Name: הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: למד להעריך פעילות נוגדת אפופטוזה של חלבונים זרים בתאי חרקים Sf9 באמצעות מערכת הבעה מושרית הלם חום. שיטה זו מאפשרת שליטה בזמן הבעת הגן ובחינת אינטראקציות חלבוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Leu ג'יאן-Horng ד ר של המכון של ביולוגיה ימית, האוניברסיטה הלאומית טייוואן האוקיינוס על מתן 3 מבנים פלסמיד. מחקר זה נתמך על ידי מענק 106-2311-B-197-001 - משרד המדע, הטכנולוגיה (רובם).

1. תכשירים
<ol><li>תרבית תאים חרקים<ol>
<li>להכין 50 מ של התא תרבות בינוני. כדי לבצע זאת, הוסף µL 500 של אנטיביוטיקה (המפוטריצין = 0.25 µg/mL, פניצילין = 100 יחידות/mL, סטרפטומיצין = 100 µg/mL) ו 5 מ של חום-לא פעיל העובר שור סרום ללא סרום תא בינוני תרבות (ללא FBS או אנטיביוטיקה). הערה: מחממים את הנסיוב שור עוברית-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט מים לפני השימוש.</li>
		<li>לשמור על זחל כנימה frugiperda (פרפראים: תנשמיתיים), תאים חרקים sf9. ניתוק ca. 80% של תאים מן 25 ס מ2 תא תרבות הבקבוק ע י ניעור את הבקבוק, לבדוק תחת מיקרוסקופ אור. לאחר מכן, להעביר 50% של התליה תא חדש 25 ס מ2 תא תרבות בקבוקון ולאפשר את התאים לצרף למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להחליף את המדיום מ ל תא טריים תרבות בינונית ולצמוח בתוך אינקובטור ב 28 º C. מעבר תאים כל 2-3 ימים בהתאם גדילת התאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של פלסמידים תא תרביות תאים<ol>
<li>להוסיף שברי DNA המטרה (למשל, Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 ג'ין וקבועים שלה מחיקה) לתוך pDHsp/V5-שלו על ידי מבוססי ה-PCR שיבוט שיטה11. בדוק הצמיחה של טרנספורמציה המושבות על-ידי המושבה PCR באמצעות PCR מאסטר מיקס (2 X) ופריימר pDhsp-F2/אופ-IE2R את הגדר. לאשר את רצפי פלסמיד באמצעות שירות מסחרי רצף. הערה: טבלה 1 מציגה את צבעי בסיס המשמש PCR של המבנה המתאים.</li>
		<li>תרבות בודדת ברצף חיידקי מושבות, אשר מכילים מבנים פלסמיד הנ ל (שלב 1.2) ב 200 מ ל LB בינוני המכיל נבחרת אנטיביוטיקה (50 µg/mL), בהתאמה.</li>
		<li>לחלץ את פלסמידים בתרבית e. coli באמצעות Midi פלסמיד ערכת לפי הוראות היצרן12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מכינים ציפוי בינוני על ידי ערבוב 1.5 mL תא תרבות בינוני ו- 8.5 מ של התא ללא סרום תרבות בינוני.</li>
	<li>להכין ואקטינומיצין D (ActD) תא תרבות בינוני על-ידי הוספת µL 1.5 ActD מניות (1 מ"ג/מ"ל) לתוך 10 מ"ל של התא תרבות בינוני (ריכוז סופי = 150 ng/mL). חנות ב 4 º C.</li>
</ol>2. חלבון ביטוי ארעית
<ol><li>תא זריעה<ol>
<li>לקצור את התאים sf9 ע י ניעור תרבות את הבקבוק, להפלת ליפול התליה תא שפופרת 50 מ ל ו להעביר 10 µL hemocytometer על ידי פיפטה P10. לספור את מספר התאים במיקרוסקופ אור.</li>
		<li>צלחת 3 × 105 תאים sf9 לתוך מכל קידוח לתוך צלחת 24-ובכן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. החלף את המדיום 0.5 מ של ציפוי בינוני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תרביות תאים של פלסמידים<ol>
<li>תא שתדללו תרביות תאים ריאגנט: 8 לדלל µL של התא מגיב תקנים 100 µL תא ללא סרום תרבות בינוני, מיקס על ידי vortexing 1 s.</li>
