ההבחנה סימולטני של Monospecific ודפוסי DFS70 מעורב במהלך ההקרנה אנה עם מצע נוקאאוט הרומן של עלית/DFS70 דלקת-2

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים בדיקה אימונו-פלואורסצנטית משופרת ועקיפה המשתמשת ב-HEp-2 חדשני, מצע נוקאאוט עדין צפוף של 70 נוקאאוט כדי לסנן נוגדנים עצמיים אנטי-גרעיניים ובמקביל לאשר דפוסי 70 מנומרים עדינים חד-ספציפיים וצפופים מעורבים. המצע החדשני HEp-2 משתמש בהליך אימונופלואורסצנטי סטנדרטי ועקיף וקריטריונים לפרשנות לבדיקת נוגדנים אנטי-גרעיניים רלוונטיים מבחינה קלינית, הידועים גם בשם ANAs. היתרון העיקרי הוא היכולת להבחין בין דפוס ה-70 המנומר הדק הצפוף לבין דפוסים מעורבים הקשורים למחלה, הומוגניים או מאתגרים בשלב הסינון.

תדגים את ההליך סופיה בדנין, טכנאית ממעבדת בקרת האיכות שלנו. עבור שקופיות מצע, השתמש בשקופיות זכוכית עם 12 בארות בכל שקופית, המכילות את תאי HEp-2 הקונבנציונליים, או תערובת של 70 תאי HEp-2 מנומרים עדינים קונבנציונליים וצפופים. אפשר לשקיות המכילות את מגלשות המצע להתאזן לטמפרטורת החדר לביצועים מיטביים ולמנוע עיבוי של לחות על משטח המגלשה לפני הוספת הדגימה.

זה אמור לקחת בין 10 ל-15 דקות. לאחר שיווי משקל לטמפרטורת החדר, הסר בזהירות את שקופיות המצע באמצעות האצבעות, הימנע ממגע בין המגלשות לדפנות השקית. סמן את השקופיות והנח אותן בתא דגירה שהוא מרופד במגבות נייר לחות כדי למנוע ייבוש של השקופיות במהלך הדגירה הדגימה והמצומדת.

הוצא כ-50 מיקרוליטר של הבקרות השליליות והחיוביות, כמו גם את נסיוב המטופל המדולל על בארות שקופיות בודדות לפני הכנסת המגלשות לתא הדגירה. בדיקת ANA היא הצעד הראשון בבדיקה למחלה אוטואימונית. זה קריטי להימנע מזיהום צולב של דגימות מטופלים בשקופית כדי למזער תוצאות חיוביות כוזבות או שליליות כוזבות.

כדי למנוע זיהום צולב היטב, הימנע ממילוי יתר של הבארות. הניחו את המכסה על תא הדגירה ודגרו את המגלשות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. אם יש ANA כלשהו בסרום של המטופל, הוא ייקשר לתאים הקיימים בכל צוואה במהלך תקופה זו.

לאחר סיום תקופת הדגירה, הסר את המגלשה מתא הדגירה. החזק את השקופית בקצה הלשונית ושטוף בעדינות למשך 10 עד 15 שניות עם כ-10 מיליליטר של מאגר הכביסה המלח המחודש של פוספט. מעבירים את השקופית מיד לצנצנת קופלין עם מאגר כביסה PBS ומשרים למשך 10 דקות.

חזור על התהליך עם כל השקופיות הנותרות. הסר רק שקופית אחת בכל פעם מצנצנת קופלין. כדי להסיר את מאגר הכביסה העודף PBS מהשקופית, הקש בעדינות או מחק את השקופית על מגבת נייר.

על כל באר, יש למרוח בעדינות טיפה אחת של פלואורסצאין איזותיוציאנט, המסומן כמצומד פלואורסצנטי IgG אנטי-אנושי. לאחר מכן, דגרו את השקופיות בתא הדגירה הסגור למשך 30 דקות. לאחר סיום תקופת הדגירה, הסר את המגלשה מתא הדגירה.

החזק את השקופית בקצה הלשונית ושטוף בעדינות כמו קודם, עם כ-10 מיליליטר של מאגר כביסה PBS. מעבירים את השקופית מיד לצנצנת קופלין עם מאגר כביסה PBS ומשרים למשך 10 דקות. הניחו את פתקי הכיסוי המסופקים בערכה על מגבת נייר יבשה.

על הקצה התחתון של החלקת הכיסוי, יש למרוח בין 3 ל-4 טיפות של אמצעי ההרכבה בשורה. לאחר מכן, הוציאו שקופית אחת בכל פעם מצנצנת קופלין המכילה את מאגר הכביסה. כדי להסיר את מאגר הכביסה העודף, הקש בעדינות או מחק את השקופית על מגבת הנייר.

