Name: אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: למדו איסוף זרע לאחר הזדווגות ממערכת הרבייה הנקבית בעכברים ומדידת זמן הנוזליות. שיטה זו חיונית להבנת שחרור הזרע מהג'ל הסמינלי ומוביליות התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי קרן הזנק במכללה לרפואה וטרינרית (WSU) WW. המחברים מודים סיירה אולסן (WSU) על קריאה ביקורתית של כתב היד הזה.

כל בעלי החיים, הליכים המשמשים במחקר זה מטופל בהתאם להנחיות אכפת לי חיה אוניברסיטת מדינת וושינגטון (WSU) והוועדה שימוש ובציות שאושרו על-ידי WSU בעלי חיים פרוטוקולים #4702, #4735.
1. עכברים
<ol><li>
שימוש רגיל C57BL/6J למבוגרים זכר עכברים או זנים אחרים של ריבית. לשמור על חיות תחת סביבת טמפרטורה, לחות-מבוקרת, עם ad libitum גישה של מים ומזון.
	<ol>
<li>השתמש מגדלים זכר ועד בן 8 שבועות בן 10 חודשים. השתמש רק מוכח מגדלים בניסויים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
השתמש למבוגרים נקבה עכברים עם רקמת מחיקה סלקטיבית של באיברי הרבייה α של קולטן אסטרוגן (מקודד על ידי ג'ין Esr1 ) לתאי האפיתל10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, הנקרא "קו" או נוק) ולשלוט הארנבונים מאותה (Esr1f/f, שנקרא "CTRL") במחקר זה.
	<ol>
<li>השתמש נקבות בת שבוע 8. הגילאים של נקבות מגוונות בהתאם הניסוי של ריבית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע את שלבי ייחום בבוקר בשעה 08:00 h. השתמש רק נקבות בשלב ייחום של המחזור. עבור שיטות מפורט של מריחת הנרתיק וניתוח cytological, להפנות הנהלים שפורסמו בעבר11.</li>
</ol>2. ההזדווגות והערכה תקעים Copulatory
<ol><li>ביום של ייחום (h 16:00), בית הנקבה לכלוב של הזכר.</li>
	<li>למחרת בבוקר (08:00 h), להפריד את הנקבה מהעכבר זכר.</li>
	<li>להשתמש עיבוד של שיטת שפורסמו בעבר12 כדי לגשת נוכחות או היעדרות של פקק הנרתיק או copulatory כאינדיקציה של ההזדווגות.</li>
	<li>החזק את העכבר הנשי מבסיס של הזנב להרים בקצרה את הגפיים האחוריות.</li>
	<li>למצוא את התקע copulatory על ידי הנוכחות של coagulum הזרע תפר חוט רקמה אופווייט בפתח הנרתיק בעזרת קיסם. אם התקע copulatory, הקיסם לא תהיה אפשרות להכנסה לתוך תעלת הנרתיק.</li>
</ol>3. הכנה לפני איסוף הרקמה
<ol><li>להכין 10 מ"ל של התקשורת L-15 של ליבוביץ, בתוספת 1% סרום שור עוברית (נקרא L15 מדיה + 1% FBS) צינור 15 מ"ל. דגירה התקשורת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות waterbath.</li>
	<li>על מנת לשמר את הכדאיות של רקמות, זרע ליישומים במורד הזרם, aliquot 2 מ"ל של טרום ומחוממת L15 מדיה + 1% FBS ב microcentrifuge 2 מ"ל צינור לאיסוף רקמות.</li>
	<li>לחמם את השלב של stereomicroscope ל- 37 מעלות צלזיוס. מוגדר הבלוק החום 37 ° C ומניחים על צינור microcentrifuge mL 1.5 ריק בבלוק.</li>
	<li>אם היישומים במורד הזרם מחייבים הדמיה של תנועתיות הזרע, לחמם שהשקופית זכוכית 37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. רקמות אוסף
<ol><li>להביא אזור הרקמה אוסף המדיה L15 מראש ומחוממת + 1% FBS aliquot.</li>
	<li>המתת חסד הנקבה (~ 08: 30h) באמצעות פחמן דו-חמצני חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם. הערה: זה כ 8 שעות לאחר ההזדווגות, בהנחה ההזדווגות מתקיים בחצות.</li>
	<li>מקם את החיה במצב פרקדן לחשוף את אזור הבטן.</li>
	<li>תרסיס אלכוהול 70% על הבטן ליד הגפיים האחוריות.</li>
	<li>להשתמש את המספריים ויבתר לעשות חתך קטן (~ 1 ס מ) על העור של הבטן התחתונה.</li>