		<li>להוסיף 2 µg של פלסמיד דנ א (pDHsp70-Ac-P35/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-ביר/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו) לתוך µL 100 של התא ללא סרום תרבות בינונית, מערבבים על-ידי vortexing עבור 1 s (איור 2).</li>
		<li>לשלב ה-DNA פלסמיד מדולל ו ריאגנט תרביות תאים תאים מדולל (210 µL), ומערבבים על ידי vortexing עבור Incubate ס' 1 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להוסיף µL 210 של ה-DNA תרביות תאים ריאגנט התערובת dropwise על התאים באמצעות פיפטה P1000. דגירה-28 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.</li>
		<li>החלף את המדיום ציפוי 0.5 מיליליטר תא תרבות בינונית בעזרת פיפטה של P1000. לאטום את הצלחת 24-ובכן עם קלטת, דגירה התאים ב 28 ° C עבור 16 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חום לזעזע את התאים transfected: לשים את הצלחת בתוך אמבט מים 42 ° C (צף על פני המים). חום במשך 30 דקות ולחזור את הצלחת 24-ובכן החממה 28 ° C.</li>
	<li>זיהוי של ביטוי חלבון<ol>
<li>לאחר 1 h או 5 שעות הלם חום, לשטוף את התאים 0.5 מ ל 1 x PBS מאגר בקצרה שלוש פעמים. הערה: לדלל 10 x PBS מאגר 1 x PBS מאגר על-ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר PBS 10 x 9 מ ל עיקור ddH2O</li>
		<li>Lyse התאים עם µL 40 1 x מרחביות בטעינת צבע על-ידי pipetting למעלה ולמטה. הערה: לדלל 4 x מרחביות הטעינה לצבוע על ידי ערבוב µL 30 1 x מאגר PBS ו 10 µL של 4 x מרחביות דוגמת המאגר.</li>
		<li>מחממים את דגימות חלבון ב 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בתוך גוש חום, ספין למטה עבור 1 דקות, לשים קרח תספיג וזמינותו.</li>
		<li>המערבי כתם assay בצע את ההליך של שיטת תספיג אסלאמי, Lujan13. לפעול למען חברה דמוקרטית-דף ג ' לים-14: ג'ל אחד נתון כחול Coomassie מכתים (טעינת פקד לבדיקת כי כמות חלבון דגימות טעון בכל טוב שווה סכום) והשני שעבר Western כתם assay, על פי אסלאמי Lujan13 .</li>
		<li>לזהות חלבונים מתויג V5 פיוז'ן עם נוגדן anti-V5 הארנב (5 מ"ג/מ"ל) (דילול 1:5000 במאגר TBST לעבוד ריכוז 1 µg/mL), עז ארנב אנטי איג-חזרת peroxidase (HRP) המספר המשלים (0.8 מ"ג/מ"ל) (דילול 1:10000 במאגר TBST לעבודה ריכוז 0.08-µg/mL). הערה: התאם את אחוז לזיהוי ל- 17.5% כאשר המשקל המולקולרי של חלבון להיות < 17 kDa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. אנטי-אפופטוטיים להיפגע פעילות assay
<ol><li>ג'ין-induced תא אפופטוזיס: חזור על ההליך הנ ל מ 2.1 2.3. שיתוף transfect µg 1 של pDHsp/D-rpr/דגל-שלו פלסמיד DNA (גן המכיל משרן אפופטוזיס) עם µg 1 של פלסמיד ה-DNA [וקטור pDHsp70/V5-שלו (בקרה שלילית), pDHsp70-Ac-P35/V5-שלו (בקרה חיובית), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-שלו, pDHsp70-Ly-IAP3-ביר/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו, בהתאמה.]. ב 5 שעות החום שלאחר טיפול בהלם, לנהל את הבדיקה הכדאיות של התא (איור 2).</li>
	<li>תא כימית-induced אפופטוזיס: חזור על ההליך הנ ל מ 2.1 2.3. בשלב 2.1.2, צלחת עונה 1 פרק 106 sf9 תאים לתוך מכל קידוח לתוך צלחת 6-. טוב. Transfect µg 4 של פלסמיד ה-DNA [וקטור pDHsp70/V5-שלו (בקרה שלילית), pDHsp70-Ac-P35/V5-שלו (בקרה חיובית), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-שלו, pDHsp70-Ly-IAP3-ביר/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו, בהתאמה.]. 5 שעות החום שלאחר הלם, יטפל בתאים sf9 עם 2 מ של ActD תא תרבות בינונית עבור 16 h, לערוך את הבדיקה הכדאיות של התא (איור 2). הערה: אחסון מינימלי כדי לכסות באר אחת צלחת 6-ובכן הוא 1 מ"ל.</li>
