שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי לחקור את פעילות Oncogenic Calreticulin מוטציה בתאים Hematopoietic תלויי ציטוקין

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להשתמש בעריכת גנים CRISPR/Cas9 כדי לדגמן מוטציות קלרטיקולין בתאים המטופויאטיים תלויי ציטוקינים על מנת לחקור את פעילותם האונקוגנית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הממאירות ההמטולוגית כגון התפקוד הביולוגי של מוטציות מניעות כאשר הן באות לידי ביטוי ברמות פיזיולוגיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במערכת עריכת הגנים CRISPR/Cas9 כדי למדל ולחקור את התפקוד הביולוגי של גנים המעורבים בסרטן.

כדי לחשל ולזרחן את האוליגוס, הוסף את הריאגנטים לסך של 10 מיקרוליטר בצינור PCR השמור על קרח. הגדר את התוכנית ב-thermocycler. השתמש במים כדי לדלל את התגובה לאחר השלמת המחזור.

כדי לעכל את וקטור lentiGuide-Puro, הכינו 50 מיקרוליטר של תגובת מעכל. לאחר מכן, התחל את תגובת העיכול ב-55 מעלות צלזיוס בגוש חום. לאחר שעה מוסיפים מיקרוליטר נוסף של אנזים הגבלה BsmB1 וממשיכים בתגובה עוד שעה.

כדי לזרחן את העצם החתוכה, הוסף שבעה מיקרוליטרים של מאגר תגובת פוספטאז ושני מיקרוליטרים של אנזים פוספטאז לווקטור העיכול. לאחר מכן, דגרו על התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. טהר את עצם הגב שכבר נחתכה ונטולת זרחן באמצעות ערכה מסחרית.

להכנת תערובת הקשירה, הוסיפו 15 ננוגרם של עצם גב מעוכלת וריאגנטים אחרים לצינור PCR השמור על קרח והתאימו את הנפח ל-10 מיקרוליטר עם מים. דגרו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן הפוך תאים תואמים STBL3 עם שני מיקרוליטרים של תערובת הקשירה.

ואז צלחת על צלחת אגר מרק ליזוגני המכילה 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. בחר שלוש מושבות וחסן אותן.

בצע מיני הכנה עבור כל תרבית ורצף את אתר החדרת האוליגו עם פריימר אזור מקדם U6. זרע תאי hek293t על צלחת של 10 סנטימטרים. והשאירו אותו לדגירה למשך הלילה.

כדי להכין את תערובת ה- DNA לטרנספקציה, פיפטה 45 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה ל- DNA. השתמש בפיפטה כדי לערבב את ה-DNA ומגיב הטרנספקציה בזהירות, ואפשר לו לעמוד במשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסף את תערובת טרנספקציית ה-DNA בטיפה על התאים הזרעים.

סובבו בעדינות את הצלחות. ולדגור ב-5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס למשך יום. קצרו את הנגיף המכיל סופרנטנט לאחר 24 ו-48 שעות על ידי העברתו דרך מסנן של 0.22 מיקרומיטר.

ו-aliquot 1.6 מיליליטר של סופרנטנט בכל בקבוקון קריו. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את תאי ה-Ba/F3 במדיה על ידי פיפטינג של התאים למעלה ולמטה מספר פעמים. הוסף 500 מיקרוליטר של התאים המרחפים, 1.5 מיליליטר של סופרנטנט נגיפי, ארבעה מיקרוליטרים של פוליברן ו-10 ננוגרם למיליליטר של אינטרלוקין עכברי 3 בצלחת תרבית רקמות של שש בארות.

צנטריפוגה את הצלחת בחום של 440 גרם למשך 120 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הצלחת לאינקובטור לדגירה לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, סובב את התאים ב -440 גרם למשך שלוש דקות.

ולהשעות בחמישה מיליליטר של מדיה חמה טרייה בצלחת שש בארות. כדי לבחור את התאים הנגועים ב-Cas9, תחילה סובב את התא. ואז להשעות מחדש במדיה חמה טרייה בתוספת חמישה מיקרוגרם למיליליטר של בלסטיצידין לאחר 48 שעות של זיהום.