	<li>להשתמש ביד הדומיננטית למשוך את הזנב (ואת הגפיים האחוריות במידת הצורך) בעוד היד האחרת מושך את העור בכיוון ההפוך (לכיוון הראש) כדי לחשוף את שריר הבטן. שיטה זו משמשת כדי למזער את כמות השיער זיהום אל האברים מהבטן.</li>
	<li>חותכים את שריר הבטן בצורת V-בבסיס הבטן, סמוך הנרתיק, כדי לחשוף את האיברים מהבטן.</li>
	<li>העבר והמעיים שומן בבטן בצד כדי לחשוף את מערכת הרבייה.</li>
	<li>חתוך את שלפוחית השתן ואת רקמות אחרות מעל אזור הנרתיק.</li>
	<li>שיחתכו הערווה symphysis כדי לקבל גישה רקמת הנרתיק.</li>
	<li>הרם את רקמת הנרתיק בפתח הנרתיק, באמצעות מספריים כדי להפריד בין תעלת הנרתיק לבין הרקמה רקטלי.</li>
	<li>בזהירות לקצץ את השומן מצע המעי העליון משני צדי הרחם באמצעות מספריים האביב. התראה: הרחם שביר מאוד עם הזרע בתוך. להיזהר לא ניקוב הרחם, אחרת הזרע יאבדו.</li>
	<li>הרם את מערכת הרבייה נמוכה וחותכים כרית השומן השחלות את שני הצדדים.</li>
	<li>להעביר את באיברי הרבייה כל לתוך הצינור של ליבוביץ ומחוממת מראש L-15 מדיה + 1% FBS.</li>
</ol>5. מדידה של זרע ניזול (צמיגות) מאוסף תוכן הרחם
<ol><li>על הבמה stereomicroscope מחוממת, העברת הרקמות לתוך תבשיל תרביות רקמה סטרילי 35 מ מ מלא 3.5 מ ל להתחמם מראש L-15 מדיה + 1% FBS לנקות רקמות דם, מזהמים אחרים. התראה: בעת הכביסה, לתפוס את הרקמות על ידי השומן, לא את הרחם. בשלב זה, הזרע הוא צפוי להיות שלמים בתוך הרחם.</li>
	<li>כתם רקמות עודף מדיה באמצעות מעבדה מגבונים.</li>
	<li>החזק את הרקמה בקצה הנרתיק בעת הצבת את הקצוות השחלות בצינור microcentrifuge מחומם מראש. בעוד אתה מחזיק שבסוף וגינלי, לחתוך את הקרניים הרחם בבסיס של הרחם, המאפשר את הקרניים הרחם ליפול לתוך הצינור microcentrifuge.</li>
	<li>תן הזרע זרימה החוצה הקרניים הרחם לתוך הצינור. להשתמש מלקחיים חסר שיניים לסחוט בעדינות את הקרניים הרחם מהקצה השחלות כדי שבסוף וגינלי, לסלק את שאריות הזרע.</li>
	<li>למחוק את הרקמות בתיק חומרים מסוכנים, לשרוף.</li>
	<li>בקצרה ספין למטה הזרע minicentrifuge (~ 1-2 s).</li>
	<li>להניח את הצינור, מקביל לשלב מחוממת - זרע לא ישפך החוצה.</li>
	<li>יש לי את שעון העצר מוכן ולהגדיר לספור ''.</li>
	<li>צינור קפילר 25 µL מכניס דגימת הזרע בזווית של 180 מעלות (מקבילה לקיר tube). זה כדי למזער את מידת ההשתנות בין כל חוקר כשאני מחזיק את צינור קפילרי בזוויות שונות.</li>
	<li>הקש את הטיימר ברגע הופך צינור קפילרי מגע עם הזרע.</li>
	<li>רשום את הזמן (s) שלוקח לזרע להגיע לקו 25 µL.</li>
	<li>עם סיום המדידה, מיד לשים את הצינור המכיל זרע בחזרה בבלוק חום יבש לצורך ניתוח פונקציונאלי נוסף, כגון הדמיה וידאו של תנועתיות הזרע.</li>
	<li>לחטא את צינור קפילרי המכיל זרע במועט הצינור ב- 10% מלבין פתרון עבור 20 דקות וזורקים את צינור קפילרי בתוך המיכל שרפ.</li>
</ol>6. וידאו הדמיה של תנועתיות הזרע
<ol><li>הפעל את המיקרוסקופ ואת תוכנת הדמיה וידאו.</li>
	<li>פיפטה 20 µL של הזרע שנותרו על גבי השקופית זכוכית ומחוממת מראש, בעוד השקופית זכוכית מושם על הבמה מחוממת.</li>
	<li>מכסים עם coverslip זכוכית.</li>
	<li>הנח את הצד coverslip ' שקופית ' למטה על המיקרוסקופ.</li>
	<li>השתמש 20 X עדשה המטרה כדי למצוא תחומי עניין.</li>
	<li>לשנות ל- 100 X עדשה המטרה עבור הדמיה וידאו.</li>
	<li>להקליט הוידאו ב- 12 מסגרות לשנייה (fps) ב-30 s.</li>
	<li>באופן אקראי להקליט קטעי וידאו בתחומים שונים לפחות 3 לכל חיה.</li>
	<li>ביצוע ההדמיה במהירות למזער חשיפה קלה השקופית כדי לשמר את תנועתיות הזרע ואת הכדאיות. הערה: הליך זה הדמיה צריך להיעשות תוך 2-3 דקות.</li>
	<li>לבצע ניתוח הנתונים באמצעות תוכנת ImageJ כמו שתואר לעיל8.</li>
</ol>