	<li>לבצע לעיל אנטי-אפופטוטיים להיפגע פעילות assay הניסויים, כולל 3.1 ו- 3.2 triplicates.</li>
</ol>4. תא הכדאיות assay
<ol><li>לשטוף את התאים שטופלו על-ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר PBS x 1 על 1 דקות 3 פעמים. Resuspend התאים על ידי pipetting 1 מ"ל-1 x-PBS-מאגר המכיל 0.04% trypan blue, כתם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. העברת התליה תא לתוך microtube 1.5 מ. הערה: 0.4% trypan blue הפתרון מדולל על ידי ערבוב 9 מ ל 1 x PBS מאגר 1 מ"ל 0.4% trypan blue פתרון.</li>
	<li>להעביר hemocytometer עם פיפטה P10 10 µL trypan blue מוכתמת תא ההשעיה ולספור את התאים קיימא שלם תחת מיקרוסקופ אור.</li>
	<li>ניתוח סטטיסטי<ol>
<li>לחשב את נתוני ההקלטות, להציג האמצעים של ± ש בכל סעיפי האישום.</li>
		<li>לנתח את הנתונים באמצעות-זנבית מבחן של התלמיד t על ידי Microsoft Excel. מגדירים נתונים משמעותיים מבחינה סטטיסטית P-הערך < 0.05.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+gene+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li>
<li>Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheilmann%2C+DA+%22Virus+Taxonomy%3A+Eighth+Report+of+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses%22">Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses</a>. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).</li>
<li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNai%2C+YS+%22Biological+Control+of+Pest+and+Vector+Insects%22">Biological Control of Pest and Vector Insects</a>. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).</li>
<li>Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriesen%2C+PD+%22The+Baculoviruses%22">The Baculoviruses</a>. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).</li>
<li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li>
<li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt0188-47">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li>
<li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li>
<li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li>
<li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+%28IAP%29+from+the+tiger+shrimp%2C+Penaeus+monodon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li>
<li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li>
<li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13355-016-0403-x">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li>
<li>Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf">http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf</a> (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017).</li>
<li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+%28IAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

