Name: מדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: למדו פרוטוקול משופר למדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone של שעורה באמצעות פגיעת חלקיקים. השיטה משלבת טחינה אוטומטית וניתוח אנזימטי בלוחות 96-באר כדי להגביר את התפוקה ולחקור תגובות הורמונליות בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים תודה גריסון באטלר ולברט מרגרט לעזרה בביצוע ניסויים, ג'ודי אבן לקבלת ייעוץ על תבואה המגון, לין Hannum לקבלת ייעוץ על fluorometry. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (קורע 0443676), על ידי המוסדיים פיתוח פרס (מושג) מ הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט מספר P20GM0103423, ועל ידי מענקים החלוקה מכללת קולבי של מדעי הטבע.

1. הכנת אפקטור, מדווח בונה
<ol><li>לבנות מבנים אפקטור כי מעסיקים מקדם מכוננת (למשל תירס אוביקוויטין, UBI) לביטוי נסיעה מן מסגרת קריאה פתוחה הרצוי. לדוגמה, בנו של פלסמיד המכיל UBI::TaABF1 לביטוי מכוננת חזקה נסיעה של TaABF15.</li>
	<li>לבנות מבנים כתב הכוללים ייצוג המקדם הפעילות נועד למדוד, ממוקמים במעלה הזרם של מסגרת קריאה פתוחה, כמו גאס. לדוגמה, בנו של פלסמיד המכיל HVA1::GUS כדי למדוד את הביטוי בין2,יזם HVA1 5.</li>
	<li>לבנות לבנות בקרה פנימית (למשל UBI::לוציפראז).</li>
	<li>באמצעות עמודת איגוד סיליקה פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים), להכין פלסמיד באיכות גבוהה עבור כל אחד בונה הגן חובה. בעזרת ספקטרוסקופיית אולטרה סגול (ראה טבלה של חומרים), בקפידה למדוד את ריכוז כל הכנה פלסמיד.</li>
</ol>2. הכנה של גרגרי שעורה הפגזה
<ol><li>להגדיר את גיליון אלקטרוני (לקבלת דוגמה, ראה איור 1 ) המציין את פלסמידים זה תהיה מופגז, הטיפולים המתאימים הורמון, ומידע רלוונטי נוסף עבור כל טיפול זה יהיה חלק מהניסוי.</li>
	<li>באמצעות קרש חיתוך, סכין גילוח סטרילי, לחתוך את העוברים בין גרגרי שעורה ההימליה (40 הטיפול כלולה הניסוי). הכללת גרגרים דהוי או קטנים יותר באופן משמעותי מהממוצע.</li>
	<li>מניחים שכל הגרגרים embryoless לתוך צינור 50 מ. להוסיף 40 מ של מים, סלע במשך 10 דקות.</li>
	<li>שופכים את המים בזהירות (כדי להימנע מאובדן גרגרים) ולהוסיף 40 מיליליטר 10% מלבין. רוק במשך 20 דקות.</li>
	<li>שופכים את המלבין ולהוסיף 40 מיליליטר מים סטריליים. רוק למשך 5 דקות. חזור על זה לשטוף במים סטריליים ארבע פעמים נוספות.</li>
	<li>להוסיף 40 מ"ל של שתיית פתרון (succinate נתרן 20 מ מ, 20 מ מ סידן כלורי, pH 5.0) וμl 40 של פתרון מניות כלורמפניקול (10 mg/mL).</li>
	<li>להעביר את רוב הפתרון שתיית (עם כלורמפניקול) באמצעות הרכבת התחתית לתוך צלחת ורמיקוליט (ראה טבלה של חומרים). ואז להעביר את הגרגרים על גבי המשטח של נייר הסינון הרטוב בצלחת ורמיקוליט. שמתפזר הגרגרים. יציקת בפתרון imbibing מספיק כדי לשמור על הגרגרים חלקית (אבל לא לגמרי) במים. מקם את המכסה על גבי הלוח ורמיקוליט.</li>
	<li>דגירה החיטים embryoless ב 24 מעלות צלזיוס במשך כ- 48 שעות עם תאורת פלורוסנט. להוסיף פתרון שתיית נוספים לפי הצורך.</li>
	<li>להיפתח 90 מ מ פלסטיק פטרי, שופכים 20 מ של פתרון שתיית לתוך המנה עצמה, 20 מ"ל לתוך המכסה הפוך. להוסיף כל אחד μL 20 כלוראמפניקול (10 mg/mL). לעקר את שני זוגות של הצבע בסדר מלקחיים בטבילת אותם באלכוהול.</li>
	<li>מניחים כמה מן החיטים embryoless המכסה של הפטרי. עם המלקחיים, להסיר בעדינות קליפת הזרע (שקוף) כל גרגיר. בעת הסרת קליפת הזרע מן הצד חלקה של התבואה, לא לפגוע בתאים (aleurone) המשמש כבסיס. להעביר את התבואה קלופים הפטרי הכוללת שתיית פתרון.</li>