<ol><li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li>
<li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li>
<li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+semenogelin%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li>
<li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semenogelin%2C+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li>
<li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer%3A+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li>
<li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li>
<li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility%2C+capillary+tube+test%2C+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li>
<li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).</li>
<li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+semen+hyperviscosity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li>
<li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li>
<li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+vaginal+lavage%2C+crystal+violet+staining%2C+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389(2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/10293">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li>
<li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

איסוף זרע מן העכבר uteri יכול לספק יתרונות על פני הזרע ניתוח במבחנה כפי לשעבר יכול להמחיש את האינטראקציות פיזיולוגי בין הזרע לבין הפרשות באיברי הרבייה הנקביים. טכניקות שהוצגו במחקר זה מאפשר לחוקרים לקבוע את איכות תאי הזרע וכן הכדאיות הזרע, תנועתיות בתנאים פיזיולוגיים אידיאלי. יתר על כן, ישנם ניתוחים במורד הזרם שונים שניתן לבצע באמצעות הזרע שנאסף על uteri, לדוגמה, ניתן לספור את הזרע כדי לקבוע את המספר הממשי זרע הזנת את הרחם ואת הזרע יכול גם לדימות עבור מבחני תנועתיות. נקודת זמן אידיאלי כדי לאסוף את הזרע ...