המושג חום מבוססי הלם pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת תוארה לראשונה על ידי קלם. et al. ב 19948. השוואה של יזם ג'ין baculoviral (IE1) ודרוזופילה hsp70 הראו שכי hsp70 היה יעילות גבוהה יותר של יתוש תאים10. יתר על כן, כתוצאה אינדוקציה הלם חום, העיתוי של ביטוי חלבון יכול להיות נשלט בדיוק לאחר טיפול הלם תרמי. מערכת זו הוחלה ואז עבור מבחני חלבון פונקציונלי של שרימפס, nucleopolyhedrovirus (NPV) חוג ידידי הפקולטה חלבונים9,</s...

שתי מערכות ביטוי חלבון נפוץ השתמשו לייצור חלבונים: פרוקריוטים חלבון ביטוי (Escherichia coli ג'ין ביטוי מערכת) ומערכות איקריוטים חלבון הביטוי. מערכת אחת של ביטוי חלבון איקריוטים הפופולרי הוא מערכת (BEVS)1וקטור ביטוי baculovirus. Baculoviruses שימשו כסוכנים הדברה ביולוגית ברחבי העולם החקלאיים ואת יער מזיקים. בעשורים האחרונים, baculoviruses פותחו ככלים ביוטכנולוגי וקטורים ביטוי חלבון גם כן. הגנום של baculoviruses מורכב כפול גדילי DNA מעגלי ומעטפת nucleocapsids2. עד היום, יותר מאשר seventy-eight baculovirus היה מבודד ברצף3. בהתבסס על המפל הטמפורלי של ביטויים ג'ין baculoviral בתאי חרקים המארח, שעתוק הגן ניתן לסווג ארבעה מפלי הזמנית, כולל מיידית מוקדם, מוקדם-נדחתה, מאוחר, מאוחר מאוד גנים4.
BEVSs נקבעו כך היזמים הגן באיחור (כלומר, פאון או p10 יזם) שימשו כדי להסיע את הגנים היעד, בזמן baculovirus רקומביננטי נוצר על ידי רקומבינציה הומולוגית. ביטוי של חלבונים זרים בתאי חרקים על-ידי baculovirus רקומביננטי דומה לזה של חלבונים בתרבית של שינויים post-translational (מתאים לייצור גליקופרוטאין). לפיכך, baculovirus כבר בשימוש נרחב5,6,7. עם זאת, מגבלה אחת היא הנוכחות של מסלולים שונים N-גליקוזילציה ב תאים חרקים7.
לכן, baculovirus ביטוי מערכת חדשה, מערכת ביטוי גנים ארעי, פותחה. מערכת זו מבטא גנים זרים תחת הכונן של היזמים מוקדם-מיידי baculoviral (כלומר-1 יזם) בתאי חרקים. באמצעות מערכת זו, חלבון המטרה ניתן מיד לבטא תחת השליטה של ie-1 יזם תוך שינוי מסלול N-גליקוזילציה בתאי חרקים, וכתוצאה מכך oligosaccharides N-מקושרים יותר7. יתר על כן, הגנים מוקדם-מיידי baculoviral משוקלטים על-ידי התא המארח RNA פולימראז II, אינם דורשים כל גורם ויראלי עבור הפעלה4. לכן, חלבונים זרים יכולים להתבטא בתאי חרקים תוך זמן קצר. עד כה, והחולף מערכת ביטוי גנים הוא אחד הטכנולוגיות החשובות ביותר לביצוע מבחני פונקציונלי חלבון במערכת baculovirus במבחנה תא תרבות. ניתן להחיל את המערכת כדי לנתח את הפונקציה של baculovirus או חלבונים זרים. אחת ממערכות ביטוי גנים ארעי זמינים מסחרית מבוסס על היזמים מוקדם-מיידי ג'ין (IE) של Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2, OpIE1 היזמים).
עם זאת, הרמה הנמוכה ביטוי של גנים זרים בתאי חרקים היה עדיין בעיה כאשר המערכת הביטוי מבוסס-יזם ג'ין ארעי אופי הייתה בשימוש8,9,10. לפיכך, מערכת נוספת של ביטוי גנים ארעי נבנה בהתבסס על האמרגן של דרוזופילה חום הלם חלבון 70 (hsp70) ג'ין8,9. האמרגן של hsp70 עובד ביעילות רבה יותר מאשר יזם baculoviral IE כאשר המושרה על ידי הלם חום בתאי חרקים10. במערכת זו, הגנים היעד שבאו לידי ביטוי תחת הכונן של דרוזופילה הלם חום (Dhsp70) 70 יזם. גנים זרים יכולים להיות בקלות משובטים לתוך פלסמיד ביטוי גנים ארעי על ידי שיטות שיבוט מבוסס ה-PCR. יתר על כן, השליטה של התזמון של ביטוי גנים יכול להתבצע על ידי אינדוקציה הלם חום.
בדו ח זה, אנו בצע את הגישה ולבטא את שלוש truncations שונים של הגן baculoviral (מעכב של אפופטוזיס 3, iap3 מן Lymantria xylina MNPV) באמצעות מערכת ביטוי חלבון ארעי מבוסס-הלם חום, ביטוי חלבונים אלה יחולו על ניתוח פעילות אנטי-מוות. מערכת זו יכול לבטא גם חלבונים זרים במהירות או יותר להחיל על הערכת פעילות אנטי-מוות החלבון בתאים sf9, בעודכם נהנים גם את הפוטנציאל שיוחל מבחני פעילות חלבונים אחרים.