	<li>לאחר קילוף קליפת הזרע מכל הגרגרים, להחזיר אותם לצלחת ורמיקוליט. תקופת דגירה החיטים embryoless קלופים ב 24 ° C של 16-20 שעות.</li>
	<li>רק לפני השימוש הגרגרים עבור הפגזה, להסיר לחות משטח ע י ניעור אותם בין מסנן המסמכים בצלחת פטרי.</li>
</ol>3. הכנה של פלסמיד DNA עבור הפגזה
<ol><li>תווית צינור 1.5 mL עבור כל טיפול זה ייכלל הניסוי הפגזה. כדי כל שפופרת להוסיף 2.5 µg של UBI::לוציפראז בקרה פנימית פלסמיד, µg 2.5 פלסמיד כתב גאס , את הסכום הרצוי (בדרך כלל 0.025 µg כדי 2.5 µg) של פלסמיד אפקטור. מוסיפים מים כדי להביא את הנפח הכולל 5 µL.</li>
	<li>להכין 1.6 מיקרומטר זהב microcarriers (ראה טבלה של חומרים) בעקבות פרסום הפרוטוקולים6.</li>
	<li>עבור כל טיפול, להוסיף 50 µL של microcarriers על תנאי לתוך הצינור 1.5 mL המכילה DNA פלסמיד. מעיל של microcarriers עם פלסמיד הדנ א על פי פרוטוקולים של היצרן6.</li>
	<li>בשלב הסופי, כאשר microcarriers מצופים פלסמיד מושעים 48 µL 100% אתנול, pipet 8 μL של microcarriers על תנאי על גבי כל אחד חמש macrocarriers ולאפשר להם לאוויר יבש.</li>
</ol>4. חלקיקים הפגזה של גרגרי שעורה Embryoless
<ol><li>להרכיב את המערכת הפגזה של חלקיקים (ראה טבלה של חומרים)6.</li>
	<li>להכניס דיסק קרע 1550 psi בתוך הכיפה שהגנו והר אותה על המכשיר.</li>
	<li>המקום של macrocarrier המכילה את השילוב הרצוי פלסמיד (יחד עם מסך עצירה) לתוך מכלול ההשקה microcarrier. הכנס את מכלול לתוך החריץ העליון של התא הפגזה. קבעו את המרחק בין הדיסק קרע שמירה, פקקי מכסה כיסוי macrocarrier ממרחק סטנדרטי (6 מ מ), ולמקם את תמיכת מסך עצירה במיקום האמצעי (רגיל), המאפשר מרחק הנסיעה macrocarrier של 11 מ"מ (איור 2 א).</li>
	<li>לסדר את גרגרי embryoless 8 בדפוס רדיאלי חזק (עם מסתיים רזה הצבעה פנימה) על עיגול נייר סינון מודבקת למטה שטוח המכסה של צלחת פטרי 90 מ מ (ראה איור 2B).</li>
	<li>מקם את המנה עם הגרגרים אל החדר הפגזה, במרחק של 6 ס מ מן המסך עצירה.</li>
	<li>לפנות את החדר הפגזה 95 kPa, ואז להפציץ את הדגימה.</li>
	<li>לאחר שחרור האבק, להעביר החיטים bombarded צלחת פטרי עם תוויות 60 מ מ המכיל 4 מ"ל של שתיית פתרון המכיל 1 מ ג/מ ל כלורמפניקול.</li>
	<li>חזור עד כל הפגזות הושלמו. דגירה (על פלטפורמה חזק 100 סל"ד) ב 24 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.</li>
</ol>5. החילוץ של חלבון מסיס מן החיטים Bombarded
<ol><li>באמצעות מלקחיים, להסיר את החיטים bombarded 8 צלחת פטרי 60 מ מ, למחוק אותם יבש על מגבת נייר. לחלק את הגרגרים mL 2.0 שכותרתו שני צינורות (4 גרגרים למחזור) שכל אחד מהם מכיל 800 μL טחינת מאגר (100 מ מ נה פוספט pH 7.2, 5 מ מ DTT, 10 leupeptin µg/mL, גליצרול 20%) וחרוז נירוסטה 5 מ מ. חזור על תהליך זה עבור כל הדגנים מופגז.</li>
	<li>להכניס צינורות 2.0 mL (עד 48) בתוך המדפים שני של מהמגן חרוז (ראה טבלה של חומרים). הר המדפים על מהמגן.</li>
	<li>לנער את הדגימות ב 30 הרץ במשך 3 דקות.</li>
	<li>להסיר את המדפים מהמגן מהמגן ולמקם אותם על קרח (5 דקות) מחדש לצנן את הדגימות.</li>
	<li>הר המדפים על מהמגן - בכיוון ההפוך. לנער את הדגימות שוב ב 30 הרץ במשך 3 דקות.</li>
	<li>מגניב המדפים על קרח, ואז חזור על צעדים 5.3 ל 5.5. זה יוסיף סך של 12 דקות של טלטול.</li>
	<li>Centrifuge תמציות דגן ב g 16,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>
מיד לאחר צנטריפוגה, decant את supernatants ברור לתוך קבוצה שנייה של microcentrifuge צינורות. לתת כל שפופרת מערבולת מהירה. לאחסן הצינורות על קרח.</li>
