וזמינותו פשוטה מבוססת-תא Immunofluorescence לאיתור נוגדן עצמי כנגד הקולטן N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) בדם

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לזהות נוגדנים עצמיים כנגד קולטן NMDA בדמם של חולים עם חשד לדלקת מוח אוטואימונית. המדד עוזר לענות על שאלות המפתח באבחנה מבדלת של חולים עם תסמינים נוירו-פסיכיאטריים חריפים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר באמצעי סינון פשוט ואמין.

התחל הליך זה על ידי הכנת לוחות תרבות מצופים ג'לטין. יש למנות 200 מיקרוליטר של תמיסת ג'לטין של 2% לכל באר של צלחת תרבית של 48 בארות ולדגור את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. לאחר 30 דקות יש לשאוב את תמיסת הג'לטין מהבארות.

זרעים בכל באר 5 פעמים 10 עד תאי HEK293 הרביעיים ב -200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים, המכילים 10% FBS. דגרו את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה המסופקת עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, החלף את מדיום התרבות המושקע בכל באר ב -200 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי, המכיל 10% FBS.

בקנה מידה בהתאם למספר הכולל של בארות בניסוי, הכן פתרון A על ידי ערבוב הפלסמיד NR1-GFP עם מדיום תרבית. הכן את פתרון B על ידי ערבוב מגיב הטרנספקציה עם מדיום תרבית. הכן את תמיסה C על ידי ערבוב תמיסה A ותמיסה B ודגירה של התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות.

לאחר מכן, יש להקצות 40 מיקרוליטר של תמיסה C לכל באר המכילה את תאי HEK293. סובבו את הצלחת בעדינות ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח המסופק עם 5% פחמן דו חמצני למשך הלילה. בדוק את הביטוי של החלבון הרקומביננטי NR1-GFP בתאי המארח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 40 עד פי 200, לפני שתמשיך לבדיקת האימונופלואורסצנציה מבוססת התא.

כדי להתחיל בבדיקה זו, שאפו תחילה את המדיום המושקע מבארות צלחת התרבות ואז שטפו כל באר עם 200 מיקרוליטר PBS שלוש פעמים. מוסיפים 200 מיקרוליטר של תמיסת פרפורמלדהיד 4% לכל באר ומדגרים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. שאפו את תמיסת הפרפורמלדהיד מהבארות ושטפו כל באר עם 200 מיקרוליטר PBS שלוש פעמים.

לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר חלב דל שומן 10% בתמיסת PBST לכל באר ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר בניעור עדין למשך שעה. שאפו את החלב הרזה של 10% בתמיסת PBST מהבארות ושטפו את הבארות עם 200 מיקרוליטר PBST פעם אחת. דגרו את הבארות עם פלזמה מדוללת מ-1 עד 100 ב-PBST כנוגדן העיקרי עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר שעה יש לשאוב את הפלזמה המדוללת מהבארות ולשטוף כל באר עם 200 מיקרוליטר PBST שלוש פעמים. לכל באר יש להוסיף 200 מיקרוליטר של IgG אנטי אנושי של עזים, מצומד עם Alexa Fluor 594 ולדגור את צלחת התרבות בטמפרטורת החדר בניעור עדין למשך שעה. לאחר מכן, שאפו את ה-IgG האנטי-אנושי של העז המצומדת עם תמיסת Alexa Fluor 594 ושטפו כל באר עם 200 מיקרוליטר PBST שלוש פעמים.

לאחר שטיפת ה- PBST השלישית, הוסף 100 מיקרוליטר תמיסת גליצרול, המכילה DAPI, לכל באר. התבונן וצלם את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המסנן הנכון לכל צבע וחתיכת עין פי 10 עם מטרות של פי ארבע, פי 10 ופי 20. תמונות מייצגות אלה שצולמו 24 עד 30 שעות לאחר הטרנספקציה, מראות תאי HEK293 המבטאים NR1-GFP.

לכ-30% מהתאים היה האות הירוק תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. בתמונות המקבילות של Alexa Fluor 594, האות האדום בפאנל B מציין את הקישור של הנוגדנים העצמיים של הקולטן נגד NMDA ל-NR1 המתבטא בתאי HEK293. האות האדום החלש בפאנל E מציין את רעש הרקע של תמונות Alexa Fluor 594.

התאים המבטאים NR1-GFP שימשו לסינון נוכחות של נוגדנים עצמיים לקולטן NMDA בדגימת פלזמה אנושית. בתמונות הממוזגות הללו, הצבע הצהוב מציין קולקליזציה של הנוגדנים העצמיים NR1-GFP ואנטי-NMDA. החצים מציינים דוגמאות לתאים עם קולקליזציה בולטת.

דגימת פלזמה המציגה חפיפה של יותר מ-30% של אותות ירוקים ואדומים תתפרש כחיובית במקרה זה. בתמונה הממוזגת של הבקרה השלילית, יש חפיפה מועטה של אותות ירוקים ואדומים, מה שמאשר את הקישור הספציפי של הנוגדנים העצמיים של הקולטן נגד NMDA ל-NR1-GFP בבדיקה. לאחר השליטה, ניתן לבצע את הטכניקה תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון טכניקה זו, חשוב לזכור שמדובר רק באמצעי סינון. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע אמצעים אחרים כגון ניתוח כתמים מערביים וניתוח מבוסס רקמות כדי לענות על שאלות נוספות כמו ספציפיות של מקרים חיוביים. לאחר הפיתוח, הטכניקה סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הפסיכיאטריה לחקור אבחנה מבדלת של מטופלים עם מצב חירום נפשי חריף.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את הבדיקה לבדיקת נוגדנים עצמיים כנגד קולטן NMDA בדם.