<table><tbody><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתית, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>לתרבית תאי חרקים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מוסמך</td><td>Bioind</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td>מדיום תרבית תאים ללא סרום</td></tr><tr><td>תאי Sf9 ATCC</td><td></td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים 25 ס"מ</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור הפוך</td><td>WHITED</td><td>WHITED WI-400</td><td></td></tr><tr><td>RBC HIT תא מוכשר</td><td>ביומן</td><td>RH618-J80</td><td>Escherichia coli (DH5&alpha;)</td></tr><tr><td>L.B. מרק (מילר)</td><td>Bioman</td><td>LBL407</td><td></td></tr><tr><td>אגר, כיתה בקטריולוגית</td><td>Bioman</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-zn-1</td><td>בחירה אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>PCR Master Mix (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Geneaid Midi Plasmid Kit (ללא אנדוטוקסין)</td><td>Geneaid</td><td>PIE25</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>SIGMA</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>SIGMA</td><td>CLS430829-500EA</td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Gizmo Supply Co</td><td>B-CNT-SLDE-V2</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td></td><td>142475 24-well צלחת</td></tr><tr><td>Cellfectin II ריאגנט</td><td>תרמו פישר</td><td>10362100</td><td>תא טרנספקטין ריאגנט</td></tr><tr><td>PBS-פוספט-חוצץ מי מלח (10X) pH 7.4</td><td>תרמו פישר</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>4& פעמים; SDS טוען צבע</td><td>Bioman</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)</td> <td>Merck Milipore</td><td></td><td>IPVH00010 PVDF ממברנות</td></tr><tr><td>מיני Trans-Blot מערכת תאים</td><td>BIO-RED</td><td></td><td>1703930 Blotting</td></tr><tr><td>Device Ponceau S Solution</td><td>SIGMA</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-V5</td><td>SIGMA</td><td>V8137</td><td>ארנב נוגדן</td></tr> <tr><td>נגד V5עיזים נגד ארנב IgG-חזרת פרוקסידאז (HRP)</td><td>ג'קסון</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>Merck</td><td>817072</td><td></td></tr><tr><td>6-Well</td><td>Multidish Nunc, Thermo Fisher</td><td>145380</td><td></td></tr><tr><td>0.4% תמיסה כחולה טריפאן</td><td>AMRESCO</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>P10 פיפטמן</td><td>גילסון</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000 פיפטמן</td><td>גילסון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F123602 קלטת</td><td>Symbio</td><td>PPS7</td><td>24 באר קלטת (19 מ"מ ופעמים; 36 מ')</td></tr></tbody></table>

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

אחת הטכנולוגיות החשובות ביותר לביצוע אנליזה פונקציונלית חלבון במערכת baculovirus במבחנה תא תרבות מערכת ביטוי גנים ארעית. מערכת זו פותחה כדי גנים זרים אקספרס תחת השליטה של האמרגן baculoviral ב ביטוי ארעי פלסמידים. יתר על כן, מערכת זו ניתן להחיל על assay פונקציונלי של baculovirus עצמו או חלבונים זרים. מערכת ביטוי נרחב ביותר מבחינה מסחרית זמינים ג'ין ארעי מפותח בהתבסס על האמרגן מוקדם-מיידי ג'ין (IE) של Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). עם זאת, נצפתה רמה נמוכה ביטוי של גנים זרים בתאי חרקים. לכן, מערכת ביטוי גנים ארעי נבנה לשיפור ביטוי חלבון. במערכת זו, פלסמידים רקומביננטי נבנו כדי להכיל את רצף המטרה תחת השליטה של דרוזופילה חום הלם 70 (Dhsp70) האמרגן. פרוטוקול זה מציג את היישום של זה חום מבוססי הלם pDHsp/V5-שלו (V5 epitope עם היסטידין 6) /זחל כנימה frugiperda נייד מערכת (תא sf9); מערכת זו זמינה רק עבור ביטוי גנים אלא גם להערכת פעילות אנטי-מוות של המועמד חלבונים בתאי חרקים. יתר על כן, מערכת זו יכולים להיות transfected שגם עם פלסמיד רקומביננטי אחד או transfected משותפת לשני פלסמידים רקומביננטי אויבת פוטנציאלית פונקציונלית בתאי חרקים. הפרוטוקול מדגים את היעילות של מערכת זו ומספק במקרה המעשי של טכניקה זו.