הימנע מהשארת כמות עודפת של מאגר כביסה על המגלשה, הפעלת לחץ רב מדי על החלקת הכיסוי או הכנסת בועות אוויר. כל אלה יכולים להשפיע על המורפולוגיה של התא, על הדפוסים הפלואורסצנטיים המתקבלים ועל עוצמת התגובות. הורד את השקופית בעדינות על החלקת הכיסוי, על ידי הנחת הקצה התחתון של המגלשה לקצה החלקת הכיסוי.

זה מאפשר למדיית ההרכבה הקיימת על החלקת הכיסוי לזרום לקצה העליון של המגלשה וממזער את היווצרותן של בועות אוויר, שעלולות להפריע לקריאת כל באר. צפה בשקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות סט מסננים פלואורסצאין איזותיוציאנט הממוקם בחדר חושך. בדוק את הדגימה לאיתור פלואורסצנטיות ירוקה בהירה ספציפית תחת המיקרוסקופ בהגדלה של פי 200 או יותר כדי לקבל את הפרשנות הסופית לגבי חיוביות ודפוס.

שימו לב לבקרות החיוביות והשליליות. הבקרה החיובית תציג פלואורסצנטיות ירוקה בהירה בגרעין. הבקרה השלילית לא תציג פלואורסצנטיות ירוקה ספציפית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

רשום את התוצאה החיובית או השלילית עבור כל באר וכלול את דפוס ה-ANA למקרים חיוביים. HEp-2 צפוף מנומר דק 70 מצע נוקאאוט משמר את כל הדפוסים הגרעיניים והציטופלזמיים העיקריים. דפוס מנומר עדין צפוף מאופיין בנוכחות של כתמים מנומרים בפיזור אחיד בכל גרעין הבין-פאזה והכרומטין בשלב המיטוטי.

נוכחותם של תאי HEp-2 קונבנציונליים המבטאים אנטיגן 70 מנומר עדין צפוף ותאי HEp-2 מהונדסים נטולי אנטיגן מאפשרת הבחנה מדויקת של דפוס ה-70 המנומר העדין, תוך שמירה על כל היתרונות של מצעי HEp-2 קונבנציונליים. סרום חיובי לדפוסי ANA הקשורים למחלות עיקריות עורבב עם סרום חיובי ל-70 דפוס מנומר עדין צפוף בפרופורציות שוות ונבדק הן על HEp-2 קונבנציונלי והן על מצעי נוקאאוט צפופים של HEp-2. כאן, חצים אדומים מצביעים על תאים בשלב המיטוטי.

חיצים צהובים מציינים את גרעיני HEp-2 הקונבנציונליים וחצים כחולים מציינים את גרעיני HEp-2 המהונדסים. עבור כל שילובי התגובות המתוארים, מצע הנוקאאוט המנומר הדק הצפוף של 70 מראה הבדל עוצמה ברור בין התאים הלא מותאמים לתאים המהונדסים באותו שדה ראייה. זה מסייע בהבחנה בין 70 תגובות מונו-ספציפיות ומעורבות צפופות עם כתמים דקים.

נוגדנים עצמיים לאנטיגנים גרעיניים וציטופלזמיים נפוצים מאוד במחלות אוטואימוניות מערכתיות. דפוס מנומר דק צפוף הנובע מנוגדנים אוטומטיים כלפי DFS70, הידוע גם בשם חלבון PSIP1, דווח כנפוץ מאוד באוכלוסיות בריאות. יתר על כן, נוגדנים עצמיים אלה DFS70 מופיעים הן בבידוד והן עם ANAs אחרים הקשורים למחלה.

זה הופך את זה לקריטי עבור מעבדות קליניות להבחין במדויק בין דפוס זה לדפוסים אחרים הקשורים למחלה. לדוגמה, בדפוס מנומר הומוגני מעורב, הקשור לזאבת, יכול להתפרש בטעות כדפוס DFS70 המחייב בדיקות אישור מרובות. שיטת אימונופלואורסצנציה עקיפה המשתמשת במצעי HEp-2 נחשבת לשיטת הסינון הסטנדרטית הזהב עבור ANAs.

עם זאת, הדיוק תלוי מאוד במיומנות הטכנאי, ביצוע קפדני של השלבים הבודדים ופרשנות מדויקת של הדפוסים המתקבלים. לעומת זאת, ההערכה ההשוואתית של מצעי נוקאאוט קונבנציונליים HEp-2 ו-DFS70 מדגימה את התועלת של מצע חדש זה בהבחנה בין דפוס DFS70 בביטחון גבוה, תוך סינון ANAs. פרשנות נוספת של דפוסי DFS70 מונופוזיטיביים ומעורבים הייתה פשוטה יחסית באמצעות מצע HEp-2 משופר זה.

המצע החדש משתמש בפרוטוקול אימונופלואורסצנטי סטנדרטי ועקיף ובקריטריוני פרשנות קבועים לכל דפוסי ה-ANA הרלוונטיים מבחינה קלינית.