חקר In Vivo מטבוליזם הגלוקוז עכברים הניזונה דיאטה עתירת שומן באמצעות בדיקת הגלוקוז אוראלי סובלנות (OGTT) ובדיקה עמידות לאינסולין (ITT)

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא לאפיין את הפנוטיפ המטבולי הכללי של עכברים ולהעריך באופן ספציפי שינויים במטבוליזם של גלוקוז in vivo. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים. הם כלים מייצגים ורבי עוצמה לחקירת ההשפעה של גורמים גנטיים, פרמקולוגיים או תזונתיים על חילוף החומרים של גלוקוז in vivo.

היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא שהן קלות יחסית לביצוע. יום לפני בדיקת הסבילות לגלוקוז דרך הפה, העבירו עכברים לכלוב עם מצעים טריים ומי שתייה אך ללא מזון כדי לצום אותם למשך הלילה לפני הבדיקה. למחרת, הכינו 10 מיליליטר של תמיסת גלוקוז 20% על ידי דילול 45% גלוקוז D במים מזוקקים.

לאחר מכן, הכינו צלחת לאיסוף פלזמה על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים של נתרן EDTA לכל נקודת זמן לכל עכבר לבארות של צלחת 96 בארות. במהלך הניסוי, אחסן את הצלחת הזו על קרח. לאחר מכן, מדדו את משקל הגוף של כל העכברים וסמנו את זנבותיהם בטוש קבוע כדי להבחין בעכברים בקלות.

כדי לאסוף דם לדגימה בסיסית, השתמש במספריים חדים כדי לחתוך בזהירות מילימטר עד שני מילימטרים מקצה הזנב. נגב את טיפת הדם הראשונה כדי למנוע המוליזה או זיהום בנוזל רקמות לפני נטילת דגימות דם חדשות לקביעת הגלוקוז בדם. צייר דגימת דם קטנה למדידת רמת הגלוקוז הבסיסית בדם באמצעות הגלוקומטר.

לאחר מכן אסוף דגימת דם גדולה יותר באמצעות צינור נימי טרי. רוקן את צינור הנימים באמצעות פיפטה על ידי הנחת קצה הפיפטה בחלק העליון של קצה צינור הנימים ודחיפה בזהירות של הדם שנאסף לבאר של צלחת 96 הבאר תוך הימנעות מבועות אוויר. יש להכין 20% D-גלוקוז מומס במים מזוקקים.

כדי לתת תמיסת גלוקוז, תחילה רסן את העכבר על ידי אחיזתו בחוזקה בשרוול. מרחו מספיק מוצקות על העור סביב הצוואר כדי למנוע מהעכבר להתפתל החוצה וכדי להטות את ראשו לאחור. ודא שהעכבר יכול לנשום כראוי.

לאחר מכן, כוונו בזהירות את מחט ההזנה דרך הפה לכיוון הוושט. אפשר לעכבר לבלוע את המחט. לאחר שהמחט שוקעת בוושט התחתון של העכבר, הזריק את תמיסת הגלוקוז.

הפעל את הטיימר מיד לאחר הגאווז' הראשון, ותן גלוקוז לכל העכברים האחרים במרווחים של דקה אחת. לאחר תחילת מתן הגלוקוז, ניהול זמן טוב חשוב מאוד. לאחר 15 דקות, מדוד את רמות הגלוקוז בדם עם הגלוקומטר כמו קודם.

ואז לקחת עוד 30 מיקרוליטר דגימת דם מכל עכבר באותו סדר שבו הם הוזרקו. יש לחזור על איסוף הדם 30, 45, 60, 90, 120, 150 ו-180 דקות לאחר מתן גלוקוז. ודא שלעכברים יש גישה למי שתייה במהלך תקופה זו.

בסיום המדידות, החזירו את העכברים לכלובי הבית שלהם מצוידים במזון ומים. לאחר מכן צנטריפוגה את דגימות הדם ב-2, 500 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את סופרנטנט הפלזמה לבארות ריקות של צלחת 96 הבארות.