אורך מלא, אחרים truncations שני (ביר וטבעת תחומים) של Ly-IAP3 מ- LyxyMNPV היו overexpressed בתאים sf9, בהתבסס על החום מבוסס-הלם pDHsp/V5-שלו /זחל כנימה frugiperda נייד מערכת (תא sf9). PDHsp/V5-שלו הכיל דרוזופילה חום הלם חלבון מקדם מכירות, אשר כוננים ביטוי גנים במורד הזרם בטמפרטורה של 42 ° C בתנאי באמצעות הסלולר גורמים תעתיק תרגום מערכת (איור 1)8 ,9,11</s...

פרוטוקול זה מתאר חום חלבון הנוצרות על-ידי הלם ביטוי מערכת (pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת), אשר יכול לשמש עבור המבטאים חלבונים זרים או הערכת אנטי-אפופטוטיים להיפגע הפעילות של חלבונים זרים פוטנציאליים ו שלהם קטום אמינו חומצות בתאי חרקים.

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

המטרה הכוללת של מערכת ביטוי חלבון זו הנגרמת על ידי הלם חום היא להעריך פעילות אנטי-אפופטוטית של חלבון בשני חלבונים בעלי פוטנציאל אנטגוניסטי מבחינה תפקודית בתאי חרקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי התפקודים והפעילויות של חלבונים מועמדים בביוטכנולוגיה ובפרוטאומיקה, כגון הפעילויות האנטי-אפופטוטיות שלהם ואינטראקציות חלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתזמון ביטוי הגנים נשלט על ידי אינדוקציה של הלם חום.כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המצב התפקודי של החלבון. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות, כגון ביטוי חלבון יונקים. תאי החרקים Spodoptera frugiperda, או Sf9, המשמשים בפרוטוקול זה גדלים במדיום תרבית תאים בצלוחיות תרבית תאים של 25 סנטימטר רבוע בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.לנער את בקבוק תרבית התאים כדי לנתק את התאים מהבקבוק. לאחר מכן בדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שכ-80% מהתאים מנותקים. העבירו 50% מתרחיף התא לבקבוק תרבית תאים חדש בגודל 25 סנטימטר רבוע, ואפשרו לתאים להיצמד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.לאחר 15 דקות, החליפו את המדיום בחמישה מיליליטר של מדיום תרבית טרי, וגדילו בחממה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. בהתאם לצמיחת התאים, יש לעבור את התאים כל יומיים-שלושה. לפני קצירת תאי Sf9, חשוב לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ האור כדי לוודא שאין זיהום על ידי חיידקים או מיקרואורגניזמים אחרים.כדי לקצור את תאי Sf9, יש לנער את בקבוק התרבית כדי לנתק את התאים, ולאחר מכן להעביר את תרחיף התאים לצינור של 15 מיליליטר. בעזרת פיפטה P10, העבירו 10 מיקרוליטר של תרחיף התא להמציטומטר, וספרו את מספר התא תחת מיקרוסקופ האור. צלחת שלוש פעמים 10 עד חמישית תאים לכל באר של צלחת 24 בארות, והשאירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.לאחר 15 דקות, החלף את המדיום ב 0.5 מיליליטר מדיום ציפוי. הכן את עוצר העברת התאים. עבור כל טרנספקציה, יש לדלל שמונה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה של תאים עם 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים נטול סרום, ומערבולת למשך שנייה אחת לערבוב.במחקר זה, שלושה קטעים שונים של הגן הבקולו-ויראלי, מעכב אפופטוזיס 3, או IAP3, יבואו לידי ביטוי תחת בקרה של מקדם הלם חום דרוזופילה 70, IAP3 באורך מלא, חיתוך חסר תחום RING וקטיעה חסר תחום BIR. הוסף שני מיקרוגרם מכל DNA פלסמיד ל-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים נטול סרום, וערבב על ידי מערבולת למשך שנייה אחת. הכן גם בקרה חיובית.שלב את ה-DNA של הפלסמיד המדולל ואת מגיב העברת התאים המדולל, וערבב על ידי מערבולת. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בעזרת פיפטה P1000, הוסף 210 מיקרוליטר מכל תערובת ריאגנט טרנספקציה של DNA טיפה על התאים.דגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות. לאחר חמש שעות, החלף את מדיום הציפוי ב -0.5 מיליליטר של מדיום תרבית תאים, ואז אטום את צלחת 24 הבארות בסרט. דגירה ב-28 מעלות.