גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פסיפס גנטי בקליפת המוח של העכבר על ידי השראת רקומבינציה של Cre-Lox באמצעות אלקטרופורציה ברחם. שיטה זו ליצירת פסיפסים גנטיים יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בנוירוביולוגיה. כגון קביעה אם גן נחוץ לפנוטיפ עצבי נתון באופן אוטונומי של תא.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמערכת הרקומבינציה היעילה של Cre-Lox משולבת עם טכניקת העברת גנים יעילה לא פחות באלקטרופורציה של הרחם. למרות ששיטה זו מתמקדת בהתמקדות בנוירונים בקליפת המוח בשכבה שתיים-שלוש, ניתן להשתמש בה כדי למקד נוירונים בעומקי שכבות קליפת המוח האחרות. כשניסינו ליצור פסיפסים גנטיים ברקמת המוח שלנו, נתקלנו בכמה בעיות בלגרום לחיות הניסוי שלנו לשרוד לאחר הלידה, ולכן הכנסנו כמה פישוטים ושכלולים לטכניקה שלנו.

הכן פיפטה עם מחודד ארוך מאוד וקצה דק מאוד, האופייני לפיפטות להזרקת תאי גזע עובריים או להעברה גרעינית על ידי הכנסת נימי הזכוכית לתוך מושך הפיפטה. לאחר הידוק המהדקים, הפעל את התוכנית לפרוטוקול משיכה, וצור התחדדות על נימי הזכוכית. ודא שאורך ההתחדדות הוא בין 10 ל-15 מ"מ באמצעות מיקרוסקופ אור מורכב.

לאחר מכן, כדי לשבור את קצה הפיפטה, מרכז משימה חד שכבתית נגב מעל של 50 מ"ל ומתח אותה מתוחה ביד אחת. ביד השנייה, דחף את הפיפטה הנמשכת, הצד המחודד כלפי מטה, בניצב דרך מרכז המגבון וגורם לשבירה נקייה במתחדד. בדוק את גודל הפתח תחת מיקרוסקופ אור מורכב.

לאחר מכן כייל את הפיפטה על ידי שאיבת 1 מק"ל של 0.4% טריפן כחול ו-PBS לפיפטה מלאה חלקית ובוגר את הפיפטה עם סימונים של 1 מק"ל המבוססים על גובה של 1 מק"ל בפיפטה. השתמש בפיפטה המכוילת כדי לסיים פיפטות משוכות אחרות לפני השלכתן. הנח את הפיפטות במחזיק הפיפטה נקי מאבק וחלקיקים אחרים.

לאחר הרדמה עמוקה של עכברה בהריון ב-E-15.5, בדוק את רפלקס היישור על ידי הטיה עדינה של תא האינדוקציה ושים לב לתגובת העכבר. אם רפלקס היישור נעדר, העבירו את העכבר לאזור ההכנה לניתוח והעבירו איזופלורן בשאיפה דרך חרוט האף כדי לשמור על מישור הרדמה כירורגי. השתמש במלקחיים כדי לבדוק את רפלקס הדוושה כדי לאמת הרדמה.

עקוב אחר קצב הנשימה במאמץ, מחפש נשימה עמוקה וסדירה ושהריריות בצבע ורוד ולחות. מרחו מספיק משחת עיניים וטרינרית על העיניים כדי לכסות אותן לחלוטין להגנה מפני התייבשות. יש לעסות את קרם הסרת השיער על אזור הבטן בעזרת צמר גפן עד שפרוות הבטן נמסה.

לאחר מכן נגב את פרוות הבטן. נקו בזהירות את כל השאריות שנותרו וקרם האפילציה בעזרת 70% אתנול וצמר גפן. מרחו תמיסת קרצוף על בסיס יוד על אזור הבטן בתנועה סיבובית.

לאחר מכן השתמש בווילון כירורגי כדי לבודד את אזור הניתוח ולשמור על תנאים סטריליים. לאחר ביצוע חתך בקו האמצע הגחוני של 2 ס"מ בעור, מצא את הלינאה אלבה כדי לדמיין את קו האמצע של הבטן הישרה. משוך את השריר למעלה והרחק מהבטן ובצע חתך בקו האמצע של 2 ס"מ כדי לחשוף את חלל הבטן בטכניקות אספטיות.

בעזרת קצה מיקרופיפטה סטרילי של 10 מק"ל, יש להוציא קרפרופן לחלל הבטן לשיכוך כאבים. לאחר מכן, מהדקים מלקחיים יתושים הרטמן בקצה השמאלי של חתך הבטן הישר. הנח את המלקחיים על צלחת פטרי הפוכה משמאל לחתך, תוך שמירה על הצד השמאלי של החתך פתוח.

לאחר הידוק הצד הימני של החתך בצורה דומה, הניחו ספוג גזה סביב אזור החתך. בעזרת מלקחיים טבעתיים ללא בורג גבול מחובר, משוך את הרחם בין כל שני עוברים שכנים מבלי לרסק או לפצוע רקמה כלשהי. התחל לשלוף את כל העוברים דרך החתך, והניח אותם על גבי ספוג הגזה.