מערכת הרבייה הנשית מורכבת ספינלי העליון והתחתון. מערכת הרבייה העליון כולל החצוצרות, הרחם endocervix. מערכת הרבייה נמוכה יותר כולל את ectocervix הנרתיק. בבני אדם, הזרע ejaculated הופקד אצל הקיר הקדמי של הנרתיק, הסמוך ectocervix1. בעכברים, עם זאת, הזרע הוא נסחף לתוך הרחם תוך דקות לאחר ההזדווגות2.
הזרע מכיל ג'ל הזרע הוא פני השטח למוצק בתוך שניות של שפיכה, גורם את הזרע כדי להיות לכודים,3. מרותק למיטה. ניזול משחרר את הזרע קיבוע על-ידי שינוי זרע מדמוי ג'ל מימית עקביות. תהליך זה הוא חיוני תנועתיות הזרע ורביה יונקים. הידע של זרע ניזול מבוססת בעיקר על במבחנה מחקרים שבו זרע הופך מעובה בקערה תרבות. בבני אדם, הפעילות האנזימטית מתרחשת של הערמונית אנטיגן ספציפי או ה-PSA (הידוע גם kallikrein הקשורות peptidase 3 או KLK3) הוא התורם העיקרי עבור ניזול באמצעות הידרוליזה של semenogelins (יוצרי ג'ל חלבונים המצויים הזרע)4 ,5,6. השפלה של semenogelins משחררת את הזרע של coagulum הזרע, הגדלת ניידות זרע. פריד זרע לשחות לעבר החצוצרה כדי להפרות את הביצית. ניזול (או זרע צמיגות) בדיקות הם אחד הקרנתם הראשונית סטנדרטי עבור בדיקת זרע במרפאות פוריות כדי להעריך את פוריות הגבר7.
מאמר שפורסם לאחרונה מראה כי ניתוח של נוזל הזרע שנאסף את העכבר הנשי באיברי הרבייה שלאחר ההזדווגות יכולה לשמש להמחשת חוסר ניזול שיכולים לגרום לאחר מכן ליקויי פוריות8. ניזול פגומים כגון לרטרו זרע תורם 11.8-32.3% מהמקרים עקרה גברים9, רומז ניזול נורמלי הוא הכרחי עבור רבייה יונקים. עם זאת, מחקרים וטיפול של פגמים ניזול התמקדו אך ורק זכר7. האפשרות כי באיברי הרבייה הנקביים ממלאת תפקיד הזרע ניזול לא נחקרו. לכן, שיטות איסוף זרע ומדידת זמן ניזול יספק לחוקרים כלי אבחון הרומן כדי לקבוע אם ניזול יכול להיות אחד הגורמים לאי פוריות באורגניזם מודל עניין.

<table><tbody><tr><td>קיסם</td><td>יהלום</td><td>750-שטוח</td><td>סטרילי אוטומטי, השתמש בקיסם קהה. אל תשתמש במספריים לניתוח מחודד</td></tr><tr><td></td><td>פישר</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>מספריים אביב</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&mu; צינור נימי זכוכית L</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>לייבוביץ' s L-15 מדיה</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td>תוסף עם 1% FBS</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>מחמם בלוק יבש דיגיטלי</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>לחימום צינור המיקרוצנטריפוגה לפני איסוף זרע</td></tr><tr><td>מיניצנטריפוגה</td><td>קורנינג</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 35 מ"מ</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה פוליפרופילן 15 מ"ל</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>דיוק</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ שלב מחומם</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ10F</td><td>כדי לשמור על חום הרקמה לפני איסוף</td></tr><tr><td>זרע מיקרוסקופ ברייטפילד</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td>אופציונלי. להדמיית וידאו של תנועתיות הזרע</td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC2900</td><td>אופציונלי. להדמיית וידאו של תנועתיות הזרע</td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>פישר</td><td>12-552-3</td><td>אופציונלי. להדמיית וידאו של תנועתיות הזרע</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>אופציונלי. להדמיית וידאו של תנועתיות הזרע</td></tr><tr>יש לדלל<td>אקונומיקה</td><td></td><td></td><td>בריכוז dH2O עד 10%</td></tr></tbody></table>

אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

בעכברים, פלטה הזרע החודר לתוך הרחם. לאחר השפיכה, הזרע משתנה עקביות דמוי ג'ל כדי דומעות, תהליך הנקרא ניזול. במחקר זה, נראה כיצד לאסוף את הזרע פוסט-ejaculated באיברי הרבייה הנקביים במודל של עכברים. עכברים הנשי הראשון, מבוגרים על הבמה ייחום שוכנו לכלוב של הזכר בן לילה. למחרת בבוקר, הזדווגות אושר על ידי הנוכחות של הכנס copulatory בפתח הנרתיק. עכברים נקבה עם תקעים copulatory היו מורדמים, נאסף כל באיברי הרבייה בכללותה (הנרתיק, הרחם, oviducts, השחלות), המבטיח מערכת סגורה כדי להכיל את הזרע. מערכת הרבייה הונח צינור microcentrifuge 1.5 mL, הנרתיק חתכו אותה כדי לשחרר את הזרע לתוך הצינור. כדי להבטיח נפח הזרע המרבי עבור ניתוח, מלקחיים חסר שיניים שימשו כדי לסחוט את הקרניים הרחם השחלות מקצה לקצה הנרתיק גירוש הזרע שנותרו. מערכת הרבייה לגמרי ואז אבדו. הצינור המכיל זרע היה טוו בקצרה למטה. פיפטה נימי 25 μL הונח לתוך הצינור בזווית של 180 מעלות (במקביל לקיר tube). כמות הזמן נהגו למלא את צינור קפילרי לקו μL 25 הוקלט. זרע מן המגדל זכר מוכחת בדרך כלל לוקח כ 60-180 s כדי למלא צינור קפילר 25 μL. טכניקה זו של אוסף זרע יכול לשמש גם ביישומים אחרים במורד הזרם כגון הדמיה וניתוח תנועתיות הזרע.

זרע נאסף מן CTRL וקו h נקבות כ 8 לאחר ההזדווגות עם זכרים CTRL פורייה. ניזול (או זרע צמיגות) הוא לכמת על ידי לוקחים את הזמן כדי למלא 25 קפילר μL זרע. הזרע שנאסף CTRL uteri לקח 2.06 דקות ±0.12 (mean±S.E.M, n = 5) כדי למלא את צינור קפילרי (איור 1). עם זאת, הזרע שנאסף KO uteri לקח יותר מ 60 דקות (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) של זמן הניסוי. נתונים אלה מציעים הזרע באופן משמעותי מעובה יותר או פחות צמיגה ב- CTRL לעומת קו uteri.
כדי להמחיש את אחד היישומי...

ניזול זרע נדרש הזרע להשתחרר הג'ל הזרע. מחקר זה מספק את נהלי איסוף זרע מן באיברי הרבייה הנקביים שלאחר ההזדווגות, ומדידת זמן ניזול זרע.