המשיכו לבחור תאים במשך תשעה ימים עם בלסטיצידין עד שכל התאים הלא נגועים מתים. לאחר מכן, העבירו את התאים העמידים למדיום עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של בלסטיצידין. התמר את תאי ההורה ואת התאים המבטאים ביציבות Cas9 עם מבנה מדווח pXPR-011 באמצעות זיהום לנטי-ויראלי.

המשך לבחור תאים עם שני מיקרוגרם למיליליטר פורומיצין במשך שלושה ימים, 48 שעות לאחר הזיהום. להדביק את התאים המבטאים Cas9 בחומצה ריבונוקלאית מובילה יחידה באמצעות lentivirus. לאחר מכן, השתמש בשני מיקרוגרם למיליליטר של פורומיצין כדי לבחור את התאים למשך שלושה ימים, 48 שעות לאחר ההדבקה.

סל את תאי Ba/F3 הגדלים באופן אקספוננציאלי המבטאים Cas9 חוץ רחמי ואת החומצה הריבונוקלאית היחידה המעניינת. שאפו את הסופרנטנט ושטפו את התאים בחמישה מיליליטר של מי מלח עם פוספט. סובבו את התאים כלפי מטה, ושטפו עם מי מלח עם פוספט שלוש פעמים.

לאחר מכן, ספור את מספר התאים באמצעות מנתח כדאיות תאים. לאחר מכן, תאי זרעים בשלושה עותקים בשני מיליליטר של מדיה טרייה ללא אינטרלוקין 3 בשש צלחות תרבית באר. התחל לנטר ולספור את התאים כל יומיים במשך שמונה ימים.

נתונים פסיכומטריים של זרימה מייצגת המדגימים פעילות Cas9 בתאי Ba/F3 הוריים ותאי Cas9 המבטאים יתר על המידה Ba/F3 מוצגים כאן. אות החלבון הפלואורסצנטי הירוק מופחת ב-76% בתאי Cas9 המבטאים יתר על המידה Ba/F3, מה שמעיד על פעילות Cas9 חזקה, בעוד שבתאי Ba/F3 הורים, אות החלבון הפלואורסצנטי הירוק נשאר ב-100% עקומות גדילה מייצגות עבור תאים המדגימים פעילות אונקוגנית של קלרטיקולין מוצגות כאן. בתיווך CRISPR/Cas9 בתוספת מוטציה אחת של הזזת מסגרת זוג בסיסים הוצגה בלוקוס האקסון תשע של קלרטיקולין באמצעות m1 ו-m2 RNase מדריך יחיד

עקומות גדילה עבור תאי Cas9 של קולטן טרומבופויטין Ba/F3 ממוקדות בקלרטיקולין מראות צמיחה עצמאית של אינטרלוקין 3 עכברי. עם זאת, עקומות הגדילה של סוגי התאים האחרים אינן מראות צמיחה בלתי תלויה בציטוקינים. תוצאות הריצוף מאשרות את עריכת המטרה של אקסון תשע של קלרטיקולין אנדוגיני בתאי Cas9 של קולטן טרומבופויטין Ba/F3 באמצעות ה-RNase היחיד m1 ו-m2.

מוטציות הזזת מסגרת זוג הבסיס פלוס אחד מסומנות בשחור. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים אם היא מבוצעת כראוי. תוך כדי ניסיון הליך זה, חשוב להבין איזה סוג של מוטציות בגן המעניין עשויות להיות אחראיות לפנוטיפ הרצוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות לאפיון נוסף של המוטציה, כגון תפקידה באיתות תאים או באינטראקציות חלבון על מנת להבין עוד יותר את המנגנון שבאמצעותו הוא גורם למחלה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההמטולוגיה לחקור את ההשפעה של מוטציות בעלייה בתפקוד ברמות פיזיולוגיות על טרנספורמציה של תאים בתאים המטופויאטיים Ba/F3. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במתודולוגיית עריכת הגנים CRISPR/Cas9 כדי לחקור את הפעילות האונקוגנית של מוטציות רווח תפקוד בתאים המטופויאטיים תלויי ציטוקינים.

אל תשכח שעבודה עם lentivirus יכולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה במתקן BL2 plus בעת ביצוע הליך זה.