיסוי מעל והימנעו מיצירת בועות. הנח את שקופית הזכוכית בספר שקופיות ואחסן במקרר למשך הלילה להתייצבות אמצעי ההרכבה לפני ניתוח במיקרוסקופ קונפוקלי.

מוצגות כאן תמונות משבר 2 של רקמת מעי דק מבודדת המכילה גם villi וגם קריפטות ודגימה משבר 3 המכילה בעיקר קריפטות. כפי שניתן לראות בתמונות אלה, שימור ותיוג טובים של מיקרו-צינורות ואקטין הן בווילי והן בקריפטה הושגו באמצעות פרוטוקול קיבוע פורמלדהיד מתנול ותיוג חיסוני המתואר בסרטון זה. אורגנואידים במעי הדק נוצרו וגודלו במטריצת מרתף במשך שלושה שבועות או יותר, ואז בודדו כפי שמודגם בסרטון זה.

התאים הממוינים בתחומי ה-Organoid villus מכילים מיקרו-צינורות אפיקובזאליים יציבים שסומנו היטב ברוב המקרים. ניתן היה לראות את EB1 גם לאורך סריג המיקרו-צינורות. מוצג כאן אורגנואיד בשלב הציסטה ובשלב מוקדם של התפתחות קריפטות.

שתי הדגימות נקבעו במתנול פורמלדהיד וסומנו עם תווית חיסונית למיקרו-צינורות ונינין, מה שמדגים שימור ותיוג טובים של מיקרו-צינוריות במרכזי ארגון מיקרו-צינוריות אפיקליות שאינן צנטרוזומליות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו עם מספר דגימות ובמשך יומיים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לגרד בזהירות בארות בעת איסוף אורגנואידים כדי למנוע שיבוש המבנה התלת מימדי שלהם.

כמו כן, היזהר בעת הוספה או הסרה של תמיסות כדי למנוע אובדן אורגנואידים לאורך הליך הצביעה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתקן, לתייג ולהרכיב אורגנואידים מבודדים ומבני אפיתל אחרים כגון קריפטות מעיים. אל תשכח שעבודה על ריאגנטים מקבעים בהליך זה עלולה להיות מסוכנת ביותר.

יש לבצע הערכות סיכונים של הליך זה ולנקוט תמיד באמצעי בלימה מתאימים וציוד הגנה אישי בעת ביצוע הליך זה.