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

מטרת מחקר זה היא לקבוע כיצד לאסוף זרע לאחר ההזדווגות ממערכת הרבייה הנשית וכיצד למדוד נזילות זרע בעכברים. בעלי החיים ששימשו במחקר זה טופלו על פי הנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מדינת וושינגטון ובהתאם לפרוטוקולים 4702 ו-4735 שאושרו על ידי WSU. אצל בני אדם, הזרע הנפלט מופקד בדופן הקדמית של הנרתיק הסמוך לאקטוצרביקס.בעכברים, לעומת זאת, הזרע נסחף לרחם תוך דקות לאחר ההזדווגות. הזרע מכיל ג'ל זרע שמתמצק תוך שניות מרגע השפיכה וגורם לקיבוע הזרע. תהליך ההנזלה משנה את הזרע מדמוי ג'ל למרקם מימי.תהליך זה חיוני לתנועתיות הזרע ולהתרבות היונקים. הפעילות האנזימטית של האנטיגן הספציפי לערמונית או PSA היא התורמת העיקרית להנזלה באמצעות הידרוליזה של ג'ל זרע או חלבון יוצר ג'ל הקיים בזרע. פירוק של חלבון יוצר ג'ל משחרר את הזרע מקרישת הזרע ומגביר את ניידות הזרע כך שהזרע שוחה לכיוון מערכת הרבייה הנשית העליונה כדי להפרות את הביצית בחצוצרה.השיטה לאיסוף זרע ממערכת הרבייה הנשית ומדידת זמן ההנזלה הקיימת במחקר זה תספק לחוקרים כלי אבחון חדשני כדי לקבוע אם נזילות יכולה להיות אחד הגורמים לאי פוריות באורגניזם המודל המעניין. הבא הם ההליכים שבהם העכברים מזווגים ונקבע פקק נרתיקי. ניתן להשתמש בעכברים זכרים בוגרים C57BL/6 סטנדרטיים או בזנים מעניינים אחרים.נעשה שימוש רק בנקבות בשלב הייחום של המחזור. לשיטה מפורטת למריחת הנרתיק וניתוח ציטולוגי, אנא עיין בהליכים שפורסמו בעבר. בארבע אחר הצהריים.ביום הייחום, הנקבה שוכנת בכלוב של הזכר. למחרת בשמונה בבוקר, הנקבה מופרדת מהכלוב של הזכר. באמצעות קיסם שטוח סטרילי, נוכחות או היעדר תצהיר של פקק נרתיקי או זיווג הוערכה כאינדיקציה להזדווגות באמצעות הליך המותאם משיטה שפורסמה בעבר.הבא הוא הליך ההכנה לפני איסוף הרקמות. הכן 10 מיליליטר של מדיית L-15 של לייבוביץ בתוספת סרום בקר עוברי 1% או חומר L-15 בתוספת 1% FBS בשפופרת של 15 מיליליטר. מחממים את המדיה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.על מנת לשמר את כדאיות הרקמה והזרע ליישומים במורד הזרם, יש להקצות שני מיליליטר מדיה בשפופרת של שני מיליליטר לאיסוף רקמות. מחממים את הבמה של מיקרוסקופ הסטריאו ל -37 מעלות צלזיוס. הגדר את גוש החום ל -37 מעלות צלזיוס.הנח צינור ריק בגוש החום. כמו כן, יש לחמם את מגלשת הזכוכית ל-37 מעלות צלזיוס אם היישום במורד הזרם דורש הדמיה של תנועתיות הזרע. הבא הם ההליכים לאיסוף רקמות.להלן הכלים שישמשו לאיסוף רקמות. המתת חסד של הנקבה מיד לאחר בדיקת הפקק באמצעות חנק פחמן דו חמצני ואחריו פריקת צוואר הרחם. הנח את החיה במצב שכיבה כדי לחשוף את אזור הבטן.יש לרסס אתנול 70% על הבטן. בצע חתך קטן כסנטימטר אחד על העור בבטן התחתונה. משוך את הזנב והעור בכיוונים מנוגדים כדי לחשוף את שריר הבטן.חותכים את שריר הבטן בצורת V בבסיס הבטן. הזיזו את המעיים והשומן הבטני הצידה כדי לחשוף את מערכת הרבייה. חתוך את שלפוחית השתן ורקמות אחרות מעל אזור הנרתיק.