בניית פלטפורמה תפוקה גבוהה ההקרנה כדי להעריך את הטרוגניות של HER2 הגברה ג'ין סרטן שד

המטרה הכוללת של הליך מעבדה זה היא להגדיר, לכמת ולהשוות בו זמנית את ההטרוגניות הגנטית התוך-גידולית של HER2 בסדרה גדולה של סרטן שד מעובד הטרוגני באמצעות הכלאה של כסף באתרו בתפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לטפל בבחירת מפתח תרגום ומחקר סרטן השד כגון חקר הטרוגניות הגברת הגן HER2, קבוצה גדולה של מקרים שאוחזרו מארכיוני פתולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת סכיזואנליזה של HER2 בתפוקה גבוהה על פני אזורים טופוגרפיים שונים של סרטן שד מרובה ומעובד הטרוגני.

בדרך כלל, אנשים חדשים בהכלאה באתרם יתקשו מכיוון שמחקרים רטרוספקטיביים דורשים בדרך כלל ניתוח של דגימות ארכיון שעברו הליכי קיבוע, עיבוד ואחסון שונים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר החלטנו לסווג מחדש את כל סרטן השד ממאגר הנתונים המוסדי שלנו מאז 2003. תדגים את ההליך הזה ג'וליה ארקולי, טכנאית מהמעבדה שלנו.

התחל פרוטוקול זה בבחירת חולים ודגימות רקמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צור ופתח קובץ גיליון אלקטרוני חדש, המשלב את הרשומות של האזורים הנפרדים של כל מקרה. כלול עמודות נפרדות עבור מזהה מקרה, מזהה בלוק, מזהה אזור, סוג רקמה, טופוגרפיה, מורפולוגיה, מצב סמן ביולוגי וכל שאר התכונות האימונוהיסטוכימיות הזמינות.

יצירת פרויקט TMA. הגדר את בלוקי הנמענים של PMA על ידי ניווט אל קובץ, חדש, בלוק. לחץ על השדה הראשון כדי למלא והקלד את מידות גוש הפרפין.

לאחר מכן צור פרויקט מערך רקמות על ידי ניווט למערך רקמות חדש. לחץ על סמל הייבוא ולאחר מכן בחר את קובץ התבנית של בלוק הנמען שנוצר קודם לכן. לחץ על הבא.

לאחר מכן בחר מילימטר אחד כגודל הנקודה על ידי לחיצה על הכפתור העגול. בחר 500 מיקרון כמרווח הנקודתי, שהוא הרווח בין שני מרכזים של נקודות שכנות. לאחר מכן לחץ על סמל המחשבון כדי לחשב את המספר הכולל של הכתמים שנוצרו, שאמור להיות 231.

לאחר מכן לחץ על הכפתור הגדר כדי ליצור רשתות ורשתות משנה. מחק את העמודות 8 ו- 15 ואת הקו המרכזי. שמור על שלוש נקודות של קו אחד להתמצאות.

המפה הסופית צריכה להקיף מספר כולל של 183 מקומות. הגדר את רשימת סוגי הרקמות על ידי ניווט לקובץ, רשימה חדשה של סוגי רקמות. לאחר מכן הגדר את הפרויקט על ידי ניווט לקובץ פרויקט חדש, בוסטר.

לאחר מכן הכינו את בלוקים המקבלים. ממלאים תבניות מתכת נקיות בפרפין אלסטי בחום של 65 מעלות צלזיוס. השאירו את גושי הפרפין להתקרר בטמפרטורת הסרט למשך הלילה בתוך תבניות המתכת.

למחרת, הוציאו את גושי הפרפין מתבניות המתכת. בנה את ה-TMA באמצעות מערך אוטומטי או אוטומטי למחצה על ידי הפעלת המערך תחילה ולאחר מכן הכנסת בלוקי המקבל לקרוסלת המערך. הגדר את מיקום ההתחלה על כל בלוק נמען באמצעות מקשי החצים כדי להזיז את אור הלייזר וליישר אותו עם הקצה השמאלי העליון בפרפין של בלוק הנמען.

לחץ על הבא וחזור על הפעולה עבור היישור האנכי. לחץ שוב על הבא כדי ליצור באופן אוטומטי חור בקואורדינטות שהוגדרו קודם לכן של בלוק הנמען. רוקן את האגרוף.

מקם את בלוק התורם לדגימה והסר ליבת רקמה מאזור העניין שהוער קודם לכן. הכנס את ליבת רקמת התורם לחור בבלוק המקבל. לאחר מכן הסר את בלוק התורם מהמערך.

חזור על שלבים אלה עד להשלמת ה-TMA. הניחו את צד הרקמה של בלוק ה-TMA החדש שנוצר על שקופית ריקה סטרילית והכניסו אותם לתנור המעבדה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לחץ בעדינות על הבלוק בשקופית למשך חמש שניות כדי לשטח את ליבות הרקמות.

