מדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד ביטוי גנים ממבני מדווח לאחר הכנסתם לתאי אלורון שעורה על ידי הפצצת חלקיקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביטוי גנים המווסתים על ידי הורמונים צמחיים, כגון כיצד מולקולות איתות ספציפיות פועלות כדי לווסת חומצה אבציזית לגנים המושרים על ידי שעורה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תפוקה גבוהה יותר משיטות קודמות, ומאפשרת לבדוק מספר רב של מבני גנים ותנאי דגירה.

מי שתדגים את הפרוטוקול תהיה גרייס, סטודנטית במעבדה שלי. ראשית, הניחו כמה גרגירים חסרי עוברים במכסה של צלחת פטרי מפלסטיק בגודל 90 מילימטר המכילה 20 מיליליטר תמיסת שתייה ו -20 מיקרוליטר כלורמפניקול. בעזרת מלקחיים סטריליים הסר בעדינות את מעיל הזרעים השקוף מכל גרגר.

קילוף שכבות הזרעים מגרגר השעורה הוא שלב קריטי. אם שכבות הזרעים לא יוסרו במלואן, המיקרו-נשאים של הזהב ימנעו מלהיכנס לתאי האלורון. אך אם הקילוף נעשה בצורה גסה מדי, תאי האלורון עלולים להיפגע.

לאחר קילוף מעיל הזרעים מכל הגרגירים, העבירו אותם מצלחת הפטרי לצלחת ורמיקוליט. לאחר מכן, הניחו את הגרגירים הקלופים ללא עוברים בחממה בחום של 24 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות. כעת, סמנו שפופרת של נקודה וחמישה מיליליטר מכל טיפול שתיכלל בניסוי ההפצצה.

לכל צינור, הוסף שניים נקודה חמישה מיקרוגרם של פלסמיד בקרה פנימית UBI luciferase, שני נקודה חמישה מיקרוגרם של פלסמיד מדווח GUS ואת הכמות הרצויה של פלסמיד אפקטור. הוסף מים טהורים במיוחד לכל צינור כדי להביא את הנפח הכולל לחמישה מיקרוליטר. לכל טיפול, הוסף 50 מיקרוליטר של מיקרו-נשאים תלויים ב-50% גליצרול לכל צינור של נקודה חמישה מיליליטר המכיל DNA פלסמיד.

בשלב האחרון של הליך קידוד המיקרו-נושאים, פיפטה שמונה מיקרוליטרים של מיקרו-נשאים תלויים על כל אחד מחמשת המקרו-נשאים ואפשרו להם להתייבש באוויר. הגדר את מנגנון הפצצת החלקיקים על ידי הפעלת משאבת הוואקום, פתיחת שסתום ההליום ולאחר מכן הפעלת מערכת אספקת החלקיקים. הנח דיסק קרע של 1550 psi לתוך מכסה השמירה והתקן אותו על מערכת אספקת החלקיקים.

הנח נושא מאקרו המכיל את שילוב הפלסמיד הרצוי עם מסך עצירה במכלול השיגור של המיקרו-מוביל. הכנס את המכלול לחריץ העליון של תא ההפצצה. לאחר מכן, מסדרים שמונה גרגרים ללא עוברים בתבנית רדיאלית הדוקה כאשר הקצוות הדקים יותר פונים פנימה על עיגול נייר פילטר המודבק שטוח למכסה של צלחת פטרי של 90 מיליליטר.

מניחים את המנה עם הגרגירים בתא ההפצצה במרחק של שישה סנטימטרים ממסך העצירה. סגור את הדלת ולחץ על מתג הוואקום כדי לפנות את תא ההפצצה ל-95 קילופסקל. סובב במהירות את מתג הוואקום למצב החזקה.

לאחר מכן החזק את מתג האש לחוץ כדי להפציץ את הדגימה. לאחר שחרור הוואקום, העבירו את הגרגירים המופגזים לצלחת פטרי מסומנת בגודל 60 מילימטר המכילה ארבעה מיליליטר של תמיסת שתייה עם מיליגרם אחד למיליליטר כלורמפניקול. חזור על הפעולה עד להשלמת כל ההפצצות.

לאחר מכן, דגרו את הגרגירים המופגזים על משטח טלטול ב-100 סל"ד ב-24 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. בעזרת מלקחיים מוציאים את שמונת הגרגירים המופגזים מצלחת הפטרי בגודל 60 מילימטר ומייבשים אותם על מגבת נייר. מחלקים את הגרגירים לשני צינורות שני מיליליטר מסומנים, כל אחד מכיל 800 מיקרוליטר של חיץ טחינה וחרוז נירוסטה של חמישה מילימטרים.