חתוך את סימפיזה הערווה כדי לקבל גישה לרקמות הנרתיק. משוך את החלק הקשור לסימפיזה של הערווה באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את תעלת הנרתיק. הרם את רקמת הנרתיק בפתח הנרתיק והשתמש במספריים כדי להפריד את תעלת הנרתיק מרקמת פי הטבעת שמתחת.חתוך בזהירות את השומן המזנטרי משני צידי הרחם בעזרת מספריים קפיציים. הרחם שביר מאוד עם הזרע בפנים. לכן, על החוקר להיזהר שלא לנקב את הרחם אחרת הזרע יאבד.חותכים את כרית השומן בשחלות משני צידי השחלות. העבירו את כל מערכת הרבייה לצינור של מדיה מחוממת מראש. הבא הוא השיטה למדידת נזילות זרע.להלן הכלים לאיסוף זרע. מעבירים שלושה מיליליטר מהמדיה החמה לתבנית של 3.5 סנטימטר. מעבירים את הרקמה לתבשיל.שטפו את הטישו מספר פעמים על ידי אחיזת כרית השומן. בשלב זה, הזרע עדיין צריך להיות שלם בתוך הרחם. כתם את הטישו על Kimwipes כדי להיפטר מעודפי מדיה.החזיקו את הרקמה בקצה הנרתיק והכניסו את הרקמה לתוך הצינור שחומם מראש על ידי הרמת קצוות השחלה בתוך צינור ריק. חותכים את שתי קרני הרחם בין הנרתיק לרחם. תן לזרע לזרום מקרני הרחם לתוך הצינור.השתמש במלקחיים ללא שיניים כדי לסחוט בעדינות ולהוציא שאריות זרע בקרני הרחם. סובב לזמן קצר את הזרע שנייה עד שתיים. הנח את הצינור במקביל לבמה המחוממת.הכנס צינור נימי של 25 מיקרוליטר לדגימת הזרע בזווית של 180 מעלות. זאת כדי למזער את השונות בין כל חוקר להחזיק את צינור הנימים בזוויות שונות. רשום את הזמן שלוקח לזרע להגיע לקו של 25 מיקרוליטר.זמן ההנזלה מכומת על ידי הזמן שלוקח למלא צינור נימי של 25 מיקרוליטר בזרע. לזרע שנאסף מרחם הביקורת לקח כשתי דקות למלא את צינור הנימים. עם זאת, הזרע שנאסף מהרחם הנוקאאוט לקח יותר מ-60 דקות של זמן ניסוי.נתונים אלה מצביעים על כך שהזרע נוזלי יותר באופן משמעותי בביקורת בהשוואה לרחם הנוק-אאוט. הנה אחת הדוגמאות ליישום במורד הזרם באמצעות הדמיית וידאו של תנועתיות הזרע. השתמש בקצה פיפטה כדי לזרוק 25 מיקרוליטר מהזרע שנותר על מגלשת הזכוכית המחוממת מראש בזמן שמגלשת הזכוכית מונחת על החימוםtagה.כיסוי את השקופית עם כיסוי זכוכית. העבר את השקופית למיקרוסקופ על ידי הנחת מכסה השקופיההחלקה כלפי מטה. השתמש בעדשת אובייקטיבית 20X כדי למצוא את הזרע.לאחר מכן שנה לעדשת אובייקטיבית של 100X להדמיית וידאו. הקלט את הסרטון ב -12 פריימים לשנייה למשך 30 שניות. הזרע שנאסף מרחם הביקורת מראה זרע שוחה בחופשיות בתוך השדה המיקרוסקופי.עם זאת, הזרע שנאסף מהרחם הנוקאאוט הראה שרוב הזרע היה מקובץ יחד עם ניידות מינימלית. ממצאים אלה מצביעים על כך שהזרע שנאסף ממערכת הרבייה הנשית שמונה שעות לאחר ההזדווגות יכול לשמש לניתוח נוסף. בנוסף ליישומים אלה במורד הזרם, החוקרים יכולים גם להעריך את ההשפעה של המעכבים או התרכובות המעניינות המפריעות לתהליכים שונים של הובלת הזרע, תהליכים כגון נזילות זרע, מספר זרע בדרכי, תנועתיות זרע או נדידת זרע באזורים שונים של מערכת הרבייה הנשית.ניתן ליישם את התרכובות במערכת הרבייה הנשית לפני ההזדווגות. לאחר מכן, ניתן להעריך את ההשפעה של אותם מעכבים או תרכובות מדגימת זרע לאחר ההזדווגות. שיטות אלה יכולות להיות שימושיות לבדיקת המעשיות של תרופות למניעת הריון המעכבות את הובלת הזרע.