	<li>לאחר העברת את תגובת שיקוע, לשחזר את החרוזים פלדה כדורי אז הם יכולים להיות שטופים לעשות בה שימוש חוזר.</li>
</ol>6. מדידת פעילות לוציפראז מן התבואה תמציות
<ol><li>לכל שפופרת של תבואה תמצית כדי להיות לבדיקה, להכין 12 מ"מ x 75 מ"מ זכוכית מבחנה המכילה 200 μL תערובת Assay לוציפראז (45 מ מ טריס חומצה גופרתית pH 7.7, 15 מ מ MgCl2, 20 מ מ DTT, 1.5 mM EDTA, luciferin 1 מ מ, 1 מ מ ATP).</li>
	<li>להוסיף 100 μL של תמצית תבואה הראשון הצינור assay הראשון. מערבולת במהירות כדי לערבב היטב. מיד למקם את הצינור לתוך צינור האוחז luminometer וסגור את הדלת. עם סיום המדידה, הסר את הצינורית luminometer – השארת הדלת פתוחה עבור מיקום של הצינור הבא.</li>
	<li>חזור על תהליך זה עד כל הדגימות נמדדו.</li>
</ol>7. מדידה של גאס פעילות של תמציות של דגנים
<ol><li>להוסיף 200 μL גאס Assay מאגר (50 מ מ נה פוספט pH 7.2, 2.5 מ מ 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 מ מ DTT, 2 מ מ EDTA, leupeptin µg/mL 10, 20% מתנול, אזיד הנתרן 0.02%) כל טוב של צלחת טוב 96.</li>
	<li>במקום 50 μL של כל גרגיר לחלץ לתוך המתאימה היטב. מערבבים עם הטיפ לאחר הוספה. חותם העליון עם איטום הסרט.</li>
	<li>תקופת דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס בחושך של 20 שעות.</li>
	<li>Centrifuge את הצלחת היטב 96 ב g 4,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומניחים אותו על קרח.</li>
	<li>להוסיף 250 μL של 0.2 מ'-נה-2CO-3 כל טוב של צלחת טוב שחור 96.</li>
	<li>להוסיף 6.25 μL של כל תערובת assay גאס centrifuged המתאימה טוב (המכיל 0.2 מ' נה2CO3) של השחור 96 טוב צלחת. מערבבים עם הטיפ לאחר הוספה. לכלול וולס עם μL 6.25 μM 10, 40 μM ו 100 μM 4-methylumbelliferone כמו סטנדרטים.</li>
	<li>למקם את הלוח השחור fluorometer צלחת ולקרוא את זריחה של methylumbelliferone. קח את הקריאות-גל עירור של 360 ננומטר, אורך גל של פליטה של 460 ננומטר. להגדיר את הרווח של המכשיר כך על μL טוב המכיל 6.25 של 4 μM 40-methylumbelliferone 250 μL של 0.2 מ'-נה-2CO-3 מאפשר קריאה של 1000 יחידות קרינה פלואורסצנטית.</li>
</ol>8. ניתוח נתונים
<ol><li>הזן את הערכים עבור לוציפראז ו גאס מבחני לתוך גיליון אלקטרוני. אל תכלול התייחסות דוגמה עם קריאת לוציפראז נמוך יותר מאשר הפריה חוץ גופית יחסית 20,000 יחידות s-1, כי זה מצביע על כי המבנה ג'ין לא בהצלחה נשלחו אל תאי aleurone.</li>
	<li>עבור כל גרגיר בהצלחה bombarded לחלץ (ייצוג קבוצה של ארבעה גרגרים embryoless), לחשב את הביטוי גאס מנורמל מתוך הנתונים הגולמיים גאס ואני לוציפראז כדלקמן: מנורמל גאס = [(ביטוי גאס - גאס ריק) x (2,000,000)] / (לוציפראז ביטוי – לוציפראז ריק). הערה: זה מווסת את כמות הפעילות גאס מה נצפו בהפגזות שנתן קריאה לוציפראז של 2,000,000.</li>
	<li>דווח על הרמה היחסית של ביטוי של מבנה כתב מסוים בנוכחות אפקטור בונה או טיפולים בהורמון נבדק על ידי השוואת לרמה של הביטוי בהיעדרו של effectors או הורמונים.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Integ.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li>
<li>Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gibberellin+response+complex+in+cereal+alpha-amylase+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters.</a> Plant Cell. 4, 203-211 (1992).</li>
<li>Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+nature+of+abscisic+acid+%28ABA%29+response+complexes%3B+composite+promoter+units+that+are+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression.</a> Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).</li>