חזור על הפעולה פעם אחת בסך הכל פעמיים. לאחר מכן מכסים את פני רקמת ה-TMA בשכבה דקה של פרפין אלסטי ב-65 מעלות צלזיוס. השאירו את בלוק ה-TMA בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

לבסוף, העבירו את בלוק ה-TMA בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני ביצוע אנליזות היסטוכימיות ואימונוהיסטוכימיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הנח את שקופיות ה-TMA לניתוח ב-60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן הפעל את המכשיר והתוכנה של Immunostainer.

בתצוגת הבית, לחץ על לחצן פרוטוקולים ולאחר מכן לחץ על יצירה/עריכה של פרוטוקולים. בחר את הליך קוקטייל ה-ISH הכפול כדי לשנות את התבנית הבסיסית. סמנו את האפייה ברשימת הקופסאות והגדירו את הטמפרטורה על 63 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

ואז דגל דה-פאראפיניזציה. הבא סמן את התניה של תא בדגל ברשימת התיבות. לאחר מכן סמן את מיזוג התא CC2 והגדר את הטמפרטורה על 86 מעלות צלזיוס ואת זמן הדגירה על ארבע דקות.

סמן CC2 עדין למשך שמונה דקות, סטנדרטי למשך 12 דקות והוארך למשך שמונה דקות. סמנו את ISH-Protease 3 ברשימת הקופסאות והגדירו את זמן הדגירה ל-16 דקות. בחר את ה-HER2 דיניטרופניל וכרומוזום 17 דיגוקסיגנין של הגשושית.

דוגרים למשך 16 דקות ואז מכוונים את הדנטורציה למשך 20 דקות על 80 מעלות צלזיוס. הגדר את זמן הדגירה של הגשושית לשש שעות. לאחר מכן הגדר את זמן הדגירה של המולטימר SISH על 32 דקות.

הגדר את הכרומט הכסוף וזמן הדגירה לארבע דקות. לאחר מכן הגדר את זמן הדגירה של המולטימר האדום על 24 דקות. הגדר את הכרומט האדום וזמן הדגירה לשמונה דקות.

לאחר מכן סמנו את הצביעה הנגדית ברשימת התיבות, בחרו המטוקסילין שתיים והגדירו את זמן הדגירה לשמונה דקות. סמן את הצביעה הנגדית של הפוסט ברשימת התיבות, בחר מגיב כחול והגדר את זמן הדגירה לארבע דקות. לבסוף, בצע סכיזואנליזה עבור HER2.

הערך את הגברת הגן HER2 כחיובית אם יחס בדיקת ספירת כרומוזום HER2 17 גדול או שווה ל-2.0 עם מספר עותק HER2 ממוצע גדול או שווה ל-4.0 אותות לתא. הערך כשלילי אם יחס בדיקת ספירת כרומוזום HER2 17 נמוך מ-2.0 עם מספר עותק HER2 ממוצע פחות מ-4.0 אותות לתא. מוצגים כאן מיקרוגרפים מייצגים המציגים את ניתוח הכלאת הכסף באתרו של סרטן שד הטרוגני HER2.

בדוגמה פרדיגמטית זו, שני אזורים נפרדים של סרטן שד פולשני בדרגה גבוהה ללא סוג מיוחד מראים תוצאות שונות במונחים של הגברת הגן HER2, המוצגים כנקודות שחורות, בהשוואה לבדיקת הספירה הצנטרומרית 17, המוצגת כנקודות אדומות. בפרט, אזור אחד השייך לליבת הגידול והראה דפוס צביעה לא סדיר של ציטוקרטין 7 הוגבר HER2, בעוד שנקודה בודדת בחזית הפולשנית הציגה דפוס HER2 מסוג פראי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע סכיזואנליזה קריאה של מערכי רקמות מסומנים המשלבים סרטן שד מרובה ומעובד הטרוגני.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שני ימי עבודה מבחירת המקרה. למרות ששיטה זו מותאמת לסרטן השד, ניתן לתרגם אותה לסוגים אחרים של סרטן שבהם הטרוגניות HER2 רלוונטית באופן קריטי כגון סרטן הקיבה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון הערכה פשוטה של HER2 מכיוון שהיא מיועדת למיפוי מקיף של אזורים טופוגרפיים מרובים בסדרות גדולות יותר של סרטן השד.

בזמן ההשתתפות בהליך זה, חשוב להימנע מכל סדק בבלוק ה-TMA. אפילו סדק מינימלי בפרפין מסיק את האיכות, יכולת השחזור והבהירות הכללית של הכלאה באתר. לאחר הליך זה, ניתן לבצע הדמיה של ספקטרומטריית מסה MALDI על מנת לענות על שאלות נוספות על פרוטאומיקה של סרטן השד, במיוחד במונחים של הטרוגניות תוך-גידולית ובין גידולים.

אל תשכח שעבודה עם אגרופים TMA ושעוות פרפין חמה עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ניטריל חד פעמיות בעת ביצוע הליך זה.