ואז לאחסן את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח. לפחות שבוע לאחר בדיקת הסבילות לגלוקוז, צמו את העכברים לפחות שעתיים לפני הזרקת האינסולין כדי לוודא שלעכברים יש גישה למי שתייה. יש לדלל תמיסת מלאי אינסולין בין 1 ל-1,000 עם 0.9% נתרן כלורי, ולהכין 20% D-גלוקוז מומס במים מזוקקים למתן אם העכברים הופכים להיפוגליקמיה.

לאחר שקילת העכברים וסימון זנבותיהם, חישבו את נפח האינסולין הנדרש למתן 0.75 יחידות אינסולין לק"ג משקל גוף. לאחר מכן, חתכו את קצה הזנב בעזרת מספריים חדים, ומדדו את רמות הגלוקוז הבסיסי בדם כמו קודם. כדי להזריק אינסולין תוך צפק, רסנו את העכבר בשיטת הקשקוש, והטו את ראש העכבר כלפי מטה בזווית קלה כדי לחשוף את הצד הגחוני של החיה.

הנח את המזרק המלא בזווית של 30 מעלות ברבע הימני התחתון של בטן החיות, והזריק את הנפח כשהשיפוע של המחט הסטרילית בגודל 30 מופנה כלפי מעלה. הפעל את הטיימר מיד לאחר הזרקת העכבר הראשון. מדוד את רמות הגלוקוז בדם בנקודות זמן נבחרות.

לאחר נקודות הזמן האחרונות, הכניסו את העכברים בחזרה לכלובי הבית שלהם שהוכנו עם הרבה אוכל ומים. מבחן הסבילות לגלוקוז דרך הפה שימש להשוואת הפנוטיפ המטבולי של עכברים שניזונו מתזונה עתירת שומן במשך 12 שבועות עם עכברים שניזונו מתזונה דלת שומן. בעכברי LFD עמידים לגלוקוז, רמת הגלוקוז המקסימלית בדם של כ-240 מיליגרם לדציליטר הושגה כ-15 דקות לאחר מתן הגלוקוז ומיד לאחר מכן ירדה לכיוון רמת הבסיס המעידה על סילוק תקין של הגלוקוז.

לעומת זאת, עכברי HFD הגיעו לשיא של כ-320 מיליגרם לדציליטר גלוקוז וכמעט ולא הראו סילוק של גלוקוז. מכיוון שרמות הגלוקוז בדם בין שתי הקבוצות שונות במצב הצום, בוצע חישוב של האזור שמתחת לעקומה מעל רמת הגלוקוז הבסיסית, וזה אישר את התוצאות הקודמות. בנוסף, רמות האינסולין בדם נקבעו באמצעות אינסולין ELISA.

העכברים שהוזנו ב-HFD הראו רמות אינסולין גבוהות בצום בהשוואה לקבוצת הביקורת, כמו גם תגובת אינסולין מוגברת המצביעה על היפראינסולינמיה מפצה הנגרמת על ידי HFD. כדי למדוד רגישות לאינסולין בעכברים שהוזנו ב-HFD, בוצעה בדיקת סבילות לאינסולין שבוע לאחר בדיקת הסבילות לגלוקוז דרך הפה. בהשוואה לקבוצת הביקורת שהוזנה ב-LFD, עכברים שהוזנו ב-HFD הראו ירידה לקויה ברמות הגלוקוז בדם לאחר מתן אינסולין, מה שמרמז על עמידות לאינסולין.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב במיוחד לשמור על ניהול זמן טוב כמו גם להפחית את רמות הלחץ של העכברים למינימום על מנת לייצר תוצאות חזקות וניתנות לשחזור. הבדלים בסבילות לגלוקוז, רמות אינסולין ורגישות לאינסולין המתקבלים כולם באחוז השיטות יכולים לעזור למזג את השלבים המורכבים הבאים. זה יכול לכלול, למשל, טענות היפרגליקמיות או היפר-אינסולינמיות או ניסויים באיי לבלב מבודדים.