<li>Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibberellin%2Fabscisic+acid+antagonism+in+barley+aleurone+cells%3A+site+of+action+of+the+protein+kinase+PKABA1+in+relation+to+gibberellin+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules.</a> Plant Cell. 13, 667-679 (2001).</li>
<li>Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wheat+PKABA1-interacting+factor+TaABF1+mediates+both+abscisic+acid-suppressed+and+abscisic+acid-induced+gene+expression+in+bombarded+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells.</a> Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).</li>
<li>Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+TaABF1+during+abscisic+acid+and+gibberellin+signaling+in+aleurone+cells+of+cereal+grains%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Science+Res%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains.</a> Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).</li>
<li>Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+definition+of+ABA-response+complexes%3A+the+promoter+units+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression+in+barley+%28Hordeum+vulgare%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare).</a> Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).</li>
<li>Ritchie, S., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+signal+transduction+in+the+barley+aleurone+is+mediated+by+phospholipase+D+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).</li>
<li>Takemiya, A., Shimazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+inhibits+blue+light-induced+stomatal+opening+via+inhibition+of+protein+phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1.</a> Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).</li>
<li>Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+WRKY+gene+from+creosote+bush+encodes+an+activator+of+the+abscisic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).</li>
<li>Ishibashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+are+involved+in+gibberellin%2Fabscisic+acid+signaling+in+barley+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells.</a> Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).</li>
<li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li>
<li>Hong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-mediated+regulation+of+a+rice+ABA+responsive+element+binding+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor.</a> Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).</li>
<li>Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABI5+acts+downstream+of+ABI3+to+execute+an+ABA-dependent+growth+arrest+during+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination.</a> Plant J. 32, 317-328 (2002).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS2-LIKE+PROTEIN+KINASE5%2C+an+SNF1-RELATED+PROTEIN+KINASE3-Type+protein+kinase%2C+is+important+for+abscisic+acid+responses+in+Arabidopsis+through+phosphorylation+of+ABSCISIC+ACID-INSESENSITIVE5%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5.</a> Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