לאחר חזרה על השלב הקודם עבור כל הדגנים המופגזים, הניחו עד 48 צינורות שני מיליליטר לשני מתלים של הומוגנייזר חרוזים. לאחר מכן הרכיבו את המדפים על ההומוגנייזר ונערו את הדגימות ב -30 הרץ למשך שלוש דקות. בסיום, הוציאו את המדפים מההומוגנייזר והניחו אותם על קרח למשך חמש דקות כדי לקרר מחדש את הדגימות.

כעת, הרכיבו את המתלים על ההומוגנייזר בכיוון ההפוך. לנער שוב את הדגימות ב -30 הרץ למשך שלוש דקות. לאחר הוצאת המדפים מההומוגנייזר, הניחו אותם על קרח למשך חמש דקות כדי לקרר מחדש את הדגימות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את תמציות התבואה ב -16, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מיד לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנטים השקופים לסט שני של צינורות מיקרו-צנטריפוגה. מערבלים בקצרה כל צינור ומאחסנים על קרח.

לאחר העברת הסופרנטנט שחזר את חרוזי הנירוסטה מהכדורים כך שניתן יהיה לכבס אותם ולעשות בהם שימוש חוזר. כעת הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר בדיקת GUS לכל באר של צלחת של 96 בארות. מניחים 50 מיקרוליטר מכל תמצית דגנים באחת הבארות ומערבבים עם קצה הפיפטה.

לאחר מכן, אטמו את החלק העליון של הצלחת בסרט איטום. מניחים את צלחת 96 הבארות בחממה בחושך בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את צלחת 96 הבארות ב-4,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

בסיום, הניחו את הצלחת על קרח. כעת, הוסף 250 מיקרוליטר של נקודת אפס שתי טוחנת של נתרן פחמתי לכל באר של צלחת שחורה של 96 בארות. הוסף שש נקודות שתיים חמישה מיקרוליטר מכל תערובת בדיקת GUS צנטריפוגה לכל באר של הצלחת השחורה וערבב עם קצה הפיפטה.

כלול בארות עם שש נקודות שתיים חמישה מיקרוליטר של 10-40 ב 100 מיקרומולר, ארבעה מתילומבליפרון כסטנדרט. הנח את הצלחת השחורה לתוך פלואורומטר צלחת. קרא את הקרינה של methylumbelliferone הקובעת את הרווח של המכשיר, כך שבאר המכילה שש נקודות שתיים חמישה מיקרוליטר של 40 מיקרומולר, ארבע מתילומבליפרון ו-250 מיקרוליטר של נתרן פחמתי מולרי אפס נקודה שתיים נותנת קריאה של 100 יחידות פלואורסצנטיות.

בניסוי זה, מבנה מדווח HVA1 GUS הוכנס לתאי אלורון יחד עם מבנה אפקטור UBI TaABF1. בעוד שיחס TaABF1 HVA1 של אפס נקודה אפס אחד בלבד הספיק כדי לגרום לאינדוקציה משולשת של הגן המדווח HVA1 בהיעדר אקסוגניס, חומצה אבסיסית או ABA. רמות גבוהות יותר של מבנה TaABF1 הביאו לביטוי HVA1 גדול יותר בהדרגה באופן תלוי מינון.

גם exogenis ABA וגם TaABF1 יכולים לגרום לביטוי חזק של מבנה מדווח HVA1 GUS. בכל מקרה, נוכחותו של בוטנול אחד עיכבה מאוד את השראת HVA1, מה שמצביע על כך שפוספוליפאז D יכול למלא תפקיד חשוב בהפעלת ביטוי הגן HVA1 על ידי ABA באמצעות TaABF1. הוכח כי ABA מעכב מאוד ביטוי המושרה על ידי ג'יברלין עבור מבנה המדווח של AMY32b GUS.

בעוד שלא מי חמצן ולא נתרן ניטרופרוסיד גרמו להפחתה משמעותית. תוצאות אלה, אם כן, אינן תומכות בתפקיד של תחמוצת החנקן ומי חמצן בתגובות ABA של תאי אלורון. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לאפשר למדוד דגימות רבות ושונות לביטוי גנים בזמן קצר יחסית.

לדוגמה, הפצצה של 200 דגימות תבואה שונות יכולה להיעשות על ידי שני חוקרים תוך כמה שעות. לאחר מכן, למחרת, חוקר יחיד יכול להכין את כל תמציות החלבון תוך שעתיים. בדיקת ה-GUS המותאמת המתבצעת בצלחות של 96 בארות דורשת גם הרבה פחות עבודה מאשר פרוטוקולים אחרים המשמשים במבחני הצינור העתידיים.