למחרת, הלם חום כדי לגרום לביטוי חלבון על ידי הצפת הצלחת באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, החזירו את צלחת 24 הבארות לחממה של 28 מעלות צלזיוס. ביטוי החלבון מאושר לאחר מכן על ידי כתם מערבי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כדי לבחון אפופטוזיס של תאים המושרה על ידי גנים, הכינו תחילה תאי Sf9 כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, העבירו את התאים באותו אופן כמו קודם, אך כללו מיקרוגרם אחד של פלסמיד המכיל גן משרה אפופטוזיס בכל תגובת טרנספקציה. דוגרים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות, מחליפים את המדיום ודוגרים למשך 16 שעות.הלם חום את התאים המועברים ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. דגרו על התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות לפני ביצוע בדיקת כדאיות התא. עבור אפופטוזיס תאים המושרה על ידי כימיקלים, צלחת אחת כפול 10 עד ששת תאי Sf9 לכל באר של צלחת של שש בארות.השאירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ואז החליפו את המדיום במיליליטר אחד של מדיום ציפוי. העבירו את התאים עם ארבעה מיקרוגרם מכל DNA פלסמיד. לאחר חמש שעות, החלף את מדיום הציפוי במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים, ודגר את התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.ואז הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. דגרו על התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות לאחר הלם חום. לאחר מכן טפל בתאים שעברו טרנספטציה עם אקטינומיצין D כדי לגרום לאפופטוזיס.דגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות לפני ביצוע בדיקת כדאיות התא. התחל הליך זה על ידי שטיפת התאים המטופלים. מוציאים את המדיום מכל באר, מוסיפים מיליליטר PBS ומשאירים למשך דקה.שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS בצורה זו. השעו מחדש את התאים בכל באר עם מיליליטר אחד של PBS המכיל 04% טריפן כחול, והכתים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. העבירו את מתלה התא לצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר.העבירו 10 מיקרוליטר מתרחיף התאים המוכתמים בכחול טריפן להמציטומטר, וספרו את התאים השלמים הקיימים תחת מיקרוסקופ אור. לבסוף, בצע ניתוח סטטיסטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. האורך המלא ושני הקטעים של IAP3 מ-Lymantria xylina MNPV התבטאו יתר על המידה בתאי Sf9, וכתם מערבי בוצע על ליזטים של תאים כדי לאשר את ביטוי החלבון.החלבון האנטי-אפופטוטי Ac-P35 נכלל כביקורת חיובית. ניתן היה לזהות את כל החלבונים בתאים שעברו טרנספטציה שעה או חמש שעות לאחר הלם חום, עם ביטוי גבוה יותר לאחר חמש שעות. ניתן להתאים מערכת זו להערכת פעילות אנטי-אפופטוטית.עבור אפופטוזיס תאים המושרה על ידי גנים, משרה האפופטוזיס Drosophila Reaper הועבר במשותף עם מבני פלסמיד של גן המטרה לתאי Sf9, אשר לאחר מכן עברו הלם חום כדי להפעיל ביטוי גנים. בהשוואה לווקטור Drosophila Reaper, הבקרה החיובית הראתה פעילות אנטי-אפופטוטית גבוהה, שהגיעה עד 80% משיעור הכדאיות. המבנים האחרים הראו השפעות שונות על פעילות אנטי-אפופטוטית.עבור אפופטוזיס תאים המושרה על ידי כימיקלים, רק מבנה אחד הועבר לתאי Sf9, ואקטינומיצין D נוסף חמש שעות לאחר הלם חום. בהשוואה לבקרה החיובית או לביקורת השלילית, המבנים האחרים הראו השפעות שונות על פעילות אנטי-אפופטוטית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים-שלושה אם היא מבוצעת כראוי.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לציית לכללי הפעולה של תרבית תאים בזרימה למינרית ולבדוק את מצב התאים בשקדנות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון קו-אימונו-משקעים, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האם יש אינטראקציה כלשהי בין שני החלבונים המתבטאים יחד בתאי החרקים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביוטכנולוגיה לחקור תפקודי חלבונים בבעלי חיים או במיקרואורגניזמים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במערכת זו כדי לבטא חלבון זר או להעריך חלבונים שעלולים להיות אנטגוניסטיים מבחינה תפקודית בתאי חרקים. אל תשכח שעבודה עם כימיקלים מסוימים, כמו אקטינומיצין D, עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.