המבוא של ג'ין אפקטור בונה באמצעות חלקיקים הפגזה, ואחריו הביטוי ארעית של הכתב בונה היא אסטרטגיה ערך ניקוד את התפקיד של שחקנים מסוים ב- GA/ABA איתות וב -הגן מוסדר הורמון וכתוצאה מכך ביטוי. עם זאת, קיימים פרוטוקולים עבור ביצוע ניסויים אלה שעורה aleurone תאים2,3,4,5,6 הם עבודה מאוד אינטנסיבית. כל קבוצת מופגז בקושי גרגרים להיות יד הומוגני ב ומכתש, ועל תמציות וכת...

השכבה aleurone שעורה היא מערכת מודל ומבוססת על המחקר של ביטוי גנים מוסדר הורמון צמחי1. בפרט, יש מספר גנים הדרושים עבור נביטה או להתפתחות שתיל המוקדמת מופעלים על ידי ג'יברלין (ג'י אי), בעוד גנים הקשורים תגובות הלחץ מופעלים על ידי חומצה אבציסית (ABA). המשחק ואת ABA מסלולי איתות שלובים זה בזה, כפי הביטוי של גנים מסוימים מופעל GA מעוכבת על ידי ABA, ולהיפך1.
אסטרטגיה חשוב להבין שהתפקיד של שחקנים מסוים ב- GA/ABA איתות כבר המבוא של בונה ג'ין אפקטור באמצעות הפגזה של חלקיקים, ואחריו הביטוי ארעית של בונה כתב לאפשר את האפקט המתקבל על ביטוי גנים במורד הזרם נקבע. השימוש של הכתב גנים כמו גאס (β-glucuronidase) או לוציפראז מאפשר את המדידה רגיש, תפוקה של ביטוי גנים במיוחד בתוך התאים, כי קיבלו הבונה אפקטור. לדוגמה, כניסתה של הבונה אפקטור קידוד של פקטור שעתוק TaABF15,6 הוקם כי ABA-induced גנים כגון HVA1 הם המושרה על-ידי TaABF1, תוך כדי משחק-induced גנים כגון Amy32b . מדוכאים. הפגזה של חלקיקים כמו אסטרטגיית ניסיוני שימש על ידי מעבדות מרובים כדי לחקור היבטים שונים של GA/ABA איתות. עבודה כל כך הוביל לזיהוי של יזם אלמנטים חשובים עבור ההפעלה של GA-induced2 וגם הגנים ABA-induced3, לגילוי של חלבונים kinases4 , תמלול גורמים5 המסדירים ביטוי של גנים אלה.
קיימים פרוטוקולים2,3,4,5,6 עבור חלקיקים הפגזה ומדידה עוקבות של ביטוי גנים ארעי הם די עמל רב, כמו כל קבוצה של מופגז בקושי גרגרים הוא הומוגני על ידי יד ומכתש, מבחני אנזים מבוצעות בנפרד. כתב יד זה מדווח על פרוטוקול משופרת זה הופך לאוטומטיים ופישוט השלב המגון חלקית, מבחני גאס כדי לאפשר תפוקת יותר באופן משמעותי, המתיר מספר גדול יותר של טיפולים כדי שיהיה ניתן לבחון אותו אותו ניסוי, או הכללה של משכפל נוסף עבור כל טיפול להשיג תוצאות סטטיסטית חזקים יותר. נציג התוצאות יוצגו עבור הביטוי של בונה כתב HVA1 , Amy32b , מוסדר על ידי הגורם שעתוק TaABF1, כמו גם על ידי GA, ABA, מולקולות רגולטוריות אחרות.