חבר פיפטה מכוילת למכלול צינור השואב והזריק בדיוק 1 מק"ל של תמיסת DNA שהוכנה דרך דופן הרחם לחדר הצדדי של כל עובר. השתמש באגודל ובאצבע המורה כדי לתפעל את העוברים, ואפשר לדחוף את העוברים בעדינות אל דופן הרחם במהלך ההזרקה. החדרים הצדדיים מופיעים כשני כתמים כהים יותר על הטלנצפלון הגבי של העובר.

אשר הזרקה מוצלחת על ידי התבוננות בטריפן כחול הממלא את החדר הצדדי. לאחר הזרקת כל העוברים, הנח את הקתודה של אלקטרודות מסוג פינצטה על הרחם, ישירות מעל קליפת המוח המדיאלית והזנבית כדי למקד את קליפת המוח הראייה. הנח את האנודה רק נחותה וקדמית לראש העובר.

עם דוושת הרגל, הפעל את אספקת פולסים של 550 אלפיות השנייה של 50 וולט המופרדים במרווח של 950 אלפיות השנייה. לאחר אלקטרופורציה של כל העוברים, החזר את הרחם לחלל הבטן באותו כיוון בו נמצא. השתמש במי מלח כדי לשמן את הרחם תוך הנחיית הרחם באופן ידני ועדין במיוחד, תוך הקפדה לא להזיז עוברים ממקומם ברחם.

סגור את שרירי הבטן בתפרים נספגים. השתמש בתפר קטוע פשוט, וקשר את הקצוות בקשר מנתח. סגור את שכבת העור עם תפרים נספגים.

מרחו כמות קטנה של דבק רקמות כדי לאטום את הפצע. מרחו דבק רקמות על הקשרים כדי למנוע ניתוק. השתמש במיקרופיפטה כדי להסיר כל דבק רקמה המקיף את הפצע שניתן לשאוף.

לאחר שדבק הרקמות יבש, הסר את החיה מאיזופלורן ואפשר לנקבה להתאושש לבד בכלוב חם. המשך לעקוב אחר העכבר עד שהוא מתאושש לחלוטין ומתנהג כרגיל. לאחר ההסרה, החזירו את הנקבה לכלוב עם הזכר.

הנח את הגולגולת על משטח ישר עם מגבוני משימה חד-שכבתיים לחים ב-1 x PBS. בעזרת פינצטה, הסר תחילה את עצם העורף. לאחר מכן הסר בזהירות את העצמות הקודקודיות, והסר את הפינצטה החוצה והרחק מפני השטח של המוח.

הסר בזהירות את כל קרומי המוח כדי למנוע נזק לקליפת המוח. תקעו את החלק האחורי של הפינצטה מתחת למוח לאורך הגולגולת כדי לנתק את כל עצבי הגולגולת ולהסיר את המוח. השתמש בסכין גילוח חד קצה כדי לבצע חתך עטרה כ-0.5 מ"מ רוסטרל לברגמה, ועטרה אחרת חתכה כ-0.5 מ"מ זנב לרקמה המעניינת.

גוש הרקמות מוכן כעת לחתך. הזרקה של 1 מק"ל של 2 מ"ג/מ"ל של GFP Cre מביאה לפיזור דליל של תאים מסומנים, שחלקם יכולים להיות בהירים. מכיוון שהרקמה נחתכת ב-100 מיקרון, רוב הסורגים הדנדריטיים נשמרים.

כאשר האלקטרופורציה ברחם מבוצעת ביום העוברי 15.5, התיוג מתרחש על פני שכבות קליפת המוח שתיים ושלוש. ניתן להבחין בקוצים דנדריטיים בהגדלות גבוהות. הזרקה של 1.5 מק"ל של 2 מ"ג/מ"ל של GFP Cre מביאה לתיוג צפוף מאוד, שיכול להיות לא אופטימלי מכיוון שקשה לעקוב אחר מקור הנויריטים והקוצים הדנדריטיים.

עם זאת, על ידי בחירת תא בהיר בפריפריה של האזור המסומן, עדיין ניתן לדמות תא עצב ואת תהליכיו. לחלופין, הזרקת מבני SuperNova מביאה לפיזור דליל של נוירונים בשכבה שתיים-שלוש המסומנות בצורה בהירה מאוד. לאחר שליטה, ניתוח אלקטרופורציה ברחם ייקח פחות מ-30 דקות אם הוא מבוצע כראוי.

בעת ניסיון הליך זה עם מבני DNA אחרים, חשוב לזכור לנסות ריכוזים ונפחים שונים, זה יעזור להשיג את דלילות התיוג הרצויה הנדרשת לניתוח פסיפס. התוצאות המייצגות שלנו השתמשו במבנה יחיד או במבנה SuperNova שהומצא לאחרונה. באחרון, מצאנו שאנו יכולים להשיג תיוג דליל מצוין, תוך מקסום הבהירות של הנוירונים.

ניתן להתאים את הטכניקה הזו ליצירת רקמת מוח פסיפס בדרכים אחרות. לדוגמה, ניתן לשלב עריכת גנים CRISPR ו-Cas9 עם אלקטרופורציה ברחם, או שילוב רקומבינציה של Cre-Lox עם הזרקה תוך חדרית של וקטורים ויראליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב מספר טכניקות פשוטות ומעודנות המשמשות להשגת פסיפס גנטי דליל, כך שתוכל לשלב רקומבינציה של Cre-Lox ואלקטרופורציה ברחם יחד.

אנו מאחלים לך בהצלחה.