collection-post-mating-semen-from-female-reproductive-tract

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מדגים שיטות להפקת הזרע מן האשכים של זכרים ואז כשזרעו נקבות עכברים. הליך זה שימושי כאשר זמן מדויק יש צורך במחקרים התפתחותיים כמו גם עבודה מהונדס.

קצירת הזרע והזרעה מלאכותית של עכברים

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

מטרת טכניקה זו סקווש צנורית הוא להעריך במהירות תכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes תוך שמירה על תקינות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הלימוד בכל שלבי יצירת זרע, ניתן ליישם בקלות לצד הביוכימי והמולקולרי ביולוגי גישות אחרות לצורך המחקר של העכבר מיוזה.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

טיפולים רבים, מוטציות גנטיות להשפיע על התזמון של בגרות מינית ופוריות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית כדי להעריך את התפתחות המתבגר ב עכברים וחולדות לפני הגדרת מחקר פוריות בחיות בגרו.

קביעת כשירות הרבייה על-ידי המאשר תחילת המתבגר וביצוע וזמינותו של פוריות ב עכברים וחולדות

התכווצויות הרחם חשובים לרווחתם של הנקבות. עם זאת, באופן פתולוגי הגדילה הפתולוגית עלולה לגרום לדיסנוריאה, במיוחד לנשים צעירות. כאן, אנו מתארים הכנה vivo ex פשוטה המאפשרת הערכה מהירה של היעילות של מרפה שרירים חלקה שניתן להשתמש בהם לטיפול בדינוריאה.

שיטה Vivo Ex להערכת בדרכי הרבייה של העכבר לתנועתיות ספונטנית מעקב הרחם MATLAB מבוסס על התנועה אלגוריתם לניתוח נתונים

מאמר זה מתאר כיצד לבצע בדיקות התנהגות מינית בעכברים זכרים.

הערכה של התנהגות מינית של עכברים זכרים

שיטת מניפולציית צוואר הרחם המוצגת יכולה לגרום לפסאודו-הריון בעכברים ללא צורך בגידול נקבות עם זכרים שעברו כריתת כלי דם. השראת פסאודו-הריון נדרשת להצלחת החזרת עוברים לא כירורגית והזרעה מלאכותית לא ניתוחית, שניהם מוצגים גם.

גרימת פסאודו-הריון בעכברות נקבות ללא צורך בזכרים שעברו כריתת כלי דם לפני החזרת עוברים לא ניתוחיים או הזרעה מלאכותית

כאן, אנו מציגים שיטה לביצוע הזרקת זרע עגולה (ROSI) בעכברים, טכניקה עם יישומים קליניים מבטיחים ותועלת לחקר המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות עוברית.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הליך זה נועד לזהות מטבוליטים המועברים מזרע לביציות במהלך ההפריה על ידי שימוש בתיוג איזוטופים יציב עם גלוקוז 2H2O או U13C ואחריו ניתוח מטבולומי. אבות עם תווית דאוטריום מחוברים לסכרים לא מסומנים. עוברים שנאספו לפני ההשתלה מנותחים על ידי ספקטרומטריית מסה כדי למיין מטבוליטים אבהיים (דאוטרטים) ואימהיים (לא דאוטרטים).

תיוג איזוטופ יציב in vivo לזיהוי ספקטרומטריית מסה של מטבוליטים אבהיים המועברים מזרע לביצית במהלך ההפריה

טכניקה מאוד מבטיח לייצר רקמות בונה בלי באמצעות מטריצת התרבות תאים במצב microgravity מדומה. באמצעות מערכת תרבות סיבוביים, בדקנו זקיק השחלות הצמיחה וההתבגרות oocyte במונחים של זקיק הישרדות, מורפולוגיה, צמיחה, הפונקציה oocyte תחת התנאי microgravity מדומה.

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

למדו איסוף זרע לאחר הזדווגות ממערכת הרבייה הנקבית בעכברים ומדידת זמן הנוזליות. שיטה זו חיונית להבנת שחרור הזרע מהג'ל הסמינלי ומוביליות התאים.

אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים

גלה סרטונים נוספים