transient-expression-foreign-genes-insect-cells-sf9-for-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

שיטות באמצעות מערכות alphavirus transducing להביע כתבים פלורסנט במבחנה יתושים בוגרים מתוארים. טכניקה זו עשויה להיות מותאם כדי להביע כל חלבון של עניין במקום או בנוסף לכתב.

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

כאן אנו מתארים את דרך להביע את פני השטח אנטיגנים וירוס שפעת בצורה נכונה מקופלים ופונקציונליים הנגזרים מנגיף H7N9 הרומן הסיני בתאי חרקים. הטכניקה יכולה להיות מותאמת להביע ectodomains של כל משטח חלבונים נגיפיים או סלולריים.

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

במחקר זה הושווה ביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי מטרה בפלטפורמות ייצור שונות. התמקדנו בתרבויות מסורתיות מבוססות תסיסה ובצמחים, תיארנו את ההגדרה של כל מערכת והדגשנו, על בסיס התוצאות המדווחות, את המגבלות והיתרונות הגלומים בכל פלטפורמה.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

מערכות Nonlytic ביטוי תא חרקים הם מנוצלים לייצור, סחר / לוקליזציה הסלולר, וניתוח פונקציונלי חלבון רקומביננטי. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת וקטורי ביטוי והבעת חלבון חולפת עוקבת בשורות תא פרפראים זמינות מסחרי. שיתוף הלוקליזציה של aquaporins tabaci Bemisia עם חלבונים בסמן פלורסנטי התת-תאי מוצגת גם.

ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר בית carboxylesterase לעוף חלבונים במבחנה עם מערכת ביטוי תא חרקים baculovirus מתווכת, מאוחר יותר פונקציונלית לאפיין את תפקידיהם פרמתרין חילוף חומרים, ובכך, היוועצות pyrethroid התנגדותם מבוססת תא MTT assay, במבחנה מטבולית מחקרים.

אפיון פונקציונלי Carboxylesterases הבית בקוטלי חרקים עמידים בזבובים, דומסטיקה זבוב

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור ניצול של חרקים תא baculovirus חלבון ביטוי ומערכת לייצר כמויות גדולות של חלבונים צמח מופרש על התגבשות חלבון. וקטור ביטוי baculovirus השתנה עם GP67 או hemolin חרקים פפטיד אות לביטוי הפרשת חלבון צמחי בתאי חרקים.

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

מערכת וקטור הביטוי של baculovirus (BEVS) היא פלטפורמה איתנה להקרנת ביטוי וייצור של חלבון ארגינין מתילטרנספראזים (PRMTs) שישמשו למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים. כמויות מיליגרם של חומר יכול להיות מיוצר עבור רוב PRMTs וחלבונים אחרים של עניין הדורש פלטפורמת ביטוי eukaryotic.

ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

טרנספורמציה נבט מוצלחת תולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda, הושג באמצעות mRNA של piggyBac היפראקטיבי transposase.

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

למד להעריך פעילות נוגדת אפופטוזה של חלבונים זרים בתאי חרקים Sf9 באמצעות מערכת הבעה מושרית הלם חום. שיטה זו מאפשרת שליטה בזמן הבעת הגן ובחינת אינטראקציות חלבוניות.

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

גלה סרטונים נוספים