<table><tbody><tr><td>ערכת GeneElute HP פלסמיד Maxiprep</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר UV-vis</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>גרגרי שעורה הימלאיה</td> <td>/</td><td>/</td><td>מגוון שעורה ללא קליפה (אחסן בחושך ב-4&deg; ג)</td></tr> <tr><td>נתרן סוקסינט</td><td>סיגמא</td><td>S2378</td><td>מגיב לספיגת תמיסת</td></tr><tr><td>סידן כלורי (דיהידרט)</td><td>מגיב פישר</td><td>C79-500</td><td>להטמעת תמיסת</td></tr><tr><td>תמיסת ספיגה</td><td>תוצרת בית</td><td>/</td><td>20 מ"מ נתרן סוקסינט, 20 מ"מ סידן כלורי, pH 5.0. יש לעקר על ידי חיטוי לפני השימוש.</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סיגמא</td><td>C0378</td><td>הכן תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל באתנול 70%.</td></tr><tr><td>ורמיקוליט</td><td>פישר</td><td>NC0430369</td><td>משמש ללוחות ורמיקוליט.</td></tr><tr><td>עיגולי נייר סינון (90 מ"מ)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>משמש לוורמיקוליט ולהכנת תבואה לפני הפצצה</td></tr><tr><td>צלחות ורמיקוליט</td><td>תוצרת בית</td><td>/</td><td>הוסף 50 מ"ל ורמיקוליט לצלחת פטרי מזכוכית. מניחים עיגול נייר 90 מ"מ על גבי הוורמיקוליט. חיטוי.</td></tr><tr><td>מלקחיים (מחודדים עדין)</td><td>פישר</td><td>13-812-42</td><td>משמש להסרת מעיל זרעים מגרגרי שעורה.</td></tr><tr><td>מלקחיים (נקודה עדינה במיוחד)</td><td>פישר</td><td>12-000-122</td><td>משמש להסרת מעיל זרעים מגרגרי שעורה.</td></tr><tr><td>מיקרו-נשאי זהב (1.6 &mu; m)</td> <td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>מקרו-נשאים</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי (דיהידרט)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>הכן תמיסת מלאי של 2.5 M ואחסן 1 מ"ל aliquots ב-20&0 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>הכן תמיסת מלאי של 100 מ"מ ואחסן 500 &mu; L aliquots ב-20&deg; C (לשימוש תוך חודשיים).</td></tr><tr><td>דיסקי קרע (1550 psi)</td><td>BioRad</td><td>1652331</td><td></td></tr><tr><td>מסכי עצירה</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>מחזיקי מקרו-נשאים</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אספקת חלקיקים ביוליסטיים</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונוהידראט מונוהידראט</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>מגיב ל-1M נתרן פוספט pH 7.2</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>מגיב ל-1M נתרן פוספט pH 7.2</td></tr><tr><td>1M נתרן פוספט pH 7.2</td><td>תוצרת בית</td><td>/</td><td>שלב 6.9 גרם נתרן פוספט מונוהידראט מונו-בסיסי עם 7.1 גרם נתרן פוספט דו-בסיסי. הוסף מים ל 100 מ"ל. הוסף NaOH כדי לקבל pH 7.2.</td></tr><tr><td>dithiothrietol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>ממיסים במים ל-1 מ'. יש לאחסן ב-20&deg; ב-1 מ"ל מינקוטים.</td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>סיגמא</td><td>L2884</td><td>מתמוסס במים ל-10 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; </td></tr><tr><td>C.glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>הכינו תמיסה של 50% במים.</td></tr><tr><td>מאגר טחינה</td><td>תוצרת בית</td><td>/</td><td>לשלב 10 מ"ל של 1 M נתרן פוספט pH 7.2, 500 &mu; L של 1 מ' DTT, 100 &mu; ליטר של 10 מ"ג/מ"ל לאופפטין, ו-40 מ"ל של 50% גליצרול. הוסף מים ל 100 מ"ל.</td></tr><tr><td>חרוזי נירוסטה (5 מ"מ)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 2.0 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>דגם ספציפי זה של צינור מומלץ לשימוש עם ההומוגנייזר.</td></tr><tr><td>הומוגנייזר חרוזים (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות זכוכית 12 מ"מ x 75 מ"מ</td><td>פישר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לוציפרין</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>הכן תמיסת מלאי של 25 מ"מ ואחסן 1 מ"ל ב-20&20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>הכן פתרון מלאי של 100 מ"מ ואחסן 250 &mu; L aliquots ב-20&deg; &nbsp;ג.</td></tr><tr><td>מגיב בסיס Tris</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>עבור 1M Tris sulfate pH 7.7.</td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>Reagent עבור 1M Tris sulfate pH 7.7.</td></tr><tr><td>1M טריס סולפט pH 7.7</td><td>תוצרת בית</td><td>/</td><td>ממיסים 12.1 גרם בסיס טריס ב-100 מ"ל מים. התאם את ה-pH ל-7.7 עם חומצה גופרתית.</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>יש להמיס במים לעומק של 2 מ'.</td></tr><tr><td>מאגר בדיקת לוציפראז (LAB)</td> <td>תוצרת בית</td><td>/</td><td>קומביין 3 מ"ל של 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 &mu; L של 2 M מגנזיום כלוריד, 1 מ"ל של 1 M DTT, ו-200 &mu; L של 0.5 מ' EDTA. להוסיף מים ל-50&nbsp; מ"ל.</td></tr><tr><td>תערובת בדיקת לוציפראז</td><td>תוצרת בית</td><td>/</td><td>קומביין 15 מ"ל של LAB, 800 &mu; L של 25 מ"מ לוציפרין, 200 &mu; ליטר של 100 מ"מ ATP, ו -4 מ"ל מים. זה יוצר מספיק תערובת בדיקה (20&nbsp; מ"ל) עבור 100 מבחני לוציפראז.</td></tr><tr><td>לומינומטר (סיריוס)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl-&beta;-D-glucuronide (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>מתמוסס ב-DMSO ל-100 מ"מ.</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא</td><td>S8032</td><td>הכן תמיסת מלאי של 2% במים ואחסן 1 מ"ל ב-20&0 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>96 צלחות באר (סטנדרטיות)</td> <td>פישר</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>מאגר בדיקת GUS</td><td>תוצרת בית</td><td>/</td><td>שלב 2.5 מ"ל של MUG, 5 מ"ל של 1 M נתרן פוספט pH 7.2, 400 &mu; L של 0.5 מ' EDTA, 1 מ"ל של 1 מ' DTT, 100 &mu; ליטר של 10 מ"ג/מ"ל לאופפטין, 20 מ"ל מתנול ו-1 מ"ל של 2% נתרן אזיד. הוסף מים ל 100 מ"ל.</td></tr><tr><td>סרט איטום TempPlate</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחות באר (שחור)</td> <td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פחמתי</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>הכן תמיסה של 200 מ"מ במים.</td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>הכן 100 &mu; תמיסת M במים. להקפיא 1 מ"ל ב-20&deg; &nbsp;ג.</td></tr><tr><td>קורא שטף מיקרופלייט</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת ביטוי גנים בשכבות aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

השכבה aleurone של גרגרי שעורה היא מערכת מודל חשוב על ביטוי גנים מוסדר הורמון בצמחים. בתאים aleurone, גנים הדרושים עבור נביטה או להתפתחות שתיל המוקדמת מופעלים על ידי ג'יברלין (ג'י אי), בעוד גנים הקשורים תגובות הלחץ מופעלים על ידי חומצה אבציסית (ABA). המנגנון של GA ו ABA איתות יכולה להיחקר על ידי החדרת כתב ג'ין בונה לתאים aleurone באמצעות הפגזה של חלקיקים, עם ביטוי ארעי וכתוצאה מכך נמדד באמצעות מבחני אנזים. פרוטוקול משופר הוא דיווח זה חלקית הופך לאוטומטיים ופישוט השלב המגון דגן, את מבחני אנזים, ומאפשר תפוקה יותר באופן משמעותי מאשר שיטות קיימות. המגון הדגימות תבואה מתבצעת באמצעות מהמגן רקמות אוטומטיות של, מבחני גאס (β-glucuronidase) מתבצעות באמצעות מערכת צלחת 96-ובכן. נציג תוצאות באמצעות הפרוטוקול מראים כי פעילות phospholipase D עשוי לשחק תפקיד חשוב ההפעלה של ביטוי גנים HVA1 על ידי ABA, דרך הפקטור שעתוק TaABF1.

ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן להציג לבנות גן בכל מבחן לתוך התאים aleurone של גרגרי שעורה. רמת הביטוי של הגן הבדיקה ואז הוא יהיה נוח נמדד (איור 2). פרוטוקול תפוקה גבוהה יותר המתוארים כאן מאוד מגדיל את היעילות של זרע שחיקה, אנזים assay צעדים. בשיטה זו נעשה שימוש כדי להעריך את היכולת של5,6 TaABF1 פקטור שעתוק כדי להפעיל את ביטוי הגן ABA-induced HVA17. בתוצאות נציג המובאת...

פרוטוקול משופרת מוצג עבור המידה של ביטוי גנים ארעי מן הכתב בונה בתאים aleurone שעורה לאחר הפגזה של חלקיקים. השילוב של תבואה אוטומטיות שיוף עם צלחת 96-ובכן אנזים מבחני מספק תפוקה גבוהה עבור ההליך.

מדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד ביטוי גנים ממבני מדווח לאחר הכנסתם לתאי אלורון שעורה על ידי הפצצת חלקיקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביטוי גנים המווסתים על ידי הורמונים צמחיים, כגון כיצד מולקולות איתות ספציפיות פועלות כדי לווסת חומצה אבציזית לגנים המושרים על ידי שעורה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תפוקה גבוהה יותר משיטות קודמות, ומאפשרת לבדוק מספר רב של מבני גנים ותנאי דגירה.מי שתדגים את הפרוטוקול תהיה גרייס, סטודנטית במעבדה שלי. ראשית, הניחו כמה גרגירים חסרי עוברים במכסה של צלחת פטרי מפלסטיק בגודל 90 מילימטר המכילה 20 מיליליטר תמיסת שתייה ו -20 מיקרוליטר כלורמפניקול. בעזרת מלקחיים סטריליים הסר בעדינות את מעיל הזרעים השקוף מכל גרגר.קילוף שכבות הזרעים מגרגר השעורה הוא שלב קריטי. אם שכבות הזרעים לא יוסרו במלואן, המיקרו-נשאים של הזהב ימנעו מלהיכנס לתאי האלורון. אך אם הקילוף נעשה בצורה גסה מדי, תאי האלורון עלולים להיפגע.לאחר קילוף מעיל הזרעים מכל הגרגירים, העבירו אותם מצלחת הפטרי לצלחת ורמיקוליט. לאחר מכן, הניחו את הגרגירים הקלופים ללא עוברים בחממה בחום של 24 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות. כעת, סמנו שפופרת של נקודה וחמישה מיליליטר מכל טיפול שתיכלל בניסוי ההפצצה.לכל צינור, הוסף שניים נקודה חמישה מיקרוגרם של פלסמיד בקרה פנימית UBI luciferase, שני נקודה חמישה

measuring-gene-expression-bombarded-barley-aleurone-layers-with

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Microarrays ג'ין הם כלים רבי עוצמה באפיון ביטוי גנים ברמת הגנום כולו. טכנולוגיה זו יישומים במגוון רחב של תחומים לרבות ביולוגי ביולוגיה התפתחותית הרעלים. בסרטון הזה, אנחנו פרט פרוטוקול ניתוח ביטוי גנטי גלובלי באמצעות פלטפורמה מקיפה microarray oligonucleotide על דג הזברה.

Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

אנו מדווחים על שיטה הקדמה, מעקב וניתוח כמותי של ה-GFP ביטוי בתאי הצמח. שיטה זו משתמשת מערכת אישית מעוצבת רובוטיקה לאיסוף חצי תמונה רציפה של מספר גדול של דגימות, לאורך זמן. אנחנו גם מדגימים את השימוש ImageJ ו ImageReady ניתוח של סדרת תמונות.

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

הסחר בין Macromolecular בתאי צמח ניתן להעריך על ידי transiently לבטא חלבון fluorescently-tagged עניין וניתוח ההפצה התוך ואת אינטר שלה על ידי מיקרוסקופיה confocal.

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

פיתחנו פרוטוקול מהיר, רגיש וניתן לשחזור לפרופיל ביטוי גנים פתוגני במהלך זיהום.

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

מוצגת שיטה ליצירת פרופיל של דגני בוקר. ביטוי גנטי מבוססי מיקרוarray הפרופיל מתחיל עם בידוד של RNA הכולל באיכות גבוהה מדגנים דגנים וממשיך עם הדור של cDNA. לאחר היברידינה של cRNA והכלאה מיקרוarray, ההמלצות ניתנות לזיהוי אותות ולבקרת איכות.

קבלת נתונים באיכות גבוהה טראנסקריפט מזרעי דגנים על ידי שיטה שהשתנתה ליצירת פרופיל ביטוי גנים

מוצג כאן פרוטוקול עבור microdissection לכידת לייזר (LCM) של רקמות צמח. LCM היא טכניקה מיקרוסקופית לבידוד אזורים של רקמות באופן ללא זיהום. ההליך כולל קיבעון רקמות, הטמת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA. RNA משמש במורד הזרם ספציפי רקמה, ניתוח נפתר זמנית של transcriptomes.

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

למדו פרוטוקול משופר למדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone של שעורה באמצעות פגיעת חלקיקים. השיטה משלבת טחינה אוטומטית וניתוח אנזימטי בלוחות 96-באר כדי להגביר את התפוקה ולחקור תגובות הורמונליות בצמחים.

מדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת

גלה סרטונים נוספים